棉花抗枯萎病相关转录因子基因GhERFB101的克隆与表达分析

为了探究ERF转录因子家族与棉花枯萎病抗性之间的关系,也为海岛抗枯萎病品种的选育工作提供新的基因资源,从Solexa高通量测序技术建立的棉花基因表达谱中筛选探针序列,通过电子克隆结合RT-PCR技术从高抗枯萎病的棉花品种中棉所12中克隆到一个新的ERF-B1亚组转录因子基因,命名为Gh ERFB101(Gen Bank:KF850521)。序列分析表明,该基因开放阅读框738 bp,编码245个氨基酸,含有一个保守的AP2/ERF结构域,在进化上与拟南芥At ERF11的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,枯萎病菌诱导后,Gh ERFB101基因在抗病品种根中的表达量呈现下降趋势;而在感病品种中,该基因呈上调表达,随着病菌处理后时间延长,其表达量呈现先增加后降低的变化趋势,在病菌处理后12 h表达量达到最大,在48 h下降到最低。乙烯和茉莉酸诱导后,该基因表达量均呈现明显的先增加后降低的变化趋势,在乙烯处理后2 h基因的表达量达到最大;茉莉酸则在处理后1 h基因的表达量达到最大;而水杨酸诱导后基因的变化幅度不大;推测该基因可能通过茉莉酸、乙烯信号传导途径参与对枯萎病菌的防御反应。     

棉花抗枯萎病相关基因GhWRKY48的克隆及表达分析

棉花枯萎病是影响棉花产量和品质的最重要病害,WRKY转录因子在植物抗病中扮演重要角色。本实验以高抗枯萎病的陆地棉‘中棉所12’为实验材料,以枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱中筛选得到WRKY基因片段为探针,从陆地棉‘中棉所12’根部c DNA中克隆WRKY转录因子基因。通过多序列比对分析发现该基因属于第Ⅱ类WRKY转录因子家族,将该基因命名为GhWRKY48。GhWRKY48基因的序列分析发现,cDNA全长为1 074个核苷酸,编码了357个氨基酸,蛋白分子量为3.94 kD,脂肪指数为56.86,等电点6.20,含有1个WRKY结构域及1个C2H2型锌指属于疏水蛋白。基因的蛋白二级结构包括延伸链、α螺旋和无规则卷曲。通过RT-qPCR的结果发现,枯萎病菌处理后,GhWRKY48的基因表达量显著低于对照组,预测该基因可能参与棉花抗枯萎病反应体系。本研究结果为棉花抗枯萎病提供一定的研究思路与途径。     

棉花ERF-B3亚组转录因子基因GhERF5-3的克隆及表达

植物在受到病原菌侵染时,ERF转录因子被诱导调控抗病相关基因的表达。为了研究棉花AP2/ERF-B3类转录因子在棉花抗病调控中的作用,用电子克隆及RT-PCR技术,从陆地棉抗枯萎品种‘中棉所12’根部c DNA克隆得到一个新的ERF转录因子Gh ERF5-3(登录号:MF197875)。利用q RT-PCR检测枯萎病及不同激素处理后该基因的表达。结果表明:其c DNA全长为672 bp,编码223个氨基酸,分子量24.95 k D,等电点为9.04,含有一个典型的保守AP2结构域,通过进化树分析属于B3亚组。枯萎病菌侵染后,随着侵染时间的延长,Gh ERF5-3基因呈现出先增后降的趋势,在24 h时间点,其相对表达量达到峰值;ET和Me JA处理后,Gh ERF5-3基因呈上调表达。SA处理后为下调表达。推断Gh ERF5-3基因响应枯萎病菌。     

棉花GhTGA1与GhTGA9.2基因克隆及表达特征分析

为了揭示棉花GhTGA1与GhTGA9. 2基因的生物学功能,利用RT-PCR技术,从抗枯萎病棉花品种中棉所12号中克隆了TGA转录因子基因GhTGA1与GhTGA9. 2。生物信息学分析表明,2个基因开放阅读框(ORF)长分别为1 281,1461 bp,分别编码405,486个氨基酸。序列分析表明,2个基因均含有b ZIP和DOG1结构域,属于b ZIP亚家族TGA转录因子基因。利用实时荧光定量(qRT-PCR)技术进行表达特征分析表明,GhTGA1基因能被枯萎病菌、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)诱导上调表达,水杨酸(SA)诱导后,在各处理时间点,该基因表达量均低于Mock,以上结果表明,GhTGA1基因可能通过参与乙烯(ET)和茉莉酸(JA)信号通路调控棉花对枯萎病的抗性;枯萎病处理后,GhTGA9. 2基因在各时间点表达量均低于Mock,呈下调表达,但能被激素(ET、JA、SA)诱导上调表达。结果表明,GhTGA9. 2基因可能通过激素(ET、JA、SA)途径参与胁迫应答,通过对GhTGA1与GhTGA9. 2基因表达特征分析为后续研究提供基础。     

枯萎病菌诱导感、抗陆地棉品种的转录因子表达变化

以陆地棉抗病品种中棉所12和感病品种新陆早7号为材料,利用Solexa高通量测序技术调查枯萎病菌诱导后不同时间感、抗陆地棉品种转录因子家族及转录因子的表达情况。结果表明,枯萎病菌诱导后,抗病品种中棉所12有39个转录因子家族的433个转录因子在至少一个比对组中表达活性发生变化;感病品种新陆早7号则有52个转录因子家族的588个转录因子在至少一个比对组中表达活性发生变化。新陆早7号对枯萎病菌响应的转录因子及转录因子家族的数目明显多于中棉所12,且2个品种的下调基因数目均多于上调基因。随着枯萎病菌诱导后时间延长,两品种对枯萎病菌诱导响应的转录因子家族及转录因子数量均呈现先增加后降低的变化趋势,中棉所12在枯萎病菌诱导后6 h达最多,而新陆早7号在诱导后3 h达最多。在6个比对组中,表达活性均发生变化的重叠转录因子,中棉所12中有9个,隶属于6个转录因子家族;新陆早7号中有31个,隶属于17个转录因子家族。不同抗病性品种对枯萎病的响应有较强的品种特异性,除37个共有的转录因子家族外,2个转录因子家族是中棉所12所特有,15个转录因子家族是新陆早7号所特有。     

海岛棉枯萎病抗性与糖基转移酶类基因表达量的相关性

枯萎病是危害海岛棉生产的重要因素之一，研究枯萎病抗性分子机制是培育抗病海岛棉品种的分子基础。基于对前期转录组测序数据分析，本研究对参与海岛棉抗枯萎病调控的糖基转移酶基因进行了初步研究，以8个不同抗病性的海岛棉品种为材料，在枯萎病菌处理后，利用实时荧光定量PCR检测9个棉花抗枯萎病相关基因进行表达量分析，结果表明，GB＿A03G0575在海岛棉枯萎病侵染过程中随着时间的推移，表达量会先减少再增加，推断其可能在受到病菌胁迫时植物生长会受到影响。GB＿A13G1825和GB＿A11G1787基因在抗病材料中的表达量会比感病材料的多，最大表达量出现的时间，感、抗材料基本一致，推测这些基因对抗病有一定影响，表明在抗病过程中三个基因可能起着比较重要的作用。本研究结果为海岛棉抗枯萎病育种及抗病机理提供候选基因资源。     

小麦白粉病菌诱导的TaWRKY34基因的鉴定与分析

WRKY转录因子在植物抗病防卫反应中发挥重要作用。利用cDNA宏阵列(macroarray)和RT-PCR相结合的方法,从小麦全长cDNA文库的WRKY转录因子中筛选出一个应答小麦白粉病菌胁迫的TaWRKY34转录因子,该基因编码464个氨基酸。染色体定位分析表明,该转录因子位于小麦第一同源群染色体的短臂上,并且只在细胞核中表达。其蛋白序列与拟南芥、大麦和葡萄抗病相关WRKY转录因子的亲缘关系较近,与其中的3个WRKY基因具有相似的表达模式。TaWRKY34在Pm16/北京8377抗白粉病近等基因系中,对小麦白粉病菌、水杨酸和茉莉酸诱导的表达模式存在差异。TaWRKY34可能与小麦对白粉菌的抗性有关。     

棉花WRKY22基因分离及其对黄萎病的抗性分析

为了克隆棉花抗黄萎病相关基因,利用生物信息学、病毒诱导基因沉默技术(VIGS)、实时定量PCR(q PCR)和接菌分析来研究棉花WRKY基因对大丽轮枝菌的诱导响应和抗性。结果从棉花中筛选出8个与拟南芥直系同源的棉花抗病相关WRKY基因,这些直系同源WRKY基因表达受到大丽轮枝菌浸染诱导响应。其中有6个GhWRKY基因的表达均受到大丽轮枝菌诱导上调,而GhWRKY70和GhWRKY48的表达量随着不同的时间点呈现上调或下调。GhWRKY22等5个基因表达量在24,72 h分别表现为上调,呈现出双峰曲线。对GhWRKY22表达特征进一步分析,结果显示,GhWRKY22基因在茎里优势表达,同时表达受到大丽轮枝菌、水杨酸和茉莉酸激素的诱导。GhWRKY22基因沉默植株对大丽轮枝菌的敏感性增加,抗病标志基因(PR1、PR3、PR4、PR5、PAL和PDF1. 2)表达量也显著降低,揭示GhWRKY22是通过SA和JA信号途径参与棉花对大丽轮枝菌的响应过程。总之,棉花中8个WRKY基因参与棉花对黄萎病抗性调控,其中GhWRKY22基因正调控棉花的抗性,可作为棉花抗病育种的候选基因。     

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。     

β-氨基丁酸早期诱导表达基因StWRKY5参与马铃薯晚疫病抗性

β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid,BABA)诱导能够增强马铃薯对晚疫病的抗性。本研究从马铃薯中克隆了一个WRKY转录因子家族的基因St WRKY5。c DNA-AFLP表达谱研究表明,BABA(2 mmol/L)处理马铃薯6 h后该基因明显上调表达,晚疫病菌(Phytophthora infestans)接种16 h后上调表达。半定量RT-PCR检测表明水杨酸SA(10μmol/L)处理马铃薯离体叶片4 h后该基因上调表达,茉莉酸甲酯Me JA(50μmol/L)诱导12 h后开始表达,机械伤害处理24 h后,该基因表达也会增强,表明该基因参与多种生物和非生物因子的胁迫反应。通过稳定转化获得了超量表达St WRKY5的转基因马铃薯株系。采用离体叶片接种鉴定方法对转基因马铃薯株系晚疫病抗性进行了鉴定,研究结果显示接种4 d后超量表达转基因株系其病斑面积均显著小于对照,表明在马铃薯中超量表达St WRKY5提高了晚疫病抗性。     

陆地棉钙依赖蛋白激酶GhCDPK28-A10参与抗黄萎病的功能分析

【目的】解析GhCDPK28-A10在棉花黄萎病反应中的作用机制，并为棉花抗病育种提供基因资源。【方法】从棉花基因组数据库获得Gh CDPK28-A10基因同源序列，进行生物信息学分析。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法检测在经大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、茉莉酸甲酯(methyl jasminate,MeJA)、水杨酸(salicylic acid,SA)或H₂O₂处理的棉株中GhCDPK28-A10基因的表达量变化。通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术验证GhCDPK28-A10在棉花抗黄萎病中的作用。【结果】进化树和基因结构分析表明，陆地棉中GhCDPK28-A10的6个同源蛋白具有相似数量的基序和CDPK家族典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域；启动子区域的序列分析发现GhCDPK28-A10包含响应茉莉酸(jasmonic acid,J...     

枯萎病菌诱导感、抗陆地棉品种的基因表达谱分析

选用陆地棉抗枯萎病品种中棉所12和感枯萎病品种新陆早7号,利用Solexa高通量测序技术分析棉花幼苗受到枯萎病菌侵染后3 h和6 h根部组织的基因表达谱。中棉所12受病菌侵染后3 h与0 h相比,6 h与0 h相比以及6 h与3 h相比,分别鉴定出4447、5481和2559个差异表达基因;新陆早7号分别鉴定出8615、6727和2078个差异表达基因;2个品种比较,在3 h和6 h分别鉴定出1879个和500个差异表达基因。基因功能分析表明,差异表达基因划分为生物学过程、细胞组分和分子功能注释本体,并进一步细分为48个功能类别。代谢通路分析显示,中棉所12和新陆早7号在枯萎病菌侵染后的6 h与0 h相比鉴定出的代谢通路(Pathway)最多,均有126条;在枯萎病菌侵染后6 h,2个品种相比鉴定出的代谢通路最少,仅有89条。各个比对组的代谢通路涉及的基因可被划分为次生代谢产物的生物合成、多糖的生物合成和代谢、环境适应和免疫系统等13类。在环境适应和免疫系统分类中存在着植物与病原菌相互作用代谢通路,涉及到996个已知功能的差异表达基因,有444个基因上调表达,552个基因下调表达。其中,差异表达基因最多的是WRKY转录因子家族基因,其次为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因,而DNA损伤修复/耐受性蛋白,JAZ1、RAR1和RPM1互作蛋白,S位点的特异性糖蛋白S6前体以及钙牵引蛋白等6类基因参与该代谢通路的数目最少。最后随机抽取6个基因进行实时荧光定量PCR验证,其结果与测序结果一致。     

海岛棉转录因子基因GbMYB60的克隆、表达及其抗逆性分析

MYB转录因子是在真核生物细胞内广泛存在的一类转录因子蛋白,在植物的生长发育、代谢调节、抗病抗逆、以及激素介导的信号路径等方面都发挥着重要的作用。本研究从海岛棉品种海7124中克隆得到一个MYB转录因子基因,根据序列同源性和进化分析,将其命名为GbMYB60。该基因序列长990 bp,编码一个36.9 kD的R2R3类MYB转录因子蛋白。GbMYB60蛋白被特异地定位于植物细胞核。GbMYB60基因的表达水平较低,在真叶中优势表达,根系中表达量最低。该基因受甘露醇、NaCl、低温、高温等非生物逆境,以及脱落酸、乙烯利、茉莉酸甲酯和水杨酸等植物激素的诱导上调表达。利用病毒诱导的基因沉默技术在海岛棉中干涉GbMYB60发现,降低GbMYB60基因的表达水平,使棉花幼苗对高盐胁迫的耐受性降低;但GbMYB60干涉的植株在甘露醇溶液的处理下与对照植株并无显著的抗性差异。     

棉花GhTGA2.1基因的克隆表达及功能的初步分析

为了获得棉花GhTGA2.1基因并分析其生物学功能,本研究通过分析枯萎病菌诱导的棉花转录因子,获得1个TGA转录因子基因,命名为GhTGA2.1。该基因ORF全长为1 389 bp,编码462个氨基酸,序列比对发现GhTGA2.1具有碱性结构域(N-x7-R/K-x9)、亮氨酸拉链结构域(L-x6-L-x6-L)和1个保守的DOG1结构。Gh TGA2.1基因编码蛋白分子量为51.12 kD,理论等电点为7.88,为亲水的不稳定蛋白,二级结构主要为无规则卷曲和α螺旋。利用实时荧光定量RCR技术(RT-qRCR)分析基因表达水平,发现棉花枯萎病菌诱导GhTGA2.1基因的下调表达;经SA、JA和ET处理后,GhTGA2.1基因表达量相对于mock发生显著变化。为进一步研究该基因功能,构建GhTGA2.1基因过表达载体并进行烟草遗传转化,获得6株转GhTGA2.1基因阳性植株,其抗病相关基因NtPR1、NtPR5、NtNPR1和NtERF1表达量明显低于野生型株系,其中NtPR1和NtPR5的相对表达量下降幅度较大;而NtPR4和NtWRKY70的表达量升高,NtPR2的表达量较野生型没有...     

GhWRKY48负调控棉花对大丽轮枝菌的抗性

为了防治棉花黄萎病对棉花生产的危害,利用抗病基因培育抗病品种是最经济有效的方法。从陆地棉中克隆了1个WRKY转录因子基因,命名为GhWRKY48;其编码序列全长为882 bp,编码293个氨基酸残基,预测分子质量和等电点分别为32.68 ku和6.10。qPCR组织特异性表达分析结果表明,GhWRKY48在根、茎和叶中均表达,而在茎中为优势表达;同时GhWRKY48表达受到大丽轮枝菌、茉莉酸和水杨酸的诱导。通过病毒诱导基因沉默技术获得GhWRKY48基因沉默植株。对基因沉默植株接种大丽轮枝菌进行抗病性分析,结果显示,沉默植株的病株率和病指均低于对照植株,表明沉默GhWRKY48基因能够提高棉株抗病性。综上所述,GhWRKY48是一个负调控转录因子,抑制下游抗病基因的表达,从而参与棉花对大丽轮枝菌的抗性;因此,GhWRKY48基因可以作为一个理想的候选基因用于棉花的抗病育种。     

植物生长调节剂与杀菌剂互作防治棉花枯萎病及增效作用探究

本实验旨在筛选出能有效防治棉花枯萎病的植物生长调节剂与杀菌剂组合，并探究其增效机理，为植物生长调节剂与杀菌剂互作防治棉花枯萎病提供技术指导和理论依据。通过室内毒力测定挑选EC₅₀最小的2种杀菌剂；通过种子活力和分生孢子萌发实验确定植物生长调节剂的最适浓度；两者混用进行室内盆栽试验，测定两者互作的防治效果及增效作用；通过q RT-PCR测定茉莉酸(jasmonic acid,JA)和水杨酸(salicylic acid,SA)途径相关基因在棉花中的表达量。试验结果发现，5种杀菌剂中多菌灵和萎锈灵的EC₅₀最小，对枯萎病菌的毒力最强，EC₅₀分别为13.894 mg/L和29.566 mg/L；综合苄氨基嘌呤和萘乙酸2种植物生长调节剂对种子活力的影响和对枯萎病菌分生孢子萌发的影响，得到其最适防治浓度分别为5 mg/L和50 mg/L。杀菌剂与植物生长调节剂互作防治棉花枯萎病效果最好的为苄氨基嘌呤与多菌灵组合，防效可达80.95%，且具有显著增效作用；qRT-PCR结果显示，JA和SA途径相关基因在药剂处理的棉花中的相对表达显...     

灰飞虱胁迫下水稻防卫相关基因的表达

灰飞虱是我国水稻生产上的一种重要害虫。运用荧光定量PCR方法及特异性引物,对不同时间(12、24、36、48和72 h)灰飞虱胁迫下抗虫和感虫水稻品种中主要防卫途径的相关基因进行转录水平上定量分析。灰飞虱取食后,与水杨酸合成途径相关的基因PAL、NPR1、EDS1和PAD4在抗灰飞虱品种Mudgo中的表达水平均高于在感虫水稻Kittake中。接虫12 h后,PAL基因表达量达到未接虫时的6.914倍;在Mudgo中,PAL基因相对表达量上升更快,在24、48和72 h分别是Kittake中的42.848、70.743和69.193倍。NPR1基因在灰飞虱为害12、36和72 h后,在Mudgo中的表达量分别是Kittake中的4.690、6.231和4.112倍。与茉莉酸合成相关的基因LOX和AOS2,在灰飞虱为害36 h后,在Kittake中的表达水平显著高于Mudgo中。乙烯信号途径中的受体基因EIN2在Kittake中的表达量也高于Mudgo中。结果表明,灰飞虱取食激活了抗虫水稻Mudgo中依赖水杨酸介导的抗性途径,同时诱导感虫水稻Kittake产生了依赖茉莉酸/乙烯途径的防卫反应,PAL和NPR1基因的表达在调节Mudgo抗灰飞虱中具有重要作用。     

水稻OsMED7基因的克隆及表达分析

转录中介体复合物(Mediator com-plex)是一个由多亚基组成的RNA聚合酶II重要辅助因子,参与真核生物基因的转录调控。通过RT-PCR方法从水稻中克隆了拟南芥MED7的同源基因,命名为OsMED7,该基因的开放阅读框全长为531bp,编码一个含176个氨基酸的蛋白,含有一个MED7保守结构域。用水杨酸处理水稻幼苗后OsMED7基因的表达受到抑制,而茉莉酸的处理对OsMED7基因的表达没有影响,水稻接种白叶枯病菌24h后OsMED7基因的表达开始下降。结果表明,OsMED7亚基通过SA介导的信号转导途径参与水稻对白叶枯病菌的应答。     

播前氟乐灵土壤处理减轻棉花枯萎病的效果

田间试验结果，除草剂氟乐灵４８％乳油以０．８６４ｋｇ／ｈｍ２作棉苗播前土壤处理，可明显减轻棉花枯萎病的发生，在现蕾期，施用氟乐灵后对感病品种沪棉２０１１和抗病品种中棉１２枯萎病株发病率的防治效果分别为４８．２５％～６９．４２％和４９．４１％～７０．５９％；病害严重度也明显下降，对沪棉２０１１和中棉１２的抑制作用分别为５５．９８％～６４．７８％和４６．３６％～７０．４５％。从棉花收获后进行的剖秆检查看，氟乐灵施用后不仅降低了枯萎病菌对棉花的侵染率，对沪棉２０１１和中棉１２的防治作用分别为１６．０２％和２６．８２％；而且也减轻了受侵棉花植株木质部的病变程度，对沪棉２０１１和中棉１２植株木质部病变的抑制作用分别为２２．０２％和３６．３３％，对施药２个月后土壤中枯萎病菌接种体密度的测定结果表明，氟乐灵并不影响土壤中枯萎病菌的接种体密度。综上所述结果，氟乐灵播前土壤处理可以减轻田间棉花枯萎病的发生，其原因是氟乐灵处理诱发了棉株对枯萎病的抗侵入和抗扩展能力。     

(Prunussalicina)WRKY 33的克隆与表达分析

WRKY类转录因子是植物防御反应信号转导的重要组成部分,本研究为了探讨WRKY33基因的功能,以嫩叶为材料,采用RT-PCR和RACE技术相结合的方法,克隆得到WRKY33全长c DNA(命名为Ps WRKY33),对其进行生物信息学分析。以基因组DNA为模板,对该基因的ORF区域进行PCR扩增,获得WRKY33的g DNA全长。采用荧光定量PCR技术检测该基因在水杨酸处理下的表达模式。试验结果表明:Ps WRKY33 c DNA全长为2 113 bp,开放阅读框长为1 770 bp,编码589个氨基酸;Ps WRKY33蛋白含有两个WRKY保守结构域,与Pm WRKY33蛋白同源性最高。Ps WRKY33基因组全长为2 844 bp,存在3个内含子和4个外显子。荧光定量结果表明:Ps WRKY33在1 mmol/L水杨酸处理后,30 h表达量最高,呈先上升后下降的趋势。研究结果为深入研究WRKY33基因与水杨酸诱导植物抗病性的关系提供一定的参考价值。