气肿疽梭菌免疫学检测方法概述

气肿疽梭菌是一种具有组织毒性、有鞭毛的孢子化革兰氏阳性菌,可引气肿疽这种反刍动物高致死性急性疾病。常见的典型临床症状为发病动物肌肉丰满部位发炎、肿胀,触压可听到类似捻发音,流行呈现一定的季节性,并有区域性流行的特征。牛气肿疽在养殖场中一旦传播流行,往往会伴随巨大的经济损失,所以更加需要加强对该病的防控与诊断。本文整理了气肿疽梭菌的3种免疫学检测方法(间接ELISA、Dot-ELISA、免疫胶体金技术),以供参考。     

气肿疽梭菌检测方法概述

气肿疽(Clostridium chauvoei infection)病原体为气肿疽梭菌,是一种发生于反刍动物的急性、热性、败血性传染病。常见的典型症状为发病动物肌肉丰满部位发生炎性、气性肿胀,触压有捻发音,该病的流行有一定的地方性、季节性,多发生在潮湿的山谷、牧场,且在天气炎热的多雨季节。近几年常有暴发牛气肿疽的报道,给养殖业的发展带来了巨大的冲击和经济损失,同时也逐渐地威胁到畜牧生产和人类的安全。国内关于该病的研究多数为病例报道,对于该病的详细研究和综述却是少之又少,论文参考国内外相关文献,从方法、原理、优缺点等多个方面阐述气肿疽的检测方法,以期为该病的诊断提供参考。     

气肿疽梭菌延边样的分离鉴定

牛、羊等反刍动物的气肿疽病是由气肿疽梭菌感染引起的严重危害畜牧业发展的一种疾病,本研究从延边州延吉市采集疑似气肿疽梭菌感染的牛肝脏、脾脏、肌肉等组织进行气肿疽梭菌的分离鉴定。结果表明:经病原学检查、生化鉴定、动物试验及分子生物学鉴定,本试验成功对气肿疽梭菌进行了分离,该菌株细胞毒素、cct A基因与Gen Bank上已发表的气肿疽梭菌ATCC 10092菌株的同源性达到99.0%,此结果为该地区气肿疽病的免疫和微生态防治提供了重要的参考依据。     

气肿疽梭菌主要抗原及毒力因子的研究进展

气肿疽梭菌是一种严格厌氧的有芽孢的杆菌,可引起常见反刍家畜组织毒性缺氧,严重可致死,常为畜牧养殖业带来巨大的经济损失。气肿疽对反刍动物的影响存在已久,但其确切发病机制和相关毒力因子的作用仍未能被完全解读。随着研究的深入,已发现气肿疽梭菌的4种主要抗原和毒力因子在气肿疽发病过程中起着重要的作用。本文主要对气肿疽梭菌的4种主要抗原和毒力因子(细胞毒素A、鞭毛蛋白、神经氨酸酶和透明质酸酶)的相关研究进行总结概述,期望能为日后气肿疽检测方法和新型疫苗的研究提供参考。     

气肿疽梭菌NanA基因核酸疫苗的免疫效果评价

为了检测气肿疽梭菌NanA基因核酸疫苗的免疫效果,在成功构建pVAX1-NanA真核表达重组质粒的基础上将其转染至Vero细胞,通过间接免疫荧光鉴定其表达,并将成功构建的pVAX1-NanA质粒大量提取后免疫Balb/c小鼠,设置pVAX1-NanA核酸疫苗组、pVAX1空载体组和PBS对照组。对小鼠采血并分离血清,用ELISA测定血清中的IgG、IgG1、IgG2a抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平;第3次免疫2周后,用流式细胞仪测定小鼠脾脏中的CD4~+和CD8~+T细胞水平。结果表明,pVAX1-NanA核酸疫苗免疫Balb/c小鼠后,小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a的抗体水平极显著高于pVAX1空载体组和PBS对照组(P0.01);IFN-γ和IL-4细胞因子水平极显著高于pVAX1空载体组和PBS对照组(P0.01);CD4~+、CD8~+T细胞分析表明, pVAX1-NanA免疫组的CD4~+和CD8~+T细胞水平显著高于pVAX1组和PBS对照组(P0.05),pVAX1-NanA核酸疫苗组的CD4~+/CD8~+T细胞比值高于pVAX1空载体组与PBS对照组(P0.05),pVAX1空载体组和PBS对照组之间无显著差异(P0.05)。试验成功制备了pVAX1-NanA核酸疫苗,且pVAX1-NanA核酸疫苗可刺激Balb/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫。     

一例牛气肿疽梭菌病的诊治

牛气肿疽梭菌病是一种由气肿疽梭菌引起的牛急性败血性传染病。报道了在粤东地区某村散养牛只发生的一例牛气肿疽梭菌病的诊治,通过观察临床症状及解剖病变,进行组织器官病理学切片、细菌分离、病毒PCR检测和毒理学检测,确诊为牛气肿疽梭菌病。     

羊梭菌病快速鉴别PCR方法的建立及初步应用

根据GenBank已公布的产气荚膜梭菌和腐败梭菌的α毒素基因序列,分别设计并合成针对2种α毒素基因的特异性引物,通过扩增条件的优化,建立快速鉴别产气荚膜梭菌和腐败梭菌的双重PCR方法。特异性试验显示,产气荚膜梭菌和腐败梭菌参考菌株均扩增出了相应的预期目的条带,而大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌和链球菌则均未能扩增出相应条带。灵敏度试验结果显示,产气荚膜梭菌和腐败梭菌基因组DNA最低检测量分别为17.95pg/μL和1.261pg/μL。应用该方法对样品进行检测,其中5份为产气荚膜梭菌阳性。成功建立了特异性强、敏感性高的双重PCR方法,可以有效进行产气荚膜梭菌和腐败梭菌的快速鉴别,对羊梭菌病病原快速鉴定及流行病学调查具有重要意义。     

气肿疽梭菌C54-1株的制备与检定

为研究气肿疽梭菌C54-1株(CVCC60001)的菌种特性,制备了1批气肿疽梭菌C54-1株,并对菌种的形态及生化特性、培养特性、血清学特性、真空度、纯粹、剩余水分、毒力及免疫原性、16S rDNA等进行检定,以及对于该菌的适宜培养基促生长能力等方面进行了比较。实验结果表明,该冻干菌种的形态及生化特性、培养特性、血清学特性、真空度、纯粹、剩余水分、毒力及免疫原性均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》二〇〇〇版质量标准的规定。16S rDNA鉴定为气肿疽梭菌,相似度为99.93%。在免疫原性检定中,使用致死剂量攻毒时,免疫组能够4/4被保护,证明该菌明矾苗免疫效果良好。使用商品化梭菌培养基对于该菌培养进行了比对,证实商品化培养基替代厌气肉肝汤的可能性。本研究为气肿疽梭菌的制备和检定提供参考依据,并使用不同培养基进行比对研究,为该菌的稳定培养和疫苗工艺改进提供了研究基础。     

鹿气肿疽的诊断与治疗

鹿气肿疽又称黑腿病或鸣疽，是由气肿疽梭菌引起的一种急性热性传染病。以在肌肉丰满部位发生气性炎性肿胀，伴有捻发音和跛行为特征。     

利用16S rDNA快速鉴定C群链球菌的研究

本试验应用PCR方法,根据16S rDNA两端的保守序列,用primer5.0软件设计引物扩增待检细菌,然后对扩增产物DNA片段进行测序、序列分析,经与Gen Bank中的已知序列进行同源性比较后,发现该未知菌属于链球菌C群。该方法比传统的细菌鉴定方法省时省力,并且能将细菌定型到群,结果准确、快速、重复性好。     

Genetic diversity of Streptococcus equi subsp. zooepidemicus isolated from horses

Streptococcus equi subsp. zooepidemicus (SEZ) is an opportunistic and zoonotic pathogen of horses. In this study, genetic intraspecies variability of SEZ obtained mainly from respiratory and genital samples of horses was investigated by analysis of the 16S–23S rRNA intergenic spacer region (ISR) and of the 16S rRNA gene. 16S–23S ISR rRNA type A1 was predominant, although a high rate of multiple products (30.5%) was obtained. Phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene detected three genogroups (I, II and III). 16S rRNA variable regions V1 and V2 are the most important regions for evaluating SEZ intraspecies variability, but at least V1-V5 regions should be considered to avoid mistakes. Analysis of all 16S rRNA sequences available in databases assigned human SEZ to groups I and III but not to group II. These results show a high genetic variability in SEZ collected from different specimens of horses from various regions of Italy.     

Nucleotide Sequencing and Analysis of 16S rDNA and 16S-23S rDNA Internal Spacer Region (ISR) of Taylorella equigenitalis, as an Important Pathogen for Contagious Equine Metritis (CEM)

The primer set for 16S rDNA amplified an amplicon of about 1500 bp in length for three strains of Taylorella equigenitalis (NCTC11184^T, Kentucky188 and EQ59). Sequence differences of the 16S rDNA among the six sequences, including three reference sequences, occurred at only a few nucleotide positions and thus, an extremely high sequence similarity of the 16S rDNA was first demonstrated among the six sequences. In addition, the primer set for 16S-23S rDNA internal spacer region (ISR) amplified two amplicons about 1300 bp and 1200 bp in length for the three strains. The ISRs were estimated to be about 920 bp in length for large ISR-A and about 830 bp for small ISR-B. Sequence alignment of the ISR-A and ISR-B demonstrated about 10 base differences between NCTC11184^T and EQ59 and between Kentucky188 and EQ59. However, only minor sequence differences were demonstrated between the ISR-A and ISR-B from NCTC11184^T and Kentucky188, respectively. A typical order of the intercistronic tRNAs with the 29 nucleotide spacer of 5'-16S rDNA-tRNA^Ile-tRNA^Ala-23S rDNA-3' was demonstrated in the all ISRs. The ISRs may be useful for the discrimination amongst isolates of T. equigenitalis if sequencing is employed.     

致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌的分离与16SrDNA的鉴定

从鹅卵黄性腹膜炎临床病例中采集样品,分离病原进行一系列生化鉴定,共分离得到7株致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌,编号为E0238、E0239、E0240、E0453、E0454、E0241、E0245。O血清型鉴定分属于O2、O21、O37、O1、O24、O24、O148。利用16SrDNA扩增试剂盒对随机选取的3株细菌进行PCR扩增,并将PCR产物序列与GenBank中的E.coli16SrDNA进行序列比对,结果显示分离细菌与大肠杆菌的同源性达99%以上。     

随机扩增多态性DNA技术对绿色气球菌的相关性分析

为考察恩诺沙星与乙酰甲喹的联合抗菌活性,采用肉汤稀释棋盘法测定了恩诺沙星与乙酰甲喹单用及联用对大肠杆菌、沙门氏菌临床菌株的体外抗菌活性。结果显示:恩诺沙星与乙酰甲喹单独使用对大肠杆菌的最小抑菌浓度为8μg/m L和32μg/m L,对沙门氏菌的最小抑菌浓度为16μg/m L和256μg/m L。两药联用对大肠杆菌和沙门氏菌的FIC指数为0.5和0.75,分别表现为协同作用和相加作用。试验表明,恩诺沙星与乙酰甲喹联用可以增强对大肠杆菌和沙门氏菌感染的治疗效果。     

多重PCR方法鉴别牛、羊、猪种布鲁氏菌株

用eri作为布鲁氏菌属特异性基因,以IS711基因拷贝数差异作为布鲁氏菌种间特异性标志,建立了鉴别牛、羊、猪种布鲁氏菌株的多重PCR方法。结果:牛种布鲁氏菌2308株扩增出大小为494 bp和178 bp的两条带,羊种布鲁氏菌M28株扩增出大小为733 bp和178 bp的两条带,猪种布鲁氏菌S1330株扩增出大小为285 bp和178 bp的两条带,均与预期吻合;而胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、流产沙门菌、都柏林沙门菌、大肠杆菌均未扩增出任何条带。硫化氢和血清学试验结果也符合相应种布鲁氏菌的特点。结果表明,本研究的多重PCR方法可用于牛、羊、猪种布鲁氏菌株的快速鉴定。     

牛附红细胞体LAMP检测方法的建立

为建立一种快捷、灵敏的牛附红细胞体检测方法,本研究根据GenBank上发表的16S rRNA基因(登录号:AF016546)序列设计合成2对LAMP特异引物,建立了检测牛附红细胞体环介导等温扩增(LAMP)方法,并优化了LAMP的各反应条件,进行了敏感性和特异性试验。LAMP扩增产物经电泳、显色鉴定。结果显示,LAMP方法扩增牛附红细胞体产物呈特征性梯状条带,显色反应呈现绿色荧光;敏感性检测最低浓度为25.6 fg/μL;特异性试验结果显示,牛附红细胞体检测管显色后呈阳性,而猪附红细胞体、牛新孢子虫、弓形虫及牛瑟氏泰勒虫等对照组均呈阴性,说明本研究建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点,适合于牛附红细胞体的检测。     

猪“高热病”源嗜麦芽窄食单胞菌16S rDNA基因的克隆和系统发育分析

根据NCBI中已报道的嗜麦芽窄食单胞菌16S rDNA基因序列设计引物,对两株来源于猪“高热病”病料中的疑似嗜麦芽窄食单胞菌PSM-5、PSM-6进行PCR扩增。将扩增产物克隆至pMD18-T载体上,并转化到DH5α中。抽取质粒模板,进行PCR和双酶切鉴定并测序,从分子水平上予以鉴定。两株菌的16S rDNA基因扩增片段的核苷酸序列（GenBank登录号为GQ267816和GQ267817）与已经报道的嗜麦芽窄食单胞菌分离株的16S rDNA序列的相似性均在96.78%以上,最高达99.93%。本试验对通过16S rDNA鉴定嗜麦芽窄食单胞菌提供一定参考,同时对猪“高热病”的诊断治疗奠定细菌学方面的基础,对其发病机制的探讨提供依据。     

四川高效白三叶根瘤菌筛选及16SrDNA鉴定

为了筛选出与白三叶(Trifolium repens)共生匹配效果优异的根瘤菌菌株,从四川野外采集到80余份白三叶根瘤样品并从中成功分离出了72株。经菌落形态观察,革兰氏染色镜检初步检验后,对所分离的菌株进行水培法和砂培法结瘤试验筛选高效菌株。结果表明,接种根瘤菌显著提高了白三叶的结瘤数、株高、鲜重、干重、叶绿素和全氮含量(P< 0.05),其中以菌株YA1121和CD1105为最佳。同时,采用16S rDNA序列鉴定菌株YA1121和CD1105,属于三叶草根瘤菌,为四川白三叶根瘤菌遗传多样性及系统发育研究奠定了基础。     

鸭疫里默氏菌病和大肠杆菌病鉴别诊断双重PCR方法的建立和应用

本研究从鸭疫里默氏菌提取基因组DNA,采用细菌16S rRNA基因的通用引物,用PCR方法成功扩增出鸭疫里默氏菌的部分16S rRNA基因,克隆及测序结果表明其全长1512bp,G＋C含量为51％,该序列已登人GenBank,登录号为DQ078779。同时利用生物软件对GenBank收录的鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的16S rRNA基因序列进行分析后,设计了鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的种特异性引物,分别能从各自的16S rRNA基因中扩增出长度为342和718bp的DNA片段。并据此建立了一种能快速准确鉴别诊断鸭疫里默氏菌和大肠杆菌病的双重PCR方法,该方法能从肝脏组织悬液煮沸后的上清、细菌培养物或提取的细菌基因组DNA中快速扩增出相应的片段,进行鉴别诊断。