猪瘟病毒Erns蛋白在杆状病毒系统中的表达及纯化

采用杆状病毒表达系统表达并纯化猪瘟病毒E^rns蛋白,并对其反应原性进行鉴定。将猪瘟病毒的E^rns 基因克隆至pFastbac-HT-A 载体上,构建了pFA-E^rns重组质粒;经转座、转染后构建重组杆状病毒rBac-E^rns;通过优化接毒时间和接毒量等参数,最终确定表达条件。将表达产物采用亲和层析法纯化后,采用Western Blotting 鉴定E^rns 蛋白的反应性,并采用间接ELISA 方法对其应用进行了初步探索。结果显示,获得了重组杆状病毒rBac-E^rns,经Western Blotting 和间接免疫荧光(IFA)鉴定,该重组病毒能够与猪瘟阳性血清和E^rns 单抗发生特异性反应。纯化后的E^rns 蛋白纯度较好,浓度为0. 2 mg/ mL,经Western Blotting 方法鉴定证明,纯化后的蛋白与E^rns单抗和猪瘟阳性血清能够发生特异性反应;初步建立了间接ELISA 方法检测猪瘟抗体,证明表达的蛋白可以区分猪瘟阳性血清和阴性血清。表明本研究利用杆状病毒表达系统成功表达并纯化了猪瘟病毒E^rns蛋白,纯化后的E^rns蛋白具有良好的反应性,可以作为开发鉴别诊断试剂的备选蛋白以及用于E^rns 蛋白的结构和生物学功能研究。     

猪瘟抗体间接ELISA检测方法的建立和优化

采用真核系统表达纯化的猪瘟病毒E2蛋白作为包被物,通过对各个反应条件的摸索和优化,建立了检测猪瘟病毒抗体的猪瘟抗体间接ELISA检测方法。研究结果表明,E2蛋白的最佳包被浓度为0.25μg/mL,最佳包被条件为4℃16h;待检血清的最佳稀释倍数为100倍;特异性检测试验证明,该方法与猪常见病原的阳性血清没有交叉反应。通过对大量猪瘟抗体阴、阳性血清的检测,最终确定了本检测方法的判定标准。     

多重荧光PCR鉴别诊断猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒

为了建立一种快速、灵敏、特异的能够同时检测猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的多重荧光PCR方法。根据GenBank中公布的猪瘟病毒基因序列,设计一套特异性的引物和探针,对猪瘟病料提取RNA,经RT—PCR扩增后将产物回收,克隆至pMDl8-T构建pMDl8-T—CSFV阳性质粒;非洲猪瘟的目的片段序列采用化学合成,构建pMDl8-T—ASFV阳性质粒。以两种阳性质粒为模板时建立的多重荧光PCR方法做特异性、灵敏度和重复性试验,结果表明该方法可以将猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒同口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪水泡病病毒、猪圆环病毒2型区分开,灵敏度可以达到10拷贝的数量级．而且方法稳定。对2份已知猪瘟阳性血清样品和120份猪内脏、猪鼻腔拭子及血清样品检测后．发现对已知阳性样品的检测结果符合预期目标。未知样品检出猪瘟病毒3份阳性,未检出非洲猪瘟病毒阳性。     

非洲猪瘟病毒抗体检测间接ELISA方法的建立

以基因工程表达的非洲猪瘟病毒VP73蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA方法,用以检测猪血清中抗非洲猪瘟VP73蛋白的抗体。该方法对非洲猪瘟标准阳性血清的检测灵敏度可以达到1∶2 560,与同类进口ELISA试剂盒相当。此方法只特异性检出非洲猪瘟阳性血清,而对猪传染性胸膜肺炎等5种猪传染病阳性血清的检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。批内和批间重复性试验结果发现,检测同一份血清的变异系数小于10%,表明其重复性较好。包被好的酶标板37℃放置5d后,对同一份血清的检测敏感性无明显变化,初步表明其稳定性较好。利用建立的间接ELISA方法和进口ELISA试剂盒分别对150份血清样品进行非洲猪瘟血清抗体检测,结果表明本方法的特异性和敏感性分别为99.1%和94.3%,2种方法检测结果的符合率为98%。以上试验表明,本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性、较好的重复性和稳定性,可以满足临床检测的需求。     

非洲猪瘟病毒p54间接ELISA抗体检测方法的建立及试剂盒研制

非洲猪瘟是对全球养猪业危害最严重的病毒性传染病,目前尚无有效疫苗。p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要结构蛋白之一,参与病毒的吸附和侵入,是非洲猪瘟血清学诊断的重要靶标之一。本研究采用无标签的重组p54蛋白作为包被抗原,建立了ASFV p54间接ELISA抗体检测方法,优化了检测条件,组装成了试剂盒。根据对374份阴性猪血清的检测,确定了本试剂盒检测的临界值,并利用不同猪病原阳性质控血清进行了敏感性、特异性和稳定性研究。结果显示,本方法检测阴/阳性血清的临界值为0.250;敏感性血清质控品的最小检出限为1∶1 600倍,与ASFV阳性血清、猪伪狂犬病病毒阳性血清、猪繁殖与呼吸病毒综合征病毒阳性血清、猪圆环病毒2型阳性血清、猪细小病毒阳性血清和猪抗大肠杆菌阳性血清等6种特异性质控血清均无交叉反应;试制的3批试剂盒批间和批内变异系数均小于10%。试剂盒在2～8℃贮存9个月,特异性、敏感性保持不变。以上试验结果表明,本试剂盒具有良好的敏感性、特异性和稳定性,与OIE推荐的p72阻断ELISA抗体检测试剂盒具有较高符合率,为非洲猪瘟临床血清学诊断和抗体监测提供了良好的技术支持。     

黔西县几个种猪场生猪疫病血清学调查报告

采用正向间接血凝（IHA）试验随机对3个1000头以上种猪场的90份血清,进行了猪口蹄疫（FMD）、猪瘟（HC）血清学监测;同时还采用一步法猪瘟（HC）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）疫病病毒反转录（PCR）对血清进行了检测。结果表明,种猪场的FMD、HC免疫合格率分别为85.56%和87.78%,均达到国家农业部规定70.0%的标准;用PCR法检测HC、PRRS阳性检出数为0。     

不同日龄仔猪 注射猪瘟疫苗抗体滴度的试验

猪瘟又称"烂肠瘟",是由猪瘟病毒引起的猪的一种热性、致死性、高度接触性传染病,对养殖业影响颇大。为了提高猪瘟免疫效果,我们用正向间接血凝试验在亨发猪场对三组在不同日龄注射猪瘟疫苗的仔猪血清进行了检测。结果表明:A组、B组、C组最高抗体滴度分别为1∶32,1∶64,1∶128。试验中所用猪瘟血凝抗原效价为1∶1024,标准阳性血清效价为1∶2048。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区高效表达及间接ELISA抗体检测方法的建立和应用

利用大肠杆菌表达猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区,建立猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法。依据大肠杆菌密码子偏好性对猪瘟病毒E2基因主要抗原区的稀有密码子进行同义替换,克隆至pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)构建重组表达菌,并将纯化重组蛋白作为抗原建立猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的方法。对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot检测,结果显示获得分子量为30 ku的重组蛋白,占细菌总蛋白的41%,与猪瘟抗体特异性反应强;间接ELISA重复性检测显示批内变异系数为3.72%,批间变异系数为4.75%;特异性检测显示,与猪圆环病毒、蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒和口蹄疫病毒的抗体阳性血清无交叉反应,并且对566份样品的临床检测结果显示与爱德仕猪瘟阻断ELISA试剂盒的阳性符合率为90.80%,阴性符合率为93.29%,总符合率为91.52%。结果表明密码子优化后E2重组蛋白实现高效表达,建立的猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法成本低、准确率高,可进一步开发应用。     

猪瘟抗体检测存在的问题及对策

1猪瘟抗体检测情况2011年,成武县畜牧站对13个乡镇其中的89个规模猪场进行了猪瘟抗体检测,共检测公母猪血清577头份,各场的种猪受检率在20%~30%之间。检测用诊断液为猪瘟正向间接血清抗原,由兰州兽医研究所生产,批号为990521,每批检测均设阳性、阴性、稀释液对照,再对照合格前提下,观察被检血清中抗猪瘟抗体效价,以1:64为免疫合格。检测结果如下:猪瘟抗体效价在1:64以上的     

应用间接血凝试验监测猪瘟抗体

1987～1988年,我们用间接血凝(IHA)试验对重庆市所辖11个区、县的猪只进行猪瘟抗体监测,现将结果报告于下。材料和方法一、猪瘟IHA抗原和阳性血清:农业部成都药械厂赠送。二、被检血清:取自我市所辖11个区、县69个乡175个村用猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞苗免疫的猪只,按常规方法采血分离血     

用正向间接血凝试验检测猪瘟免疫抗体

对采自西宁地区两个绪场的76份血清用正向间接血凝试验进行了猪瘟免疫抗体的检测。结果检出阳性59份，抗体保护率为77．63％(59／76)。     

2007—2011年新疆地区生猪猪瘟病毒监测初步分析

本文对2007—2011年新疆生猪的猪瘟疫病进行摸底调查,选择规模养猪场、散养户和屠宰场随机采样,采集规模场猪群的组织、血清样品2847份;采集散养户猪群的组织、血清样品3187份;采集屠宰场组织样品5643份.用RT-PCR方法进行病原学检测.结果表明,规模场猪瘟阳性检出率为4.19%;散养户猪瘟阳性检出率为6.29%;屠宰场猪瘟阳性检出率为2.82%.分析表明,散养户发病率高于规模场,屠宰场存在隐性感染猪瘟的隐患,新疆猪瘟疫病防控形势依然严峻.     

猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的临床应用研究

采用猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒对5省/市的猪血清样本进行检测,并与进口ELISA试剂盒相比较,同时采用世界动物卫生组织(OIE)指定方法-荧光抗体病毒中和试验对检测结果有差异的血清样本进行验证,结果显示,两种试剂盒对田间临床样本的符合率为78.1%;猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒与荧光抗体病毒中和试验的符合率高于进口ELISA试剂盒;综合免疫背景分析,猪瘟病毒间接ELISA抗体试剂盒的敏感性和特异性均高于进口试剂盒,更适合在我国进行大规模推广应用。     

以原核表达的非洲猪瘟病毒pK205R蛋白为包被抗原的间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的血清学方法,本研究原核表达ASFV pK205R重组蛋白,并以其为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种快速的ASFV间接ELISA检测方法。结果显示,原核表达的ASFV pK205R蛋白约为44 ku,western blot证实表达蛋白具有良好的反应原性;以其作为包被抗原建立的ASFV抗体间接ELISA方法仅对ASFV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、副猪嗜血杆菌及猪大肠杆菌阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;该方法检测灵敏度为1∶2 560;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%;利用该方法对临床样品检测的结果与国外商品化试剂盒检测结果符合率为100%。本研究建立的ASFV抗体间接ELISA方法为防止该病传入我国以及ASFV的实时监测提供技术储备。     

河南省平顶山市2020 年3 月份非洲猪瘟排查情况

本文通过对平顶山市随机抽取的15个猪场进行非洲猪瘟监测排查和疑似病例进行临床症状观察、RT-PCR诊断等。结果为对送检的15个猪场的450份血清采用RT-PCR方法诊断,未检测出非洲猪瘟阳性;对13份疑似非洲猪瘟病料采用RT-PCR方法诊断,未检测出非洲猪瘟阳性,检测出猪瘟阳性。     

非洲猪瘟病毒CD2v抗体间接ELISA方法的建立及其初步应用

为建立血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,研究真核表达ASFV CD2v重组蛋白,并以纯化的蛋白为包被抗原,通过反应条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种快速的ASFV间接ELISA检测方法。通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定抗原的最佳包被浓度为10μg/m L,待检血清的最佳稀释倍数为1∶25,最佳封闭液为1%BSA与明胶封闭缓冲液,酶标抗体最佳稀释度为1∶2 000,最优二抗稀释液为PBST,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.366。该方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达1∶50,批内重复性和批间重复性变异系数分别为2.2%～9.4%和4.7%～8.1%。试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可初步应用于ASFV抗体检测。     

山西省阳高县猪瘟血清学调查研究

采用正向间接血凝试验(IHA),对山西省阳高县12个乡镇65个养猪场和散养户饲养猪的1 269份血清进行猪瘟抗体检测,并对近年来调查数据加以比较,以了解猪瘟病毒(CFSV)在阳高县区的感染情况.结果表明,阳高县各地均有猪瘟抗体阳性检出,猪场抗体阳性检出率达100%,其中母猪的抗体阳性率为12.65%,仔猪的抗体阳性率为12.76%.说明阳高县CSFV感染比较严重,应采取有效防疫措施进行防控.     

猪瘟三种快速诊断方法的比较

本试验运用电镜负染、荧光抗体染色、间接－ELISA三种方法对新疆南疆地区收集的7份猪瘟RT－PCR阳性病料进行了检测，发现：电镜负染法检出阳性病料2份，荧光抗体染色法检出阳性病料6份、间接－ELISA法检出阳性病料6份。结果表明荧光抗体染色、间接－ELISA都有很好的敏感性和特异性，其中间接－ELISA法可作为基层对猪瘟进行快速诊断的首选方法。     

陕西省五种猪传染病的血清学调查

2001年10月至2002年7月对来自陕西省38个养猪场，户的191份猪血清分别进行了猪伪狂犬病，流行性乙型脑炎，细小病毒感染，生殖和呼吸系统综合征的乳胶凝集试验以及猪瘟正向间接血凝试验，共检出抗体阳性血清141份，阳性率为73．8％，其中检查猪伪狂犬病的88份血清，阳性66份，阳性率为75．0％；检查流行性乙型脑炎的5份血清，阳性2份，阳性率为40．0％，检查细小病毒感染的16份血清，阳性8份，阳性率为50．0％；检查猪生殖和呼吸系统综合征的72份血清，阳性63份，阳性率为87．5％，检查猪瘟的15份血清，阳性8份，阳性率为53．3％。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)的血清学检测方法,本研究根据ASFV Georgia2007/1株基因组合成其p72全长基因,并将其克隆至p GEX6p-1载体,构建重组质粒pGEX6p-1-p72并经酶切、PCR和测序鉴定正确后转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后经SDS-PAGE和western blot鉴定,结果显示获得了可溶性表达且纯度较高的重组p72蛋白(rp72)。利用GST亲和纯化层析柱纯化,得到浓度为0.2 mg/mL的rp72。以rp72作为包被抗原,通过优化各反应条件建立检测猪血清中非洲猪瘟抗体的间接ELISA方法,结果显示,rp72最佳包被浓度为1.25μg/mL,封闭时间为37℃1 h;待检血清稀释度为1.100,孵育时间为37℃30 min;羊抗猪IgG-HRP孵育时间为37℃1 h。利用该方法检测280份阴性血清,确定其临界值为0.412。采用建立的间接ELISA抗体方法对PEDV、PRRSV、CSFV、PRV、TGEV、PPV、PCV、E. coli阳性猪血清进行检测,结果显示,除ASFV阳性对照为阳性外,其他病原阳性血清检测结果均为阴性,该方法特异性强;将非洲猪瘟抗体阳性猪血清2倍倍比稀释(1.100～1.6 400)后,利用该方法进行检测,结果显示其检测阳性血清的稀释度为1.3 200倍时OD_(450nm)值仍大于临界值,敏感性高于市售西班牙ASFV阻断ELISA试剂盒检测结果,本研究建立的方法敏感性较高;对该方法进行批内和批间重复性试验,结果显示批内和批间的变异系数均10%,重复性良好。利用本研究建立的ASFV ELISA抗体检测方法(p72)对184份临床血清进行检测,结果显示该方法敏感性为100%,特异性为98.70%;与ASFV阻断ELISA抗体检测试剂盒方法总符合率为98.91%,kappa值为0.961。本研究首次基于rp72建立的非洲猪瘟抗体间接ELISA检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为ASFV抗体检测提供了一种快速、精准、经济、高效的方法。