小反刍兽疫病毒核蛋白单克隆抗体的制备与初步应用

针对小反刍兽疫病毒核蛋白制备特异性的单克隆抗体,并对其进行生物学特性鉴定和初步应用。以纯化的Bacmid-PPRV-N重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的致敏脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG作用下融合,获得单克隆抗体,并通过染色体技术等方法研究其生物学特性,将其作为竞争单抗,Bacmid-PPRV-N重组蛋白作为检测抗原建立竞争ELISA检测方法。结果表明:经克隆和间接ELISA筛选,获得了2株能稳定分泌抗小反刍兽疫病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5B11和3H10-3B8。生物学特性鉴定试验表明:5B11和3H10-3B8抗体类型和亚类均为IgG2b;5B11单抗腹水的效价达1∶819 200,3H10-3B8达1∶12 800;血清学试验证明2株单抗均能与Bacmid-PPRV-N重组蛋白抗原结合,具有高度的特异性;相加ELISA试验结果显示,5B11和3H10-3B8 2株单克隆抗体分别识别N蛋白上不同的抗原位点;2株杂交瘤细胞的染色体均为99～104。应用建立的c-ELISA检测方法对222份血清样品进行PPRV抗体的检测,与参考试剂盒比较得到98.20%的符合率。本研究获得了2株能稳定分泌抗PPRV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以单抗5B11作为竞争抗体建立了PPRV的c-ELISA检测方法。     

小反刍兽疫病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用

本研究利用原核表达的小反刍兽疫病毒核衣壳（N）蛋白作为标准抗原蛋白,建立PPRV抗体检测方法,同时对建立的检测方法的相关条件进行了优化。通过优化确定抗原的最佳包被浓度为10 mg/L,血清最佳稀释度为1∶40,二抗的使用浓度为1∶200,血清及二抗的最佳反应条件为37 ℃孵育60 min,底物的最佳反应时间为37 ℃ 15 min。通过批内及批间重复性的评价,变异系数均小于0.1,表明本检测方法具有较高的可重复性。经过临床样品检测证明,建立的检测方法可用于临床PPRV抗体的检测。     

小反刍兽疫分子生物学研究进展

小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病。山羊高度易感;牛、猪等动物也可以感染带毒,野生动物偶有发生。作者主要介绍了小反刍兽疫病毒各基因结构特点,6种结构蛋白的功能,以及小反刍兽疫的诊断技术等方面的最新研究进展。     

小反刍兽疫病毒竞争ELISA检测试剂盒生产工艺研究

为研究小反刍兽疫病毒（PPRV）竞争ELISA试剂盒的生产工艺,本试验利用昆虫细胞表达的PPRV核蛋白及其单克隆抗体,建立一种特异性高、敏感性强的PPRV竞争ELISA检测方法,并对该方法的各个步骤进行优化,确定该方法的最适条件,从而确定竞争ELISA的操作程序。并用该方法与OIE推荐的PPRV rC-ELISA抗体检测试剂盒同时检测来自西藏、内蒙古共977份临床羊、牛血清样本,结果显示特异性、敏感性、符合率分别达99.89%、93.82%、99.38%。本研究建立的PPRV竞争ELISA方法为该病毒检测试剂盒的研制奠定技术基础,为小反刍兽疫的防控提供科学依据。     

一步法实时定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立

建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反刍兽疫病毒RNA样本进行检测,都获得了特异性扩增,但是,不与牛瘟病毒、海豚麻疹病毒等其他种的麻疹病毒属病毒发生交叉反应。本方法具有高度灵敏性,最低可检测到810拷贝的RNA模板。在模板浓度为8.1×102到8.1×108拷贝范围内,都呈现良好的线性关系,而且无论是组内和或组间重复的变异系数都很低。     

小反刍兽疫疫苗研究进展

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的一种严重的烈性、接触性重大跨国动物疫病.目前,该病在我国已经发生,给我国畜牧业经济造成了巨大损失.同多数病毒性疾病的防制相同,对小反刍兽疫PPRS的防制仍以疫苗免疫预防为主.文章对小反刍兽疫的各类疫苗进行综述,以期为疫苗的合理应用提供技术帮助.     

基于H蛋白表位合成肽的小反刍兽疫病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究旨在建立针对小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)H蛋白抗体的iELISA检测方法.以筛选的H蛋白B细胞表位为基础,选择反应原性较好的4个抗原表位肽串联后合成作为包被抗原,优化各步反应条件及筛选各种缓冲液,并确定检测临界值.经优化后,多表位抗原肽的最佳包被量为...     

小反刍兽疫病毒N蛋白原核表达与间接ELISA检测方法的建立

小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白是病毒粒子的主要结构蛋白,也是诊断小反刍兽疫的主要靶蛋白。为获得高效表达的可溶性N蛋白,并建立基于N蛋白的小反刍兽疫的间接ELISA检测方法,通过优化密码子、优化表达条件等条件探索,在大肠埃希菌表达系统中获得了高效表达的可溶性N蛋白,进一步基于N蛋白建立了间接ELISA检测方法,该方法对其他相关的羊类病原无交叉反应,其组内与组间变异系数均低于9%,具有良好的重复性。对480份临床血清样品进行检测,同时用法国IDVET竞争ELISA试剂盒进行比较,符合率达到98.33%。本研究为进一步开发成熟的小反刍兽疫抗体检测试剂盒奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒RT-LAMP检测方法的建立

利用逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)建立了小反刍兽疫病毒快速检测方法,同时评价了该方法的灵敏性和特异性。结果表明,根据小反刍兽疫病毒N基因保守区域设计的LAMP引物能够在63℃恒温下,1小时内实现目的核酸的大量扩增,由于在检测前加入荧光指示试剂,检测结果可以直接用肉眼判断,避免了由于开盖检验带来的扩增产物污染导致的假阳性。该检测体系具有较高的特异性,只能特异性地检测目的病毒,与其他同属的病毒或类似病毒等无交叉反应;具有较高的检测灵敏度,比普通RT-PCR灵敏性高10倍,与荧光RT-PCR的灵敏度相当。     

小反刍兽疫诊断及其免疫防制的研究进展

小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)是由副黏病毒科麻疹病毒属小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病,目前已给中国养羊业造成巨大损失与威胁。作者对PPR的流行病学、诊断方法及疫苗研制进展等方面作一简要综述,以期为该病的防控提供有效的参考。     

澳大利亚与我国小反刍兽疫应急预案的比较

我国于2007年首次暴发小反刍兽疫,随后疫情很快得到控制,但在2013年11月该病再次传入我国并造成多地暴发疫情。为了解国内外相关的防控应急策略,将我国2007年颁布的《小反刍兽疫防控应急预案》与澳大利亚2009年颁布的《小反刍兽疫应急预案》（第三版）进行比较,以期为我国小反刍兽疫的防控提供参考。     

应用间接ELISA检测鸡传染性鼻气管炎病毒抗体

采用增殖的鸡传染性鼻气管炎病毒（ARTV）NL7784株，经PEG－20000浓缩液提纯抗原和纯化羊抗鸡IgG抗体，建立了检测ARTV抗体的间接酶联免疫吸附试验。该试验的最佳反应条件为：包被液为pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液，抗原最佳稀释度为1：160，以含6％犊牛血清（CS）的磷酸盐缓冲液作为封闭液，稀释液用含10％CS、0.5% Tween-20的磷酸盐缓冲液，抗原与血清结合的最佳反应时间为30min；酶标抗体的最佳稀释倍数为1：1000，酶联反应的最佳时间为30min，底物的最佳反应时间为15min。本方法具有良好的特异性、稳定性、可重复性和较高的敏感性。     

辽宁省一起输入性小反刍兽疫紧急流行病学调查

2014年3月9-17日,辽宁省北镇市和黑山县的两个养羊户发生小反刍兽疫,为了解疫情来源并评估疫点向外传播疫病的风险,开展本次调查。调查发现本次发病局限于2户羊群中,在总共67只羊中检出24只PPR疑似病例,其中11只死亡。经临床和实验室诊断,该起疫情被确定为输入性小反刍兽疫;来源追踪分析显示发病羊来自S省某活羊交易市场;扩散风险评估结果表明,该起疫情向周围羊场扩散的风险较低。     

小反刍兽疫研究进展

小反刍兽疫病毒(PPRV)是副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbolivirus)的成员,主要感染山羊、绵羊等小反刍动物,引起一种高度接触性病毒性传染病。小反刍兽疫为一种重大的外来性疾病,2007年在中国西藏自治区日土县首次发生。自2013年末以来中国新疆、青海、甘肃、宁夏、内蒙、湖南、辽宁等地频繁暴发小反兽疫疫情,给中国的畜牧业带来了巨大的损失,引起极大的重视。为更好的分析小反刍兽疫的病原特性及采取有效的防控措施,文章对小反刍兽疫的病原学及疫苗研究进展进行论述。     

小反刍兽疫的流行、诊断与防控

小反刍兽疫是一种传染性极强的病毒性疾病,主要影响家养以及野生的小反刍动物。该病的主要特征是发热、口腔炎、结膜炎、肠胃炎和肺炎。小反刍兽疫也是世界动物卫生组织（0IE）规定必须上报的法定疾病之一。文章对该病的流行、传播方式、诊断方法以及防控措施进行了综述。     

小反刍兽疫流行状况及分子诊断技术研究现状

小反刍兽疫(PPR)是一种主要感染山羊和绵羊的传染病,病原为副黏病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(PPRV).PPRV基因组由6个基因组成,依据N和F基因可将PPRV分为4个谱系或者基因群,我国流行的PPRV属于谱系Ⅳ.2007年我国首次报道发生PPR疫情,在2014年大流行后,农业农村部加强了 PPR的防疫措施.目前...     

体外转录法制备小反刍兽疫病毒荧光定量RT-PCR检测标准阳性模板

针对小反刍兽疫病毒的F基因设计了一对荧光定量RT-PCR的引物和探针,在正向引物的5′端加上T7启动子后与反向引物扩增小反刍兽疫病毒株Nigeria 75/1细胞培养液RNA,切胶回收目的条带作为体外转录模板,体外转录后测RNA浓度以及OD值。线性试验和特异性试验结果表明,该模板具有良好的线性范围和特异性,当稀释度为4.9×108~4.9×103拷贝/μL时,相关系数为0.999。该模板稳定性好,-80℃保存一个月后无显著变化。对起始浓度为4.9×106、4.9×105、4.9×104拷贝/μl的标准品分别检测10次,变异系数分别为1.09%,1.47%,1.34%,表明以此模板进行荧光定量PCR具有较好的重复性。     

Expression and Identification of F Protein of Peste Des Petits Ruminants Virus Strain Tibet 07 in Insect Cells

In order to obtain purified peste des petits ruminants virus F protein, the F gene of peste des petits ruminants virus strain Tibet 07 was cloned into transfer vector pFastBac/CT-TOPO, plasmid pFastBacCT-PPRV-F was then transformed into DH10Bac complement cells. The recombinant bacmid DNA was isolated and transfected into sf9 insect cells to express F protein. The expressed F protein was identified by using SDS-PAGE, Western blotting and indirect immunofluorescence assay. The recombinant F protein was successfully expressed in insect cells with a relative molecular of 59 ku.The sf9 cells infected by Bacmid-PPRV-F can reacted with positive serum of peste des petits ruminants.Using the Bac-to-Bac baculovirus expression system expressed the F protein of peste des petits ruminants virus strain Tibet 07.This work provides basis for development of rapid test for detection of peste des petits ruminants antibody.     

小反刍兽疫病毒及山羊痘病毒N-ITR基因二联实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

Peste des petits ruminants virus (PPRV) and goat pox virus (GTPV) are the causative agents of two kinds of goats’ diseases-peste des petits ruminants and goat pox which can cause disaster economic losses. In order to detect the two viruses simultaneously and quickly, two sets of primers and relative probes were designed based on the nucleoprotein (N) gene of PPRV and the inverted terminal repeat (ITR) segment of GTPV， respectively. In order to work together in the same reaction, the probes were labeled with different fluorescent materials 5′FAM-TAMRA3′and 5′JOE-Eclipse3′，respectively. Results showed that the duplex Real-time RT-PCR assay was identified to be specific for PPRV and GTPV only and specific fluorescent signal could be detected, but the related viruses including fowl pox virus（FPV）and canine distemper virus (CDV) had no specific fluorescent signal. Positive recombinant plasmids (PPRV pMD18-T-N and GTPV pMD18-T-ITR) were built and used for positive quantitative templates to establish duplex standard curves. The developed assay based on the probe N-ITR was found to be highly specific and sensitive with a detection limit of 10² copies/μL cDNA and 10³ copies/μL DNA for PPRV and GTPV， respectively. Finally, the duplex Real-time RT-PCR assay for simultaneous detection of PPRV and GTPV was established preliminarily in the study.