棉花GhCYSTM9基因的克隆及在非生物胁迫下的表达分析

CYSTM是真核生物中广泛存在的一类小分子蛋白,其在细胞信号转导、逆境防御反应中发挥着非常重要的作用。为了研究CYSTM基因在棉花非生物胁迫响应中的功能,本研究利用RT-PCR方法从陆地棉中克隆了GhCYSTM9基因。该基因c DNA全长237 bp,编码78个氨基酸,所编码蛋白具有一个C端保守的富含半胱氨酸的TM螺旋和特异的N端胞质元件。多重比对发现,GhCYSTM9与拟南芥CYSTMs具有较高的相似度,其中与AtCYSTM9 (NP566703.4, AT3G22240.1)序列一致性最高,达68.33%。荧光定量PCR分析其组织表达特性发现,GhCYSTM9基因在雄蕊、花瓣、根和花萼中显著高表达,在叶片、茎和雌蕊中表达量较低。进一步研究发现,GhCYSTM9基因的表达受到低温、干旱和盐胁迫的诱导,在胁迫处理下,其表达水平均呈现显著的上调表达。非生物胁迫下的基因表达分析结果显示,该基因在棉花非生物胁迫响应中有重要作用。本研究为进一步开展GhCYSTM9基因功能研究奠定了理论基础。     

番茄SlETR6基因的克隆及非生物胁迫下的表达分析

为解析番茄乙烯受体基因SlETR6在非生物胁迫过程中的功能。以番茄为材料,克隆了番茄SlETR6基因,利用MEGA 5. 0软件对SlETR6基因编码的蛋白进行了聚类分析,并利用实时荧光定量PCR分析了SlETR6基因在番茄根、叶、花、果实不同发育时期的组织表达情况及对其在高盐、高温(40℃)、低温(4℃)、干旱胁迫条件下的表达模式。结果表明,SlETR6基因开放阅读框(Open reading frame,ORF)为2 265 bp,编码754个氨基酸,蛋白质分子质量为85. 05 ku,等电点为7. 28,与马铃薯St ETR-like蛋白的同源性最高;启动子分析显示,SlETR6基因含有热胁迫、干旱胁迫、低氧胁迫、光响应、乙烯、水杨酸及赤霉素应答等相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,SlETR6在番茄不同组织中均有表达,且在花和转色期果实中有显著高表达。高盐胁迫6 h后,SlETR6基因呈现上调表达,12 h后达到峰值,而后回复正常表达水平;高温胁迫后,SlETR6基因表达量有明显的上升趋势;干旱胁迫早期SlETR6基因应答强烈,在胁迫处理1 h后表达量达到峰值。因此,推测SlETR6基因可能在番茄适应高盐、高温、干旱等逆境胁迫过程中发挥重要作用,可能参与番茄生长发育过程中的逆境调控。为番茄抗逆研究提供了新的候选基因资源。     

桂花多酚氧化酶(PPO)基因的克隆及表达分析

为阐明桂花PPO基因在其代谢活动及经济性状形成过程中可能发挥的作用,本研究综合运用RT-PCR、RACE、生物信息学和荧光实时定量方法,从桂花花瓣中克隆出了多酚氧化酶(PPO)基因,并证实本实验所克隆的基因(长1 866 bp)是PPO基因家族的成员之一;荧光实时定量分析其时空表达发现PPO基因在幼根中表达量最高,花瓣、花梗中较低,当年生革质化叶片中表达量最低,而且PPO基因在开花过程中的表达谱变化趋势呈"高-低-高"。综上所述,桂花PPO基因的时空表达谱揭示了该基因的表达水平与器官的发育阶段、组织类型密切相关。     

棉花亲环素基因(GhCYP1)克隆及在干旱胁迫下的表达分析

本研究从已构建的棉花(Gossypium hirsutum)干旱胁迫抑制性差减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)cDNA文库分离得到一个含有植物亲环素保守结构域的EST片段,测序并结合cDNA末端快速扩增(5'-RACE)技术获得了1个779bp的cDNA序列。序列分析表明,该cDNA5'非翻译区为70bp,3'非翻译区为187bp,并含有一个编码174个氨基酸蛋白的开放阅读框。Blast分析表明,该基因的编码产物为一个亲环素蛋白,将该基因命名为为GhCYP1,序列提交到GenBank,登录号为GQ292530。半定量RT-PCR分析表明,干旱胁迫处理后,该基因在叶片中的表达量迅速提高,并在胁迫2h达到最高,这一研究暗示该基因的表达与棉花抗旱胁迫相关。     

棉花SNC2基因的克隆及表达分析

以陆地棉(Gossypium hirsutum)TM-1为材料,利用同源克隆技术从棉花中分离出SNC2基因,以actin基因为内参,采用半定量RT-PCR分析该基因在棉花组织中的表达,并采用实时定量RT-PCR分析不同棉花品种经大丽轮枝菌侵染后,SNC2基因在不同时段、不同组织的表达水平。研究分析发现该基因CDS序列长度为1 308 bp,编码435个氨基酸,蛋白的等电点(p I)为6.98,理论分子量为46.93 k D,命名为SNC2,Gen Bank登录号为AOO35322.1,SNC2基因编码多肽链中包含信号肽和跨膜结构域,且亚细胞定位于质膜,编码受体类蛋白。组织表达分析显示SNC2基因在根、侧根、茎、叶和花中均有表达,茎中的表达量较高,而在苞片组织中基本不表达。该基因在接菌后的感病品种军棉1号的根和耐病品种中棉49号的茎中呈现不断上升的趋势,而在两个棉花品种的其他组织中呈现出"升-降-升"的趋势,且在不同抗性的棉花品种中的表达存在差异,暗示SNC2基因可能在不同抗性品种抵御生物胁迫过程中扮演重要角色,研究结果为进一步研究SNC2基因的功能及应用该基因提供帮助。     

非生物胁迫下白桦ERF基因的表达及生物信息学分析

本研究对3个白桦AP2/ERF家族基因进行了生物信息学分析,并研究了盐和干旱胁迫下白桦ERF基因的表达模式。结果表明,bERF1和bERF2蛋白定位在细胞核内,而bERF3蛋白则定位在叶绿体上;三个基因都含有磷酸化位点;bERF1、bERF2和bERF3基因都属于ERF家族的ERF亚家族,bERF1和bERF2属于B-1组,与拟南芥的AT1G28360.1同源性最高,B-1组的拟南芥ERF基因都属于转录抑制子,说明bERF1和bERF2基因可能具有转录抑制作用;bERF3属于B-5组,与拟南芥的AT4G11140.1同源性最高。3个ERF基因都可以响应盐和干旱胁迫,并且在不同组织中表达量存在差异。     

杜鹃bHLH转录因子RsMYC2的克隆及在非生物胁迫下的表达分析

杜鹃是杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃属(Rhododendron)著名花卉植物,被广泛应用于园林绿化中。杜鹃不仅具有较高的观赏价值,还能食用和药用,具有很高的经济价值。bHLH转录因子家族成员MYC2在植物生长发育、防御反应、逆境响应等过程中发挥重要作用,但该基因在杜鹃中的研究几乎处于空白状态。本研究克隆了杜鹃RsMYC2基因全长编码序列,并对其理化性质及氨基酸序列进行了分析。结果表明,RsMYC2编码氨基酸总量为644个,平均分子量为70.78 kD,理论等电点为5.76,所带阴电残留物数量为81,阳电残留物数量为69。Rs MYC2蛋白含有高度保守的结构域,具有典型的bHLH蛋白家族特征。RsMYC2蛋白和大多数植物中MYC2蛋白一样,属于亲水性蛋白质,不含信号肽,不属于分泌蛋白,定位在细胞核。系统进化分析显示,杜鹃RsMYC2与褐枝猕猴桃ArMYC2同源性最高。本研究也采用实时荧光定量PCR分析了RsMYC2在各种非生物胁迫中的反应,结果显示茉莉酸甲酯、赤霉素和干旱处理抑制RsMYC2基因表达,而高温可显著诱导RsMYC2基因表达,表明杜鹃RsMYC2可响应多种非生物胁迫。本...     

大豆转录因子基因GmDof3的克隆及非生物胁迫诱导表达分析

植物Dof (DNA binding with one finger)转录因子在植物应对非生物胁迫过程中发挥重要作用。为了探索大豆Dof转录因子与非生物胁迫的关系,本研究利用RT-PCR技术克隆了一个大豆中Dof转录因子基因GmDof3。GmDof3编码含有483个氨基酸残基的蛋白质,分子量为52.91 kD,等电点为8.11。蛋白结构预测发现,该蛋白含有一个典型Dof结合域,定位于细胞核中且含有大量磷酸化位点。进化分析表明大豆GmDof3蛋白与木豆CcDof3蛋白的同源性最高。顺式作用元件预测结果显示,GmDof3启动子序列中含多种逆境响应元件。实时荧光定量PCR表明,高盐、干旱、低温和高温均可诱导GmDof3的表达。本研究结果可以为大豆Dof转录因子在植物抗逆基因工程中的应用提供理论依据。     

苎麻ACC氧化酶基因(BnA CO2)的克隆、时空表达及原核表达分析

ACC氧化酶(ACC oxidase, ACO)是乙烯合成途径中的一个关键酶。本研究通过RT-PCR结合RACE技术克隆得到一个ACO基因,命名为Bn ACO2,该基因cDNA序列全长为1 377 bp,开放阅读框为957 bp,编码318个氨基酸多肽,预测其分子量和等电点(pI)分别为36.145 kD和5.60。生物信息学分析表明,BnACO2编码蛋白没有信号肽和跨膜结构域,亚细胞定位于细胞质。与川桑等物种ACC氧化酶基因核苷酸序列同源性在83%以上,氨基酸序列同源性在87%以上。通过系统发育树发现该基因和山黄麻、大麻ACO基因亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,苎麻Bn ACO2基因在苎麻各部位均有表达,特别是在雌花花芽中表达显著。最后成功构建原核表达载体p QE-Bn ACO2,诱导表达出的目的蛋白分子量大小约为36.15 kD,与预测的蛋白大小一致。这为进一步研究BnACO2基因的功能提供了科学依据。     

非生物胁迫下黄瓜(Cucumis sativus)四个自噬基因的表达及生物信息学分析

自噬是一种存在于真核生物中进化保守的分解代谢过程,在植物处于逆境胁迫以及生长发育受阻时起到至关重要的作用。通过水杨酸诱导,从黄瓜中分离出四个自噬基因:ATG8C1、ATG8C2、ATG8F、ATG8C,为揭示这些自噬基因在非生物胁迫下的作用,本研究选取黄瓜幼苗为试材,分别进行以下激素和胁迫处理,并用qRT-PCR检测基因的表达:(1)用10 mmol/L SA和0.2%MeJA滴加叶片进行激素诱导处理,于0 h、6 h、9 h和24 h在滴加的位置取材;(2)用200 mmol/L NaCl进行盐胁迫处理,用20%PEG6000进行干旱胁迫处理,于0 h、6 h和24 h取黄瓜幼苗的根、茎和叶;(3)用黑暗进行碳饥饿处理,于0 h、6 h和24 h取黄瓜幼苗的根、茎和叶。结果表明,在SA和Me JA处理下,黄瓜四个自噬基因都呈现上调表达;在盐和干旱处理下,四个自噬基因的表达有所不同,在黄瓜根和叶中基本呈现上调表达,在茎中多数呈现下调表达。在碳饥饿处理下,四个自噬基因呈现大幅度上调表达。该结果说明在不同的胁迫下,自噬的发生途径有所不同。本研究还利用ExPasy在线工具ProParam和ProtScale分析了四个自噬蛋白的氨基酸、理论分子量和等电点等理化参数,利用MEGA5软件建立了系统进化树,对四个自噬基因进行了初步的生物信息学分析。通过以上试验可以为进一步研究黄瓜自噬基因参与植物抗逆胁迫提供分子生物学的理论基础。     

非生物胁迫诱导的GmMYB的克隆与表达分析

本研究室根据一段抗逆的EST序列, 从栽培大豆东农42中克隆到4个开放阅读框均是外显子和内含子间隔构成的R2R3-MYB基因, 其中Gm02g01300、Gm03g38040和Gm10g01340与已公布的Willams 82基因组序列完全一致, Gm19g40650第375位的单核苷酸突变导致多肽链第125位的氨基酸发生置换(GAG³⁷⁵→GAC³⁷⁵, E¹²⁵→D¹²⁵)。以人工气候箱内模拟非生物胁迫(盐、碱、干旱和低温)处理栽培大豆东农42芽期, 选择适宜时间点, 采用荧光定量PCR技术, 检测R2R3-MYB基因的表达。结果表明, 4个基因的表达水平都存在明显波动, 呈诱导后短暂上调或下调两种表达模式, 但表达时间、强度和趋势存在明显差异; Gm02g01300受干旱诱导明显, Gm03g38040受多种胁迫条件诱导表达强烈, 推测这些基因在大豆非生物胁迫的调控中起到重要作用; 另外, 在子叶与胚间, 单个基因的表达也存在差异; 多种非生物胁迫条件下, 基因的表达不仅存在时空差异, 可能也具有调控模式的差异。     

糜子 PmLEA1 基因的克隆及其在非生物逆境胁迫下 的表达模式分析

LEA 蛋白是一类逆境胁迫下诱导产生的蛋白,为了解糜子 PmLEA1 基因在逆境中的作用,从河曲红糜子中克隆出PmLEA1 基因,利用生物信息学方法预测并分析 PmLEA1 蛋白的性质和结构特征。结果表明,糜子 PmLEA1 基因全长 549bp,编码蛋白的分子量为 17863.57Da,氨基酸数目为 182 个,二级结构以无规则卷曲为主,属亲水性蛋白,其蛋白序列与柳枝稷 LEA 蛋白序列的同源性最高,无跨膜转运信号,不是膜上受体。实时荧光定量 PCR 结果表明,PEG-6000、NaCl、甘露醇、ABA、GA、H2O2、IAA、MeJa、SA胁迫下的PmLEA1基因相对表达量均发生不同程度的变化;各胁迫下PmLEA1基因的相对表达量变化在根中最大,叶片次之,茎中相对变化最小,且表达量总体上呈现先升高后降低的变化趋势;PEG-6000 胁迫下 PmLEA1 基因的相对表达量变化量大。上述结果说明,糜子 PmLEA1 基因参与了抗旱调控和不同激素信号传导过程。研究结果为糜子的遗传改良提供了优良的抗旱基因,并为其他禾本科作物 LEA 基因的挖掘提供了研究思路。     

谷子PPDK2在非生物逆境胁迫下的表达分析

谷子是具有抗旱、耐瘠、抗逆性强、适应性广等特点的C₄禾本科作物,发掘谷子高光效、逆境相关基因,旨在揭示谷子在光照和逆境胁迫下的基因表达特征。采用生物信息学方法,在谷子中鉴定出一个PPDK基因,命名为SiPPDK2;该基因位于谷子3号染色体,含有18个内含子,有3个转录本,原始转录本编码945个氨基酸。亚细胞定位预测结果显示,该基因位于叶绿体中。功能域分析和多序列比对发现,SiPPDK2蛋白与玉米、高粱和水稻PPDK蛋白的亲缘关系较近。Real-time PCR分析表明,PEG、ABA、盐和低温胁迫对苗期SiPPDK2基因表达有不同程度的诱导。进一步研究表明,SiPPDK2基因在拔节期、抽穗期和灌浆期均参与了对干旱和光照的胁迫响应,其中抽穗期和灌浆期在干旱条件下及拔节期和灌浆期在弱光条件下其表达量显著上调。顺式元件分析结果表明,在SiPPDK2启动子区域主要包括激素类应答、逆境应答、光应答以及其他类生长调控相关的顺式元件。结果推测,SiPPDK2基因可能参与了谷子对非生物逆境胁迫的响应。     

花生水孔蛋白基因(AhAQ1)的克隆及盐胁迫下的表达分析(英文)

水孔蛋白的主要作用是控制植物体内的水分运输,在植物盐胁迫调节中也起作用。本研究采用RT-PCR的技术,从盐胁迫的花生叶片中克隆了水孔蛋白基因AhAQ1。AhAQ1编码一个由287个氨基酸残基组成的蛋白质,推测的蛋白质相对分子质量为30.57kD,等电点为9.04。序列分析表明AhAQ1具有6个跨膜区和2个NPA框。系统发生分析显示AhAQ1与PIP1家族聚为一类。高盐处理花生组织后,用半定量RT-PCR进行分析,结果表明,AhAQ1转录水平的表达受盐胁迫诱导,推测花生AhAQ1在应答盐胁迫反应中可能发挥作用。     

芒果多胺氧化酶2(MiPAO2)基因克隆表达分析与沉默和过量表达载体的构建

本研究以芒果果皮为材料探究多胺(PAs)和多胺氧化酶2(PAO2)对芒果果实抗逆性的作用机理。多胺(PAs)如腐胺(Put)、亚精胺(Spd)、精胺(Spm)是无处不在的聚阳离子,在不同的细胞代谢过程具有广泛的功能。多胺氧化酶2(polyamine oxidase 2,PAO2)是真核生物多胺分解代谢途径中的关键酶。本研究根据转录组测序得到芒果PAO2部分片段信息设计兼并引物,采取3'和5'cDNA末端快速克隆(RACE)的技术方法,分别在三个不同着色芒果品种(红色‘贵妃’品种,黄色‘金煌’品种,绿色‘桂七’品种)中进行PAO2基因全长cDNA序列的扩增,克隆得到了芒果果皮PAO2基因的全长cDNA序列命名为MiPAO2。结果发现三个着色品种cDNA序列只有几个碱基的差异,以红色‘贵妃’品种为例分析可得全长cDNA序列为1 542 bp,开放阅读框为1 209 bp,编码402个氨基酸,分子重量为43.93 kD,等电点为5.60,定位于过氧化物酶体。通过生物软件预测得到了三种三级蛋白结构图。对NCBI上刊载的30种不同植物构建系统发育树发现该基因编码的蛋白与枳的亲缘关系比其他植物物种的亲缘关系近。为深入探究MiPAO2基因在多胺分解代谢过程中的作用,本研究成功构建出MiPAO2-pTRV2基因沉默载体和MiPAO2-pGreen II 62-SK基因过量表达载体,为后续研究MiPAO2基因在芒果果实的抗盐、抗寒以及抗虫过程中的作用机理提供理论依据。     

棉花ADP-ribosylation factor基因(GhARF1)的克隆与表达分析

ADP-ribosylation factor (ARF)是GTP结合蛋白,属于小G蛋白超家族中的ARF亚家族成员,在高尔基体小囊泡形成以及细胞信号传导中起重要作用。棉花纤维的发育需要有高尔基体参与,但ARF基因在棉花纤维发育中的功能尚不清楚。本文利用GHA27作探针,筛选棉花花药的cDNA文库,得到两个序列相同的阳性克隆。核苷酸序列分析表明该基因编码一个有181个氨基酸残基,分子量约20.7 kDa的蛋白,与动物、酵母及其他植物的ARF基因有很高的相似性,命名为GhARF1。采用PCR技术获得该基因序列,该基因含有5个外显子和4个内含子。进化树分析表明该基因更接近人类的classⅠ类ARF基因,在编码的氨基酸序列中具有保守的GTP结合区域,即P（GLDAAGKT）、G（NKQD）以及G’（DVGGQ）。Northern杂交结果显示GhARF1基因在棉花的纤维、花冠和根中表达量较高,特别是在纤维中的表达量最高,在茎、花蕾中也有表达,而在真叶、子叶和胚珠中的表达较微弱。Southern杂交分析表明,ARF基因在二倍体草棉和四倍体陆地棉基因组中均以多拷贝存在。     

辣椒CaWRKY13基因克隆及非生物胁迫下表达分析

WRKY转录因子是植物界中存在的一类较大的基因家族,参与植物在生物和非生物逆境胁迫中的多种应答。为了研究在低温、高温和盐等非生物胁迫对辣椒CaWRKY13基因表达的影响,以豫椒101为实验材料,在对辣椒CaWRKY13基因克隆的基础上,利用生物软件对其编码蛋白进行分析和构建进化树。结果表明,同源扩增获得的序列含有一个702 bp完整ORF框;对其编码蛋白分析发现,只含有一个WRKY结构域,属于WRKY13家族。亚细胞定位在细胞核中,分子进化树表明与茄属亲缘关系最近,相似性达到92%。荧光定量PCR分析表明,与对照相比,低温、高温和盐等非生物胁迫都能诱导CaWRKY13基因表达,表明CaWRKY13基因在应对低温、高温和盐等非生物胁迫方面具有重要作用。     

非生物胁迫下海马齿SpSOS1基因的表达及响应ABA模式分析

为分析盐生植物海马齿(Sesuvium portulacastrum L.)SpSOS1基因的表达模式,本研究利用实时荧光定量PCR技术分析SpSOS1在海马齿不同组织以及不同胁迫条件下的表达情况.空间表达模式分析表明,SpsOS1在海马齿根中表达量最高,在花中的表达量最低.不同胁迫条件下SpSOS1基因的表达分析表明...