D101树脂固定中性蛋白酶的条件优化及酶学性质研究

【目的】提高中性蛋白酶的固定化效果,对D101树脂固定中性蛋白酶的条件进行优化并对固定化酶的酶学性质进行研究。【方法】以D101树脂吸附法固定中性蛋白酶,分别测定不同温度、时间和加酶量条件下固定化酶的固定化效果,并对固定化中性蛋白酶和游离中性蛋白酶的酶学性质进行比较研究。【结果】D101树脂固定中性蛋白酶的最佳固定条件为:加酶量150 U/g,温度40℃,固定时间120 min,此时固定化酶的酶活回收率最高(70%)。固定化中性蛋白酶和游离中性蛋白酶的最适温度分别为46和40℃,最适pH值分别为7.4和7.2,表观米氏常数Km分别为0.22和0.20 mg/mL,最大酶促反应速度Vmax分别为0.39和0.21 mL/min。【结论】以D101树脂固定中性蛋白酶后,固定化中性蛋白酶的活力、酶活回收率以及热稳定性和pH稳定性显著提高。     

一株产蛋白酶海洋细菌的分离鉴定及发酵条件研究

从舟山海产品加工厂收集废弃鱼虾蟹等下脚料,利用脱脂奶平板培养基进行产蛋白酶菌株的分离筛选,获得的菌株利用Folin-酚法进行酶活测定,将酶活性最高的菌株进行16S rDNA分子鉴定,绘制系统进化树。研究初始pH、盐度、培养温度、培养时间等单因素对蛋白酶活性的影响,再利用Expert-Design软件中的响应面分析方法(RSA)对该菌株的发酵条件进行系统优化。结果表明,分离筛选得到1株具有较高蛋白酶活性的海洋细菌SP1,酶活测试结果显示该海洋细菌SP1的初始酶活为88.6 U·mL ^-1,16S rDNA分子鉴定结果显示该菌株属于蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus。菌株Bacills cereus SP1的单因素培养结果显示,该菌株培养时间48 h、初始pH值8.5、NaCl浓度25 g·L ^-1、培养温度40 ℃对应的酶活最高。通过Expert-Design软件,利用Box-Behnken Design(BBD)方法进行响应面分析,优化设计培养条件,BBD响应面分析结果显示,培养温度35.7 ℃、初始pH 7.7、NaCl浓度为20.7 g·L ^-1、培养时间48 h,摇床转速120 r·min ^-1,5%的接种量,实际酶活为101.8 U·mL ^-1,比优化前的酶活提高了14.9%,预测精度达到95.8%。     

优质复配蛋白酶解工艺研究

以优质复合蛋白液为原料,采用复合蛋白酶进行水解,得到富含多肽的多肽液,研究酶种类、酶浓度、酶解温度、酶解时间等因素对多肽浓度的影响。试验以多肽质量浓度和DPPH·自由基清除能力为指标,筛选出最佳蛋白酶和最优复配比例,通过单因素和正交试验对酶解条件进行了优化。结果表明,风味蛋白酶添加量1 000 U/g,碱性蛋白酶、中性蛋白酶按2∶1复配时为复合酶解的最佳配比;其最佳酶解条件为:酶浓度为7 000 U/g,底物浓度为3%,温度为60℃,酶解时间为3 h;在该试验条件下,多肽浓度为17.43 mg/m L。     

米曲霉固态发酵豆粕产蛋白酶条件的研究

通过单因素(温度、豆粕含量、发酵时间)试验和3因素3水平正交试验,以蛋白酶活为测定指标,对米曲霉固态发酵豆粕产蛋白酶条件进行研究,结果表明:米曲霉固态发酵豆粕产蛋白酶最优条件是发酵温度30℃,发酵时间66 h,豆粕含量93%,此条件下的酶活为572.85 U/g。     

绿色木霉液体发酵生产纤维素酶条件的优化

目的:研究表明,纤维素酶对于纤维素的分解可应用于环保、畜牧、食品加工等多个领域,对于改善人们的生活有重大意义。找到绿色木霉生产纤维素酶的最佳发酵条件,为绿色木霉产纤维素酶的生产提供理论依据。方法:将一株高产绿色木霉进行滤纸酶活测定,对其液体发酵条件进行研究,以3因子4水平正交试验对其发酵温度、发酵时间、发酵初始pH值进行分析优化。结果:发酵过程中发酵时间影响结果为:1 d时酶活为23.56U/g;3 d时酶活为43.57U/g;5 d时酶活为80.24U/g;7 d时酶活为68.79U/g。发酵初始pH值影响结果为:pH为4.5时,酶活为65.31U/g;p H为5.0时酶活为73.06U/g;p H为5.5时酶活为81.21U/g;pH为6.0时酶活为72.09U/g。发酵温度影响结果为:温度为25℃时酶活为11.24U/g;温度为30℃时酶活为79.05U/g;温度为35℃时酶活为68.69U/g;温度为40℃时酶活为47.67U/g。结论:通过正交实验分析得出发酵时间5 d,初始p H值5.5,温度30℃条件下绿色木霉菌所产纤维素酶的较多,其酶活可达到82.25U/g。     

米曲霉ZW-06在固态基质上产高活性中性蛋白酶发酵条件研究

中性蛋白酶作为水产饲料用酶受到广泛的关注.为获得高产中性蛋白酶,研究了米曲霉ZW-06产中性蛋白酶的培养基组分和培养条件,在此研究基础上,采用Ln18(37)正交试验设计,对影响米曲霉ZW-06菌株产中性蛋白酶的7 个重要因素进一步优化.结果表明,米曲霉Aspergillus oryza ZW-06产中性蛋白酶的最适培养基组成为:在麸皮∶豆粕粉为8∶2的基础培养基中,添加0.5Na2CO3;产酶最适培养条件为:培养温度30℃,培养基含水率60(W/W),装量26.7 g/L,接种量20(V/W),静置培养48 h,将获得最高中性蛋白酶产量,酶活达23 738 U/g.研究结果为中性蛋白酶的工业化生产提供了技术参数.     

一株泡叶藻降解菌的筛选及其发酵条件优化

为了利用微生物降解泡叶藻,本研究以泡叶藻为唯一营养物质从土壤中筛选到一株对泡叶藻有明显降解效果的菌株,编号2-2。根据其形态学特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析鉴定该菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。对菌株的发酵条件进行了优化,最优发酵培养基为:泡叶藻30 g/L、酵母粉6 g/L和葡萄糖4 g/L。摇瓶最佳培养条件为:250mL三角瓶装液量50 mL,起始pH7.5,发酵温度32℃,发酵48 h有效活菌数为2.4×10~9CFU/mL。并对发酵液酶活进行了测定,其中纤维素酶活为47.7 U/mL,蛋白酶活为3.4 U/mL,海藻胶裂解酶活为0.721U/mL。研究结果表明巨大芽孢杆菌2-2同时具有海藻胶裂解酶、蛋白酶和纤维素酶活性,具有良好的应用前景。     

加酶提高发酵豆粕蛋白质水解度的研究

[目的]在枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌这3种菌混合发酵生产发酵豆粕的基础上,通过添加酶来提高发酵豆粕的水解度。[方法]通过添加中性蛋白酶、酸性蛋白酶和纤维素酶进行单因子试验和正交试验优化。[结果]结果表明,最佳加酶条件为中性蛋白酶加酶量为20U/g,酸性蛋白酶加酶量为20U/g,纤维素酶加酶量为6U/g;并且在此加酶优化条件下,发酵豆粕的水解度由优化前的9.32%增加到19.65%。[结论]添加中性蛋白酶、酸性蛋白酶和纤维素酶能显著提高发酵豆粕蛋白质水解度。     

蛋白质降解菌的筛选及其在烟叶中的作用效果研究

为分离产蛋白酶能力较强的菌株,利用酪蛋白培养基,对醇化烟叶上分离到的细菌进行了定向筛选,得到了降解蛋白质能力较强的菌株24株,对其蛋白酶活性的测定表明:PE1菌株的蛋白酶活性最高,达到156.25 U/m L。将PE1的粗酶液用于烟丝处理,烟丝蛋白质的分解率随着处理浓度的提高而增加,烟丝抽吸品质也有所改善,粗酶液最适浓度为40~60 U/g。     

一种新颖的毕赤酵母酸性蛋白酶基因的克隆和异源表达以及酶学性质研究

采用基因克隆方法获得酸性蛋白酶基因,在毕赤酵母KM71表达系统中进行表达,并将重组酵母酸性蛋白酶rPrA经过浓缩后研究其酶学性质,初步探究了rPrA对大豆蛋白和酪蛋白的水解情况.结果表明:经过异源表达后的重组毕赤酵母酸性蛋白酶分子量约为44 ku,在pH3.0的发酵条件下酶活最高,可达46.92U/mL.该酸性蛋白酶的最适pH值为3.0,最适温度为35℃.Mn2+对该酶活性有激活作用,多种金属离子对该酶有抑制作用;0.1 mmol/L的Pepstain A即可完全抑制酶活,说明此重组酶的活性中心有天冬氨酸残基.对大豆蛋白和酪蛋白的初步水解试验可知,当E/S为4 000 U/g时,此重组酶对大豆分离蛋白和酪蛋白的水解度分别为9.0％和8.34％.优化发酵条件以及与多种蛋白酶进行复配,该重组蛋白酶将在蛋白水解中有很好的应用前景,有望应用到畜禽饲料加工行业.     

微生物制剂对上部烟叶蛋白质及中性香气含量的影响

[目的]探讨喷施微生物制剂后上部烟叶蛋白质降解及中性香气成分的变化规律。[方法]利用自制的温湿度自控烤烟箱,研究了烘烤前期喷施微生物制剂3种处理：40U／g中性蛋白酶（处理①）、40U／g的∞淀粉酶＋糖化酶＋中性蛋白酶（处理②）和30U／g特制的发酵液（处理③）对上部烟叶可溶性蛋白和中性香气成分的影响。[结果]在上部烟叶烘烤前12h喷施一定剂量的特制烟草发酵液、中性蛋白酶以及中性蛋白酶与α-淀粉酶、糖化酶的混合物,均可显著降低上部烟叶可溶性蛋白的含量,其中以处理②和③的效果较好;各处理均能在一定程度上增加中性香气成分含量,但各处理之间存在较大差异。[结论]就中性香气成分总量而言,处理①和③的效果较好,但处理③的综合效果最好。     

人工光照萎凋对茶叶主要品质成分与酶活性的影响

采用250W碘钨灯,研究人工光照萎凋处理对茶叶萎凋叶的β-葡萄糖苷酶、多酚氧化酶、蛋白酶、主要品质成分及香气得分的影响,并与室内自然萎凋茶叶处理进行对比.结果表明,人工光照对茶叶萎凋叶酶活性的影响在处理3h时β-葡萄糖苷酶的活性最高,蛋白酶和多酚氧化酶活性均呈先增加后降低的趋势,蛋白酶在人工光照萎凋处理1h时最大,迭4.93 U/g (FW),此时的室内自然萎凋叶为4.33 U/g(FW),多酚氧化酶活性在处理4h时达最大值,为7.97 U/g (FW),此时的室内自然萎凋叶为5.05 U/g(FW);香气得分情况表明,人工光照萎凋叶香气得分均明显高于室内自然萎凋叶,以萎凋时间为4～6 h的香气得分最高,达到87.6,此时的室内自然萎凋叶为83.6.人工光照对茶叶萎凋叶主要品质成分的影响表现为茶多酚、可溶性糖含量持续下降,氨基酸含量增加,咖啡碱含量无明显变化.     

百草枯对土壤中蛋白酶和过氧化氢酶活性影响研究

［目的］研究百草枯对土壤中蛋白酶和过氧化氢酶活性的影响。［方法］设4个百草枯处理水平,分别于培养2、6、12、20、30、45和60 d时取样测定蛋白酶和过氧化氢酶的活性。［结果］1 000 μg/g百枯草处理的酶活性低于其他4个处理。100 μg/g百枯草处理的蛋白酶活性的最低值出现在第20天,其余3个百草枯处理的蛋白酶活性的最低值均出现在第12天。1 000 μg/g百枯草处理的蛋白酶抑制率在第20天达51.08%,在第60天为41.48%。200、500和1 000 μg/g百枯草处理均不同程度地抑制过氧化氢酶活性,且其抑制作用随着百草枯浓度的增加而增强。1 000 μg/g百枯草处理对过氧化氢酶的抑制率在第12天达66.18%,在第60天为39.18%。［结论］百草枯对土壤中蛋白酶和过氧化氢酶的活性有较大的影响。     

高产蛋白酶P5菌株的纯化及酶学性质

对高产蛋白酶细菌P5菌株发酵产生的蛋白酶进行初步分离纯化并研究其酶学性质。结果表明,硫酸铵饱和度为70%时,酶活性达到最高(310.44U/mL);该酶最适反应温度为40℃,在35～40℃保温5h,酶活性基本没变化;酶反应最适pH值为7.0,酶活性在pH值6.0～7.5时比较稳定。K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+对酶活性有促进作用,Na+对酶活性基本没有影响,Hg2+和Mn2+对酶活性有抑制作用,其他金属离子对酶活性的影响随离子浓度的不同而不同。     

曲霉型豆豉用高产蛋白酶菌种的选育

从曲霉型阳江豆豉曲中筛选出5株菌落形态不同的曲霉(Aspergillus spp.),通过纯种发酵制备豆豉曲,测定了豆豉曲中碱性蛋白酶和中性蛋白酶的活性,从中筛选出1株蛋白酶活性较高的菌种,并对该曲霉进行ITS r DNA序列分析,发现该曲霉与Aspergillus oryzae strain P6B2(JX429926)的同源性最高,故鉴定为米曲霉(Aspergillus oryzae).以该米曲霉为出发菌株,通过紫外线诱变和硫酸二乙酯化学复合诱变处理,选育得到优良高产蛋白酶活性的突变株,其中性蛋白酶酶     

山西老陈醋大曲微生物生态分布

应用微生物学的方法,对山西老陈醋大曲进行了微生态研究。试验结果表明,山西老陈醋大曲具有独特的微生物分布。山西老陈醋大曲中心毛霉为主,多达1 4×108g/曲,有少量红曲霉,3 1×106g/曲,假丝酵母和汉逊酵母较多,分别为8 72×107g/曲、8 71×107g/曲;山西老陈醋大曲边角犁头霉和毛霉为主,分别为2 84×108g/曲、3 72×108g/曲,假丝酵母、汉逊酵母、拟内孢霉也较多,分别为4 02×107g/曲、3 89×107g/曲、5 19×107g/曲,醋酸菌也较多,6 91×105g/曲;山西老陈醋大曲表面毛霉、犁头霉为主,分别为2 23×108g/曲、2 19×108g/曲,假丝酵母较多,1 33×108g/曲,醋酸菌在表面最多,可达7 83×107g/曲。研究还发现:大曲由里向外,微生物群体死亡率呈下降趋势、有害霉菌污染程度呈上升趋势,乳酸菌、芽孢细菌呈下降趋势。     

枯草芽孢杆菌固态发酵麻疯树废弃饼粕产蛋白酶初步研究

为寻找出麻疯树制备生物柴油后废弃饼粕合理利用的有效途径,利用枯草芽孢杆菌作为发酵菌株,以提油后的麻疯树饼粕作为培养基,采用固态发酵方式进行产蛋白酶试验.结果表明:控制培养基相对湿度为150%,37℃下发酵2 d,蛋白酶产量达到3 284 U/g;向培养基中添加15%葡萄糖,则蛋白酶产量达到12 108 U/g,比对照组提高3.6倍;向培养基中添加氮源后,蛋白酶产量反而下降.     

响应面法优化脱酚棉籽蛋白双酶水解的工艺条件

研究Alcalase水解蛋白酶和Flavourzyme风味蛋白酶分步水解脱酚棉籽蛋白的最佳条件。以水解度为评价指标,采用Plackett-Burman(PB)设计和Box-Behnken响应面分析法对影响双酶分步水解棉籽蛋白的9个工艺条件进行筛选优化。双酶分步水解脱酚棉籽蛋白的最优操作条件为：先用Alcalase水解蛋白酶在底物浓度(w/v) 9.66%,温度60.5℃、pH 8.0、酶用量25000 U/g的条件下水解150 min,灭酶后再用Flavourzyme风味蛋白酶在温度50℃、pH 6.0、酶用量26576 U/g的条件下水解120 min。在此条件下水解液的水解度可达到42.73%。试验结果可为棉籽蛋白多肽的开发利用提供依据。     

高温大曲中高产糖化酶菌株的筛选鉴定及固态发酵条件优化

对高温大曲中高产糖化酶菌株进行分离和鉴定,并对筛选得到的菌株进行发酵条件的优化。结果表明:试验前期获得的8株产酱香菌株中GX06菌株产糖化酶能力最强,同等条件下其糖化酶活力为706.13 U/g;通过形态观察及16S r DNA序列同源性分析,初步鉴定该菌株为Bacillus cereus;通过单因素和正交试验确定该菌株的最佳产酶条件为:以尿素为最佳氮源,以麸皮为最佳碳源,初始p H值6.0,接种量9%,在50℃下发酵70 h后,其产物糖化酶活性可达917.03 U/g。     

复合酶分步水解鸭血工艺的研究

鸭血是家禽屠宰业的主要副产物之一,富含蛋白质和血红素铁等多种营养成分,开展鸭血的综合利用研究具有重要意义。本实验确定了先木瓜蛋白酶水解再风味酶水解的复合酶分步水解工艺。其最佳工艺参数为:先用木瓜蛋白酶在温度60℃、加酶量6000 U/g底物、底物浓度6%(w/v)、pH 6.0的条件下水解1 h,再用风味酶在加酶量6000 U/g底物、温度40℃、pH 6.0的条件下水解2 h,风味酶分两次加入,前1 h加入一半的酶,后1 h加入另一半的酶,在此条件下水解液中氨基酸百分含量可达16.23%。