红褐色乌苏里貉和吉林白貉 KIT 基因第二外显子的克隆及多态性分析

选取野生型乌苏里貉、红褐色乌苏里貉和吉林白貉各3只为研究对象,利用克隆测序技术,得到长为276 bp的KIT基因第二外显子序列,分析其多态性及与其他物种的同源性。结果显示：红褐色乌苏里貉KIT基因第二外显子与犬、狐、家猫、虎鲸、野猪、马的同源性分别为97％,97％,92％,89％,87％,87％;对野生型乌苏里貉、红褐色乌苏里貉和吉林白貉KIT基因第二外显子序列进行对比分析发现,3种貉序列完全匹配,说明在此处未发生突变。     

半番鸭和北京鸭MC1R基因的克隆与序列分析

羽色是半番鸭一个重要的经济性状。黑素皮质素受体1 （melanocortin receptor 1,MC1R）基因是控制动物黑色素合成的重要基因。本研究根据鸡、鹌鹑、雪雁、孔雀等MC1R基因同源序列的保守区设计1对引物,以半番鸭、北京鸭总DNA 为模板,PCR扩增,克隆测序。结果,获得了2个长度为900bp 的基因片段, 并提交GenBank, 登录号分别为EU877265和EU877264。经比对,发现北京鸭与半番鸭核苷酸序列存在8个变异位点,其中位于184bp（T/A）、229bp（G/A）、364bp（A/G）、385bp（G/A）处的变异导致了氨基酸序列分别在第62位（C/S）、77位（E/K）、122位（T/A）和129位（V/I）发生突变。为进一步研究半番鸭羽色MC1R基因单核苷酸多态性（SNP）奠定了基础;通过BLAST进行相似性搜索,结果表明,鸭与黑雁MC1R基因的核苷酸序列同源性最高为98.4％,与其他家禽的同源性也保持在92.8％～98.2%之间。可见禽类的MC1R 基因编码区序列具有高度的保守性;系统进化分析表明,半番鸭、北京鸭与雪雁、黑雁、皇雁亲缘关系相近,从分子角度验证了它们在动物学分类上的地位。     

清远麻鸡CAPN1基因单核苷酸多态性研究

摘 要：清远麻鸡属于小型优质鸡种,为探讨其优良肉质形成的分子机理,本研究以隐性白羽鸡作为对照,以CAPN1基因作为影响鸡肌肉嫩度性状的候选基因,采用PCR-SSCP方法对清远麻鸡和隐性白羽鸡的CAPN1基因外显子4部分序列、内含子4和外显子5部分序列进行单核苷酸多态性分析,共检测到AA、AB、AC、BB、BC和CC 6种基因型。测序结果发现,AA型个体序列与Genbank上登录的序列一致;BB型个体在2418处存在5 bp的缺失突变,在2446处存在T/C突变,在2484处存在C/T突变,在2508处存在C/T突变;CC型个体在2418处存在5 bp的缺失突变,在2446处存在T/C突变,在2484处存在C/T突变。统计了不同基因型在不同品种鸡中的频率分布,结果表明基因型频率和基因频率在两个鸡种中的分布存在显著差异。     

乌骨鸡黑色素基因的克隆及真核表达载体的构建

采用RT-PCR方法从乌骨鸡皮肤中克隆出黑色素主效基因黑色素皮质激素受体(Melanocortin1-receptorMC1R)基因,长度为945bp,与普通白鸡比对其同源性为99.6%。以pEGFP-N1为基础,将从测序载体pMD-18T-MC1R上使用EcoR I和Sal I切下的MC1R连接到同样酶切的pEGFP-N1,构建pEGFP-N1-MC1R真核表达载体,为以后转基因动物的制备打下了基础。     

绵羊KAP1.1基因多态性与毛纤维直径的相关性分析

以768只中国美利奴羊(新疆军垦型)为材料,采用测序和PCR技术分析KAP1.1(B2A)基因单核苷酸多态性及其与羊毛纤维直径的相关性。结果表明:中国美利奴羊(新疆军垦型)KAP1.1基因存在30个碱基的插入/缺失和6种基因型,分别为(341 bp)AA基因型、(311 bp)BB基因型、(281 bp)CC基因型、(341 bp/311 bp)AB基因型、(341 bp/281 bp)AC基因型和(311 bp/281 bp)BC基因型。AA、BC、AC、AB和CC基因型间的毛卷曲度、细度离散、毛长、污毛重、净毛率和密度差异不显著(P>0.05),而BB基因型羊只的平均纤维直径显著小于AA、BC、AC、AB和CC基因型羊只的平均纤维直径(P<0.05)。以上结果表明,KAP1.1基因可作为绵羊毛纤维直径的主要候选基因之一,BB基因型可作为分子标记用于预测绵羊毛纤维直径。     

美洲南瓜WRKY4基因克隆与序列分析

以美洲南瓜(Cuc urbita pepo)幼叶为材料,采用Trizol方法进行总RNA的提取.根据GenBank上己提交的黄瓜WRKY4基因序列保守区域设计特异性引物,扩增得到1条长度为497 bp的WRKY4转录因子基因片段,利用已知中间序列,通过RT-PCR和RACE (rapid amplification cDNA ends)等技术,克隆得到美洲南瓜WRKY4的cDNA全长序列,长度为l 722 bp,5′非翻译区为185 bp,3′非翻译区为118 bp,开放阅读框为1 419 bp,编码472个氨基酸,分子量约为51.40 kD,等电点约为8.36,GenBank登录号为JX096811.用Blast和DNAMAN软件对其核苷酸序列进行分析,结果显示,美洲南瓜WRKY4与黄瓜WRKY4同源性达到87％.美洲南瓜WRKY4基因克隆及序列分析为以后研究此基因的功能奠定了基础.     

萝卜扩展蛋白基因RsEXPB1克隆与表达特征分析

本文根据GenBank中扩展蛋白序列设计特异引物,从萝卜高代自交系"NAU-LVYH06"中克隆到一个扩展蛋白基因RsEXPB1(GenBank accession No.GQ387363,GQ387364).其编码区基因组序列长度为1 430bp,包括4个外显子和3个内含子;RT-PCR获得长度为898 bp的cDNA,开放读码框(ORF)为29～820 bp,推导编码263个氨基酸,含有1个组氨酸(His-Phe-Asp,HrD)功能域,ORF和推导蛋白序列与拟南芥AtEXPB3(GenBank accession No.NM118965)同源性分别为87%、92%.半定量RT-PCR检测到该基因主要在萝卜生育前期的幼叶、肉质根木质部和韧皮部中表达,且表达丰度可能与该部位细胞生长分裂状态相关,差异较明显.     

无花果ACC合成酶基因克隆及序列分析

为进一步利用基因工程手段调控无花果乙烯的合成,以无花果果肉为材料提取基因组DNA,根据已报道的无花果ACC合成酶基因序列设计引物,采用PCR技术扩增得到一条约600 bp的特异片段,将该片段克隆到pGM-Teasy vector上经PCR、酶切和测序鉴定。序列分析结果表明,基因全长590 bp,编码196个氨基酸,该序列与GenBank上已登陆的Masui Dauphine-ACS1的cDNA序列同源性达99%,氨基酸同源性达98%。结果表明,成功克隆到了无花果ACS基因片段。     

辽宁绒山羊SRY基因编码区的分子特征研究

根据GenBank中山羊SRY基因序列设计一对引物,采用PCR在雄性辽宁绒山羊个体中扩增出了包含SRY基因整个编码区的特异片段,将特异PCR产物克隆到pMD18-T 载体中,转化DH5α菌,筛选出SRY基因的阳性克隆,进行了测序,将其序列与GenBank中部分偶蹄目动物的SRY基因序列进行同源性比较,用NJ法构建了系统进化树.结果表明,辽宁绒山羊SRY基因编码区长度为723 bp,共编码240个氨基酸,其中包含长度为231 bp 的HMG-box,位于编码区的第190至420位核苷酸之间,编码77个氨基酸(H64-A140).辽宁绒山羊SRY基因编码区序列与GenBank中山羊、绵羊、牛、牦牛、水牛、梅花鹿、麝香鹿及猪等偶蹄目动物的同源性分别为100%,97.09%,89.21%,89.21%,88.38%,87.55%,86.16%和68.04%;基于SRY基因编码区的核苷酸序列,构建的物种间系统树结果基本上与这些偶蹄目动物的传统系统分类相一致.     

草莓ABA结合蛋白基因的克隆及序列分析

为进一步研究ABA结合蛋白在草莓抗逆性方面的作用,本文通过CTAB法提取五叶草莓总DNA,根据NCBI数据库中的ABA结合蛋白受体的基因序列信息,设计特异引物,克隆得到4426 bp的ABA结合蛋白基因。序列分析表明该基因全长4662 bp,编码1393个氨基酸,核苷酸序列比对表明,该序列与GenBank中其他物种的CHLH序列有极高的同源性,核苷酸序列比较相似率在77%~90%,氨基酸相似性在63%~73%。     

万寿菊玉米黄质环氧化酶TeZEP基因片段的克隆及分析

为了研究万寿菊中玉米黄质生物合成途径的关键酶基因,首先根据不同物种的ZEP基因进行序列比对找到保守区域设计简并引物,然后利用RT-PCR方法,以万寿菊花瓣总RNA为模板克隆万寿菊ZEP基因cDNA的片段,并进行序列分析。结果表明,万寿菊ZEP基因片段长度为1 058 bp,编码352个氨基酸残基,其序列与其他植物ZEP基因同源性最大为92%;其翻译产物属于亲水性蛋白;且结构域预测结果发现TeZEP基因编码的氨基酸序列含有一个NADB_Rossmann超家族和玉米黄质环氧化酶的特征性结构黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合位点。本研究成功克隆了万寿菊玉米黄质环氧化酶TeZEP基因片段并对其进行了序列分析,这为进一步研究该基因功能提供了依据,也为构建转基因植物和沉默基因植株以提高玉米黄质合成量提供了一定的参考。     

猪SLA-DQA基因外显子4多态性分析

采用PCR-SSCP及克隆测序技术对大白、长白、杜洛克共210头仔猪SLA-DQA基因第4外显子进行多态性检测,以探讨猪SLA-DQA基因的遗传特性。结果显示:共获得4种等位基因(A、B、C、D),6种基因型(AA、AB、CC、CD、BB、BC)。6种基因型在杜洛克猪中都被检测到,而在大白猪中只检测到AA、AB、CC 3种基因型,在长白猪中未检测到BC基因型。A等位基因和AA基因型的频率在3个群体中最高,为优势基因和优势基因型。对不同SSCP带型的对应片段进行测序分析,共发现3个核苷酸突变位点(5 126 bp A→G,5 158 bp A→T,5 233 bp G→A),其中,5126 bp处A→G导致氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸。经χ2适合性检验,3个猪品种在此位点上都偏离了Hardy-Wein-berg平衡状态(P<0.05)。群体遗传学分析发现:长白猪、大白猪多态信息含量(PIC)分别为0.3233,0.4548,属于中度多态(0.250.5);各基因型在三品种中的分布差异显著。研究结果证实,猪SLA-DQA基因第4外显子具有丰富的遗传多态性。     

白菜型油菜DFR基因的克隆与序列分析

By using RACE (rapid amplification ofcDNA ends) based homologous cloning strategy, we have successfully isolated the genomic and full-length cDNA sequences of a gene encoding typical DFR (dihydroflavonol-4-reductase) from black-seeded Brassica campestris L. var. oleifera DC.. The gene, designated BcDFR here, is 1 722bp in length and harbors 5 introns with typical splice sites of plant DFR genes. BcDFR cDNA is 1311bp in length with a 1 158bp ORF as well as a 25bp 5‘ UTR and a 128bp 3‘ UTR. The encoded BcDFR protein is 385 aa with a calculated Mw of 42.85kD and a pI value of 5.55. The nucleotide and amino acid sequences of this gene share extensive homologies to plant DFR genes of wide origins especially high similarities to Cruciferous DFR genes. Sequence analyses such as phylogenetic analysis, conserved domain search and substrate specificity region detection all indicated that BcDFR gene is a quite potentially biofunctional gene. Its cloning enables us to further dissect the possible relatedness between DFR gene and Brassica seed coat color traits and to create transgenic novel yellow-seeded rapeseed germplasm through antisense- or RNAi-suppression of DFR gene expression in black-seeded elite cultivars.     

黄黑籽甘蓝型油菜类黄酮途径基因SNP位点检测分析

类黄酮物质在植物花、叶、果实和种子颜色变化的过程中起着至关重要的作用,本研究以不同黄黑籽种皮材料为研究对象,采用基因同源克隆方法,获得17个类黄酮基因全长ORF序列,在核酸和蛋白水平上分别序列差异比较表明,这些基因在不同黄黑籽材料中共存在41个不同拷贝成员。在核苷酸水平上,检测到BnTT3、BnTT18、BnTTG1和BnTTG2的单核苷酸位点数目介于16~52之间,且BnTTG2在3个不同的位置上还存在多个碱基的连续性缺失现象(119~121 bp,183~189 bp和325~330 bp),但在蛋白水平上仅存在2~16个氨基酸位点差异,说明BnTT3、BnTT18、BnTTG1和BnTTG2在不同甘蓝型黄黑籽材料中存在单核苷酸位点差异,而单核苷酸位点突变不一定导致氨基酸位点的变异。在不同黄黑籽材料中仅BnTT3和BnTT18存在一致性的氨基酸突变位点(252和87),推测BnTT3和BnTT18可能在黄黑籽甘蓝型油菜种皮颜色差异形成过程中发挥至关重要的作用。通过这些位点的等位特异PCR可以区分材料间透明种皮基因,为特异基因芯片的开发及阐明甘蓝型油菜种皮色泽性状的基因及其作用位点奠定基础。     

日照琅琊鸡催乳素基因的遗传变异与就巢性的相关性研究

【研究目的】采用候选基因法研究催乳素基因的遗传变异对家禽就巢性的影响,可为控制家禽就巢性奠定理论基础。【方法】设计引物特异性扩增PRL的5’调控区序列,对PCR产物进行基因分型,统计分析不同基因型与就巢性的相关性。【结果】在所检测的琅琊鸡鸡群中发现PRL的5’调控区存在遗传变异;发现了PRL的三种基因型;统计分析结果表明,三种基因型与鸡的就巢性的遗传效应差异显著（P<0.05）,其中AA型鸡的就巢性最低,与AB和BB型鸡的就巢性存在着显著差异（P<0.05）;AB和BB型鸡的就巢性均较高,后两者差异不显著（P>0.05）。【结论】提高A等位基因的频率将有利于降低鸡的就巢性,据此可以在育种选择中实现早期基因型选种,研究结果有助于科学地保护和利用我国优良地方家禽品种资源。     

猪T细胞受体α链基因的克隆、序列分析及其结构预测

旨在为研究猪T细胞受体分子结构与功能,并首次在国内克隆了猪T细胞受体α链基因。以GenBank上登载的猪T细胞受体(Tcell receptor,TCR)α链(AB087988)为参考序列,从甘肃合作猪外周血液淋巴细胞中用RT-PCR的方法克隆了TCR-α链基因(pTCR-α)。结果表明:克隆的TCR-α基因具有完整的ORF,全长819 bp,编码272个氨基酸,预测蛋白分子量为30 kDa,含18个强碱性氨基酸,23个强酸性氨基酸,87个疏水性氨基酸和103个极性氨基酸,含有一段20个氨基酸的信号肽序列;与GenBank上登载的TCR-α参考序列(AB087988)的同源性为94.6%,与其他具有完整ORF的猪TCR-α相比,同源性为54.4%~80.3%。推测可能是一新的TCR-α基因转录本。同时,应用生物信息学技术分析了其基因序列及编码蛋白的结构特征,这为猪T细胞受体分子结构与功能的研究奠定了基础。     

水稻AGPase小亚基基因的克隆测序及种质间遗传分化的研究

淀粉是构成和影响水稻产量和品质的最主要因素;ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)基因是影响淀粉合成的关键酶基因之一。本研究用编码AGPase小亚基基因(AGPsma)序列的特异引物(序列为F:5’-TACGCTATGCTCTTGAAAC-3’;R:5’-TATCTTCCCAGTAACCATCA-3’)对普通野生稻(元江)、粳稻(榆密15)、籼稻(93-11)及籼粳交品系(南34)进行PCR扩增、克隆、测序和序列对比。又用该引物对来源于13个国家的15份AA基因组和5份CCDD基因组的共20份野生稻及205份包括40份籼稻和165份粳稻的云南地方品种和改良品种(系)进行PCR检测。在以上4个不同类型水稻材料该引物上扩增出184bp和215bp的2个片段均为AGPase小亚基基因的序列。在该序列的109bp处,元江普通野生稻和榆密15为T,而93-11和南34为C;籼粳交品系南34在121~151bp区间缺失31个碱基。所有的225份供试材料可分为3类。第一类具有215bp大小的条带,包括了全部的野生稻材料和196份籼粳材料。其中籼稻数占籼稻样本总数的95%,籼稻地方品种占籼稻地方品种总数的75%;粳稻数占粳稻样本总数的83.6%,粳稻地方品种占粳稻地方品种总数的60%。第二类具有184bp的条带,包括28个籼粳材料。第三类同时具有215bp和184bp的片段,此类只有1个父母本具不同片段的滇型杂交粳稻品种。结果表明AGPsma序列在野生稻中可能尚未出现分化,但在籼稻、粳稻和地方老品种及改良品种中都出现了遗传分化。