牛骨骼肌酵母双杂交cDNA文库构建

为构建应用于酵母双杂交系统的牛骨骼肌cDNA文库,利用Trizol法提取牛骨骼肌总RNA,采用SMART技术PCR扩增合成cDNA第二链片段,并与文库线性载体pGADT7-Rec共转化酵母菌Y187构建酵母双杂交文库。结果显示文库容量达到1．7×10^7cfu／mL,插入片段主要在0．5～3kb范围内,文库重组率为80％。以上结果表明该文库质量好,能够通过筛选文库得到与目的蛋白相互作用的蛋白质。     

柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的构建

为了筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵相关的蛋白,利用酵母双杂交体系构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库。提取纯化的子孢子总RNA,经MMLV-RT反转录合成cDNA第一链后,利用LD-PCR扩增合成双链cDNA(ds cDNA),dscDNA经纯化柱CHROMA SPINT+TE-400 Columns纯化剔除小于200 bp的片段。将纯化后dscDNA、pGADT7-Rec及Carrier DNA共转化到已经制备好的酵母感受态细胞Y187中,dscDNA与pGADT7-Rec以同源重组的方式在细胞内进行连接,经过缺陷性培养基(SD/-Leu)的筛选得到酵母双杂交cDNA文库。结果显示,构建的柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的转化率为4.33×105/μg pGADT7-Rec,文库滴度为3.62×107 cfu/m L。随机挑取32个单克隆进行PCR检测,插入片段大小为200~2000bp,重组率为93.75%,并以该文库作为模板,用柔嫩艾美耳球虫5对特异性引物进行PCR扩增,获得了这5个基因片段。结果表明成功构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库,为进一步筛选和研究球虫入侵互作蛋白奠定了基础。     

绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

试验旨在构建绵羊卵巢组织细胞的cDNA文库,为进一步研究绵羊卵巢中蛋白互作机制提供工具。本研究以不同发情周期的绵羊卵巢组织为材料,利用TRIzol试剂提取绵羊卵巢组织细胞总RNA,应用SMART技术经过长链PCR(LD-PCR)合成双链cDNA(ds cDNA),通过CHROMA SPIN~(TM)+TE-400柱纯化得到ds cDNA,并与线性pGADT7-Rec共转化酵母Y187感受态细胞。用同源重组的方式,在酵母细胞内构建绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA表达文库。结果构建了含有3×10~8个重组子的绵羊卵巢组织cDNA文库,插入片段长度多数为500～2 000 bp,重组率达96%,重组子中平均插入的片段长度为1 000 bp,文库滴度为2×10~7cfu/mL,符合建库标准。     

利用SMART技术构建猪血管内皮细胞酵母双杂交cDNA文库

本研究旨在建立猪血管内皮细胞酵母双杂交cDNA文库,进而为研究猪瘟病毒的基因功能及致病机理提供良好的试验体系。体外培养猪血管内皮细胞,提取细胞总RNA,并用Oligotex mRNA Mini Kit纯化PolyA+mRNA,利用SMART技术合成双链cDNA(ds cDNA)。经CHROMA SPINTM TE-400Column纯化后的dsDNA与线性化的pGADT7-Rec共转化酵母感受态细胞Y187中,以同源重组的方式在酵母细胞内构建猪血管内皮细胞cDNA文库。结果获得的文库容量在6×106 CFU/mL,随机挑选24个克隆进行PCR检测,插入的片段大小集中在400² 000bp之间,平均插入长度为1 000bp左右,文库重组率为100%。本研究为从文库中高通量地筛选出与猪瘟病毒互作的重组子,即寻找与该病毒相互作用的受体蛋白奠定了坚实的基础。     

牛源犬新孢子虫酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

旨在构建酵母双杂交牛源犬新孢子虫cDNA表达文库,进而为研究新孢子虫功能结构以及为其入侵宿主致病机理研究提供良好的试验体系。体外培养牛源犬新孢子虫延边株,纯化并提取虫体总RNA,应用SMART技术合成双链cDNA(ds cDNA)。利用CHROMA SPINT+TE-400Columns纯化柱纯化ds cDNA,并与线性化的p GADT7-Rec共转化酵母菌菌株Y187,以同源重组的方式在酵母细胞内构建牛源犬新孢子虫酵母双杂交cDNA表达文库。结果显示,文库容量为5.78×108cfu/m L,随机挑取23个单克隆进行菌落PCR检测,插入的双链c DNA片段大小为400~4 000 bp,平均长度在2 000 bp左右,文库重组率为100%,此文库可用于酵母双杂交筛选。试验为筛选新孢子虫与宿主之间相互作用蛋白研究奠定了基础。     

金堂黑山羊卵巢酵母双杂交cDNA文库的构建和鉴定

以四川省金堂黑山羊卵巢为材料,从其卵巢组织中提取总RNA,应用SMARTTM cDNA library construction技术,构建以真核表达栽体pGAT17-Rec为基础的黑山羊卵巢酵母双杂交cDNA文库.结果表明,提取的RNA的A260/A280为1.95,28S与18s带浓度及亮度比值约为2.文库ds cDNA弥散较长,分布在0.2～3 kb,成瀑布条带状,而且在接近1 kh的区域有密集的条带,为高丰度表达基因.根据生长菌落计数,共获得1.6×106个转化子,文库插入片段大小约为0.1～2 kb.成功构建了金堂黑山羊卵巢酵母双杂交cDNA文库,为黑山羊多胎相关因子的基因筛选奠定了基础.     

利用酵母双杂交系统筛选TRADD的互作牛分枝杆菌蛋白

为研究牛分枝杆菌抑制肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡来逃避宿主免疫反应的机制,本试验采用酵母双杂交系统在牛分枝杆菌中筛选可与肿瘤坏死因子受体1相关死亡域蛋白（TRADD）相互作用的蛋白。通过限制性内切酶Sau3AⅠ部分消化牛分枝杆菌基因组,回收片段随机插入pGADT7载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建牛分枝杆菌基因组文库。PCR扩增人tradd基因,将扩增产物克隆于pGBKT7载体上,构建重组诱饵质粒pGBKT7-tradd,转化酵母菌Y2HGold。用诱饵质粒pGBKT7-tradd对牛分枝杆菌基因组文库进行筛选,以获得与TRADD互作的阳性候选克隆;提取阳性候选克隆中的质粒,经测序和同源性比对分析,获得与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白的生物学信息。结果显示,构建的文库滴度为2×10⁶ CFU,平均插入片段在1.5 kb左右,文库重组率>95%。经Western blotting验证,诱饵质粒pGBKT7-tradd可在酵母菌中表达诱饵蛋白TRADD,且TRADD的表达对酵母菌无毒性,不会在酵母菌中自激活。应用酵母双杂交系统初步筛选出20个与TRADD互作的阳性克隆,经复筛、测序和BLAST对比,最终发现7个基因序列。本研究应用酵母双杂交技术成功筛选到7个与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白,为进一步研究牛分枝杆菌对细胞凋亡的抑制机制提供线索。     

利用酵母双杂交系统筛选TRADD的互作牛分枝杆菌蛋白

为研究牛分枝杆菌抑制肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡来逃避宿主免疫反应的机制,本试验采用酵母双杂交系统在牛分枝杆菌中筛选可与肿瘤坏死因子受体1相关死亡域蛋白(TRADD)相互作用的蛋白。通过限制性内切酶Sau3AⅠ部分消化牛分枝杆菌基因组,回收片段随机插入pGADT7载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建牛分枝杆菌基因组文库。PCR扩增人tradd基因,将扩增产物克隆于pGBKT7载体上,构建重组诱饵质粒pGBKT7-tradd,转化酵母菌Y2HGold。用诱饵质粒pGBKT7-tradd对牛分枝杆菌基因组文库进行筛选,以获得与TRADD互作的阳性候选克隆;提取阳性候选克隆中的质粒,经测序和同源性比对分析,获得与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白的生物学信息。结果显示,构建的文库滴度为2×10~6 CFU,平均插入片段在1.5kb左右,文库重组率95%。经Western blotting验证,诱饵质粒pGBKT7-tradd可在酵母菌中表达诱饵蛋白TRADD,且TRADD的表达对酵母菌无毒性,不会在酵母菌中自激活。应用酵母双杂交系统初步筛选出20个与TRADD互作的阳性克隆,经复筛、测序和BLAST对比,最终发现7个基因序列。本研究应用酵母双杂交技术成功筛选到7个与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白,为进一步研究牛分枝杆菌对细胞凋亡的抑制机制提供线索。     

猪肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)与猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)蛋白质间相互的作用,本研究使用SMART技术成功构建了猪肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库。首先提取PAM总RNA,使用SMART RACE法经LD PCR合成双链cDNA,运用SMART技术,通过同源重组的方法将双链cDNA与pGADT7-Rec质粒共转化进酵母Y187感受态,再利用营养缺陷的方法在SD/-Leu平板上筛选阳性克隆,最终构建的文库滴度达到了6.96×10~7 CFU/mL,重组率初步计算达到95%,插入片段范围在200~2 000bp。本研究为PRRSV致病蛋白的筛选以及相关疾病的研究奠定了基础。     

双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库的构建与鉴定

构建双峰驼天然重链抗体可变区(VHH)酵母双杂交文库,并对文库质量进行鉴定。采集未经免疫的6月龄雌性双峰驼外周血、骨髓、脾和淋巴结,并从外周血中分离淋巴细胞。抽提总RNA,反转录为cDNA,用2对引物经过2轮PCR扩增得到400bp左右的双峰驼VHH片段。根据Clontech公司MatePlateTMlibrary construction system使用手册,将带有同源臂的VHH片段与线性化的pGADT7-Rec质粒共转化Y187酵母感受态细胞,转化产物涂布SD/-Leu平板,30℃倒置培养3~5d后,收集平板上的所有克隆,即为双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库。对文库的滴度、重组效率及多样性进行鉴定。结果显示,本研究构建的双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库库容为2.07×107,滴度为7.6×108cfu·mL-1。随机挑取47个独立克隆进行菌落PCR鉴定,43个含有VHH片段,重组率为91.5%;选取其中19个测序,均为独立克隆,且多样性好。该研究成功构建双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库,且文库质量满足要求,为进一步获得特定抗原的VHH奠定了基础。     

鸭胚成纤维细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

为了解与坦布苏病毒(TMUV)E蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,本试验制备鸭胚成纤维细胞(DEF)。采用Trizol法提取细胞总RNA,通过LD-PCR技术合成双链cDNA,经CHROMA SPIN TE-400column纯化后,与pGADT7载体连接,利用同源重组的方法克隆到Y187酵母感受态细胞,构建了鸭胚成纤维细胞的cDNA文库。结果显示:构建的文库滴度为3×107 CFU/mL,文库插入的双链cDNA片段为0.5~2.5kb,平均约为1.5kb,符合酵母双杂交筛选的要求。     

酵母双杂交筛选与牛病毒性腹泻病毒NS4B互作的宿主蛋白

为探究NS4B蛋白在牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)感染和复制过程中的作用，利用酵母双杂交(yeast two hybrid, Y2H)技术筛选与BVDV NS4B蛋白互作的宿主细胞蛋白质。以构建的BVDV NS4B重组质粒pGBKT7-NS4B作为诱饵质粒，采用酵母双杂交技术，与牛肾细胞MDBK-cDNA文库进行杂交。将获得的阳性克隆菌落经质粒抽提、测序分析和免疫共沉淀试验，确定可与NS4B互作的宿主细胞蛋白。结果表明，成功构建了诱饵质粒pGBKT7-NS4B,该质粒可在酵母菌中表达NS4B蛋白。采用酵母双杂交技术从牛肾细胞基因组文库获得14个阳性克隆，阳性克隆经测序、互补试验、免疫共沉淀验证后明确可与BVDV NS4B蛋白互作的宿主蛋白为SYNGR2和RABACI。上述研究为进一步研究BVDV NS4B蛋白在BVDV感染和复制中的作用机制奠定了理论基础。     

酵母双杂交技术筛选朊蛋白PrP23-231互作蛋白

利用酵母双杂交技术,以pSos-PrP23-231载体为诱饵质粒,筛选小鼠脑cDNA文库中能与朊蛋白PrP23-231相互作用的蛋白。通过一次筛选,三次验证,从小鼠脑cDNA文库中得到2个阳性克隆,通过BLAST序列比对得到2个候选基因序列,并对验证后的阳性克隆的外源性片段进行测序及同源性分析,得到的蛋白编码基因可能与朊蛋白存在相互作用,其作用可能与疯牛病发病机制有关。     

弓形虫酵母双杂交cDNA文库构建及与Rop38相互作用蛋白的筛选

为筛选与弓形虫棒状体蛋白38基因(Rop38)相互作用的宿主细胞蛋白,本研究利用MatchmakerTM Gold酵母双杂交系统,构建了人成纤维细胞(HFF)和人T细胞(CEM.NKR)的c DNA文库,以构建的p GBKT7-Rop38作为诱饵质粒,采用PEG/Li Ac法转化酵母菌株Y2H,利用表型筛选法检测Rop38的自激活作用并进行酵母双杂交筛选。结果表明,诱饵蛋白在酵母双杂交系统中无毒性和自激活作用,而且通过酵母双杂交筛选共获得29个与Rop38蛋白相互作用的宿主蛋白,其中HFF文库筛选到20个蛋白,CEM.NKR文库筛选到11个蛋白。本实验为进一步研究Rop38调节宿主细胞基因表达的信号通路奠定了基础。     

酵母双杂交系统筛选猪流行性腹泻病毒N蛋白互作的宿主蛋白

为了获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白与宿主细胞中的互作蛋白,本研究构建PEDV N蛋白基因的重组载体p GBKT7-N,以其作为诱饵质粒,采用酵母双杂交方法,从猪肺泡巨噬细胞(PAM)cDNA文库中筛选出与N蛋白相互作用的蛋白。结果表明,诱饵蛋白在酵母双杂交系统中不存在毒性和自激活作用,而且筛选出6种与N蛋白互作的蛋白,分别为FTH1、LGALS3、CORO1C、SNRPG、KRTAP5-3和ZNF598。其中半乳糖凝集素3(LGALS3)和小核糖蛋白G(SNRPG)通过回返试验和免疫共沉淀试验证实其与PEDV的N蛋白存在特异性相互作用。本研究为进一步研究PEDVN蛋白的功能及病毒的致病机制奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4酵母双杂交诱饵质粒的构建与检测

为了筛选出柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶(Et CDPK4)在虫体内发挥作用时的作用受体即相互作用蛋白,构建了能够应用于筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交c DNA文库的诱饵重组质粒p GBKT7-Et CDPK4,本研究以柔嫩艾美耳球虫子孢子为材料,提取了总RNA,经反转录得到c DNA第一链,利用PCR的方法扩增获得了该基因大小为1660 bp的Et CDPK4的功能区片段,并将其连接于酵母BD诱饵p GBKT7载体上,经双酶切鉴定和序列分析,以及检测了p GBKT7-Et CDPK4在酵母双杂交系统中的自激活、细胞毒性和表达情况。结果显示,成功构建了酵母双杂交诱饵重组质粒p GBKT7-Et CDPK4,在酵母双杂交系统中没有自激活活性和细胞毒性,且在酵母细胞Y2HGold中能够进行表达。表明所构建的诱饵质粒p GBKT7-Et CDPK4可以应用于酵母双杂交系统中,用于筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交c DNA文库,获得可能与Et CDPK4具有相互作用的蛋白质。     

ST细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了筛选与猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）结构蛋白VP2相互作用的宿主蛋白,深入研究病毒入侵及致病的分子机制,本试验建立了ST细胞酵母双杂交cDNA文库。采用RNeasy Min Kit提取ST细胞的总RNA,反转录合成cDNA第一链之后,通过SMART技术合成了双链cDNA,并利用同源重组的方法,构建了ST细胞的酵母cDNA文库。结果显示,文库滴度为8.1×10⁸ CFU/mL,插入的双链cDNA片段大小为250~1 000 bp,平均大小约为500 bp,文库的重组率为96%。此文库可用于筛选与病毒相互作用的ST细胞宿主蛋白,为进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒σA基因酵母双杂交诱饵载体的构建与鉴定

为了筛选与禽呼孤病毒σA基因相互作用的宿主蛋白,本试验应用酵母双杂交技术构建禽呼孤病毒σA基因的诱饵载体pGBKT7-σA。从禽呼肠孤病毒S1133标准毒株抽提RNA,采用RT-PCR方法扩增得到σA基因片段,将其连接到诱饵载体pGBKT7上,把通过测序的重组诱饵载体命名为pGBKT7-σA。将重组诱饵载体转化酿酒酵母Y2HGold后,把不同浓度的诱饵载体转化液涂布在营养缺陷型培养基上,观察该重组诱饵载体在酵母细胞中有无毒性作用和自激活现象。结果显示,酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-σA构建成功,且对酿酒酵母无毒性和自激活现象。本研究为进一步利用酵母双杂交技术筛选与σA蛋白互作的宿主蛋白奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒σA基因酵母双杂交诱饵载体的构建与鉴定

为了筛选与禽呼孤病毒σA基因相互作用的宿主蛋白,本试验应用酵母双杂交技术构建禽呼孤病毒σA基因的诱饵载体pGBKT7-σA。从禽呼肠孤病毒S1133标准毒株抽提RNA,采用RT-PCR方法扩增得到σA基因片段,将其连接到诱饵载体pGBKT7上,把通过测序的重组诱饵载体命名为pGBKT7-σA。将重组诱饵载体转化酿酒酵母Y2HGold后,把不同浓度的诱饵载体转化液涂布在营养缺陷型培养基上,观察该重组诱饵载体在酵母细胞中有无毒性作用和自激活现象。结果显示,酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-σA构建成功,且对酿酒酵母无毒性和自激活现象。本研究为进一步利用酵母双杂交技术筛选与σA蛋白互作的宿主蛋白奠定了基础。