木薯AGPase大亚基MeAGPL3基因启动子调控区域鉴定

木薯是重要的热带作物,具有高淀粉积累等特点,但其高效积累机制尚不明确.为研究腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)大亚基对木薯淀粉积累的调控作用,本研究通过RT-PCR技术对木薯AGPase 5个大亚基基因(MeAGPL1～MeAGPL5)进行筛选,发现MeAGPL3基因在木薯块根中高表达且受100 μmol/L外源ABA正向调控;克隆了该基因2455 bp 5'侧翼序列,利用该序列及4个不同长度的5'端截短片段分别与β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因融合构建表达载体,转化本氏烟草,通过检测各转基因烟草GUS蛋白活性,发现-1至-1711 bp序列具有最佳的启动活性.利用100 μmol/L外源ABA处理各转基因烟草株系,分析处理前后GUS蛋白活性变化,发现ABA信号响应元件分布于-1711至-2150区域.本研究为从转录调控角度阐释木薯淀粉高效积累机制提供理论支撑.     

木薯MeVINV1基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建及验证

液泡转化酶(vacuolar invertase, VINV)是参与植物蔗糖代谢、器官发育的关键酶之一。木薯MeVINV1在块根发育及淀粉积累阶段的表达活跃,对该基因进行编辑敲除,将有助于解析MeVINV1在木薯块根淀粉积累过程中的作用。本研究构建了MeVINV1的CRISPR/Cas9基因编辑载体,转化木薯脆性胚性愈伤组织以验证载体的编辑效果。结果发现：转化后的样品中,MeVINV1基因靶点位置出现测序多峰,而未转化样品中没有多峰出现,表明本研究构建的基因编辑载体可对MeVINV1基因进行编辑;检测分析潜在脱靶位点的序列,发现未出现脱靶现象。该研究为获得MeVINV1基因的突变体,明确其在木薯块根发育及淀粉积累过程中的功能奠定了基础。     

MeNINVs在不同品种木薯的表达模式及酶活性分析

碱性/中性转化酶(NINV)催化蔗糖分解成葡萄糖和果糖,是木薯块根的蔗糖分解代谢的关键酶之一。本研究以淀粉含量不同的木薯品种(SC8-高淀粉,SC124-中淀粉,9Ⅰ-低淀粉)为材料,研究木薯块根膨大期,Me NINV基因家族在源库器官的表达模式以及酶活性特点。结果表明,不同品种木薯Me NINVs的表达模式相似,Me NINV1、Me NINV16、Me NINV110及n INV1在叶片中表达量均高于其他成员;同时,Me NINV1和NINV1在块根中的表达量也高于其他成员。不同品种木薯叶片中的Me NINVs表达及酶活性差别不大,但是高淀粉品种SC8块根中的Me NINVs表达量比9Ⅰ低,而NINV酶活性却远高于9Ⅰ,推测木薯NINV酶活性存在转录后调控机制。本研究为进一步研究碱性/中性转化酶在木薯淀粉积累过程中的作用奠定了基础。     

木薯淀粉分支酶SBEⅠ反义基因遗传转化木薯的研究

旨在获得转淀粉分支酶反义SBEⅠ基因的‘华南木薯8号’转基因植株,为利用转基因技术改良木薯淀粉品质打下基础。在建立了木薯从胚状体子叶到完整植株的再生体系的基础上,用块根特异表达启动子Sporamin驱动的木薯淀粉分支酶SBEⅠ反义基因,通过农杆菌介导法对‘华南木薯8号’进行遗传转化。共接种‘华南木薯8号’子叶517块,获得7株生长良好的转化再生植株,转化再生频率达到1.35%。经PCR检测,其中5株转化再生植株扩增出目的条带,初步证实木薯淀粉分支酶SBEⅠ反义基因已整合进了‘华南木薯8号’基因组中。通过农杆菌介导法可以将淀粉分支酶SBEⅠ反义基因导入到‘华南木薯8号’基因组中,获得了5株转基因植株。     

马铃薯细胞壁蔗糖转化酶基因StCWIN1启动子克隆与表达及其在干旱胁迫下的作用分析

植物细胞壁蔗糖转化酶（cell wall invertase,CWIN）是源、库组织蔗糖代谢及胁迫应答的关键酶。本研究利用基因步移法克隆马铃薯StCWIN1启动子片段,应用PlantCARE在线软件对启动子区域的作用元件进行分析,将融合StCWIN1启动子与GUS报告基因的表达载体转化拟南芥野生型,并利用组织化学染色和GUS实时定量PCR技术探究启动子表达活性、组织表达特性和响应干旱胁迫的表达规律。结果表明,克隆获得StCWIN1基因上游1956 bp启动子序列,其中包含核心调控、植物激素、防御及胁迫、光响应等关键元件;StCWIN1启动子在根、柱头和果荚组织中的表达活性高于其他组织;转StCWIN1启动子拟南芥株系叶片中GUS表达量高于野生型,且干旱胁迫显著抑制了GUS相对表达量。本研究克隆得到具有活性的StCWIN1启动子,基于研究结果推测目的基因可能参与根、花和果实等器官发育,对干旱胁迫也发挥应答调节作用。     

牛大力蔗糖合酶基因CsSuSy克隆与表达特征分析

蔗糖合酶(sucrose synthase,SuSy)是催化蔗糖代谢的关键酶之一,参与蔗糖的分解、淀粉的生物合成等代谢过程,在植物的生长发育中发挥着至关重要的调控作用.本研究从牛大力转录组数据库筛选并克隆得到两个蔗糖合酶基因CsSuSy1与CsSuSy2,CSuSy1全长2 326bp,包括2 307 bp的完整开放阅...     

玉米淀粉调控的研究进展

为了明确淀粉合成途径中的关键酶的功能和调控机制,本文综述了玉米淀粉的结构、淀粉合成途径以及调控淀粉合成转录因子（DOF、NAC、MYB、bZIP、MADS-BOX和AP2/EREB等家族）的表达和功能机制。研究表明大部分转录因子能在玉米胚乳中表达,少数也能在叶片中表达;这些转录因子可以通过与淀粉合成酶编码基因和关键调控基因的启动子结合从而影响其表达来调控淀粉的合成。此外,蔗糖/ABA、蔗糖/IAA也可以和转录因子协同调控淀粉的合成。本文能够加深对玉米淀粉合成调控的理解,也为玉米品质改良提供重要的理论依据。     

木薯碱性/中性转化酶MeNINV4酵母功能互补

木薯(Manihot esculenta Crantz)为大戟科植物,其块根富含淀粉,主要用于食用、饲用,同时木薯淀粉还可广泛应用于工业生产中。木薯块根淀粉的合成需要蔗糖提供碳水化合物和能量,碱性/中性转化酶在木薯块根蔗糖分解利用时起关键作用。前期已从木薯基因组中克隆获得了11个碱性/中性转化酶基因,其中Me NINV4主要在茎中表达。本研究主要利用转化酶酵母突变菌株SEY2102进行酵母功能互补实验,鉴定Me NINV4是否具有催化蔗糖分解的功能。结果发现,转了p DR196-Me NINV4的SEY2102酵母可以在以蔗糖为唯一碳源的培养基中生长,表明Me NINV4能催化分解蔗糖。提取含有p DR196-Me NINV4质粒的SEY2102酵母粗酶液,进行碱性/中性转化酶活性检测,发现其能催化蔗糖分解成还原糖。这些结果为进一步研究Me NINV4的酶学特性及生理功能提供参考。     

巨胚稻OsGAD_3基因启动子的序列及活性分析

本研究以富含γ-氨基丁酸的巨胚稻"Tge B"基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增得到GABA合成关键酶基因Os GAD3的上游959 bp启动子序列。序列分析表明:Os GAD3启动子不仅含有转录必备的TATA box、CAAT box元件,还含有分生组织特异性表达调控元件CAT-box、CCGTCC-box以及一些非生物胁迫和激素响应元件等。将该启动子序列与GUS基因融合构建表达载体,转化水稻后进行GUS组织化学染色分析,结果显示,Os GAD3启动子驱动的GUS基因在转基因植株的根、茎中具有较高的表达活性,且在根尖和茎初生韧皮部区域的表达更为明显,在种胚及叶片切口处也能检测到GUS表达。浸水后种胚中的GUS活性显著提高,且随着浸水时间的延长呈逐渐增加趋势。研究结果为了解巨胚稻Os GAD3的表达调控机制提供了依据。     

木薯淀粉分支酶SBEⅠ反义基因遗传转化木薯的研究

旨在获得转淀粉分支酶反义SBEI基因的‘华南木薯8号’转基因植株,为利用转基因技术改良木薯淀粉品质打下基础。在建立了木薯从胚状体子叶到完整植株的再生体系的基础上,用块根特异表达启动子Sporamin驱动的木薯淀粉分支酶SBEI反义基因,通过农杆菌介导法对‘华南木薯8号’进行遗传转化。共接种‘华南木薯8号’子叶517块,获得7株生长良好的转化再生植株,转化再生频率达到1.35%。经PCR检测,其中5株转化再生植株扩增出目的条带,初步证实木薯淀粉分支酶SBEI反义基因已整合进了‘华南木薯8号’基因组中。通过农杆菌介导法可以将淀粉分支酶SBEI反义基因导入到‘华南木薯8号’基因组中,获得了5株转基因植株。     

3个陆地棉球蛋白基因启动子的克隆与功能初步分析

为克隆陆地棉来源的种子特异性启动子,根据雷蒙德氏棉测序结果,设计针对GhαGLOA、GhβGLOA和GhβGLOB基因编码区上游约1.5 kb序列的引物,分别以陆地棉总DNA为模板克隆了3条序列。构建了含有编码区上游序列驱动GUS的表达载体,经农杆菌介导转化野生型拟南芥。转基因拟南芥种子的GUS活性荧光检测结果表明,所克隆序列具有启动子功能,其中GhαGLOA启动子的转录活性极显著高于其他2个启动子。在转基因拟南芥成体植株的多个器官中,仅可检出痕量的GUS活性,认为所克隆启动子为种子特异性启动子。     

木薯淀粉合成相关基因SBE和GBSS的物理定位

淀粉分支酶和颗粒结合型淀粉合成酶是木薯淀粉合成过程的关键酶。本研究利用荧光原位杂交技术对木薯淀粉合成相关的淀粉分支酶基因(SBEI)和颗粒结合型淀粉合成酶基因(GBSSⅠ,GBSSⅡ)在染色体上的位置进行了物理定位分析。结果表明:GBSSⅠ和GBSSⅡ基因分别定位于木薯华南6号的第13号染色体的短臂上和第11号染色体的短臂上,信号位点到着丝点的百分距离分别为26.3±0.1和14.0±0.5,信号检出率分别为12.9%和7.9%。而SBEI基因位于第12号染色体的长臂上,信号位点到着丝点的百分距离为76.2±0.2,信号检出率为9.4%。GBSSⅠ、GBSSⅡ和SBEⅠ基因位于不同的染色体上,互为独立基因。本研究揭示了这些基因在染色体上的分布特点和基因间的位置关系以及连锁情况,为分子辅助育种和比较基因组学研究提供理论基础。     

玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的克隆与过表达载体的构建

【研究目的】克隆玉米分支酶基因SBEⅡb并构建该基因的过表达载体pCASBEⅡb。【研究方法】从糯玉米（Waxy corn）新鲜胚乳中提取总RNA,利用RT-PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA。【结果】克隆得到了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA,用BLAST软件作同源序列比对的结果显示,该片段的核苷酸序列与GenBank上报道的序列具有99%的同源性,全长2719bp,编码799个氨基酸。【结论】将该基因连接到携带GUS报告基因的植物表达载体pCAMBIA1303中,并通过了GUS活性检测,说明已成功构建了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的过表达载体pCASBEⅡb。     

甘薯抗旱相关基因IbNAC72的克隆与功能分析

NAC(NAM/ATAF/CUC,NAC)转录因子是植物中特有的转录调控因子,在植物体的生长发育与逆境胁迫响应等多种生理过程中起着重要的调控作用。本研究利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)从甘薯品种栗子香中克隆到甘薯抗旱相关基因IbNAC72,该基因cDNA长为1319bp,开放阅读框(open reading frame, ORF)为1008 bp,编码335个氨基酸,分子量为37.4 kD,等电点为8.76,基因组全长为1199 bp,含有3个外显子、2个内含子。多重序列比对和系统进化树分析显示, IbNAC72基因与牵牛花中同源基因的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,IbNAC72基因在甘薯叶片中的表达量显著高于在茎段和根系中;同时Ib NAC72基因受到干旱和盐胁迫显著诱导表达。利用农杆菌介导法转化烟草,获得过表达IbNAC72基因的转基因烟草植株。对IbNAC72转基因烟草植株的抗旱性分析表明,在长时间干旱条件下,转基因植株的根系更加发达, SOD活性显著提高, MDA的含量显著降低,抗旱性显著提高...     

文心兰生物钟基因OnELF3启动子克隆与表达分析

为了解文心兰生物钟基因OnELF3的转录调控,本研究采用TAIL-PCR技术从文心兰基因组中克隆到OnELF3基因起始密码子上游2 204 bp的启动子序列。使用BDGP、PlantCARE和PLACE在线软件对OnELF3基因启动子的转录起始位点与顺式作用元件进行预测。结果表明启动子序列除包含TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件外,还包含组织特异性元件、光调控元件、植物激素响应元件、胁迫反应响应元件和昼夜节律调控元件等。为探究OnELF3启动子的表达活性,构建pCAMBIA1301-p OnELF3p:GUS载体,利用农杆菌介导法,转化烟草与拟南芥。烟草叶片瞬时转化表明克隆的OnELF3启动子序列具有启动子活性。转化拟南芥结果表明,OnELF3启动子能够驱动下游的GUS基因在T2代拟南芥中稳定表达,GUS组织染色显示该启动子呈现发育与组织特异性表达。这些结果为进一步研究文心兰OnELF3基因的转录表达调控与相关功能分析提供基础。     

植物蔗糖合成酶基因研究进展

蔗糖合成酶(sucrose synthase,SuSy)是植物体内参与蔗糖代谢的关键酶之一。SuSy基因不仅影响作物产量和淀粉含量,与植物品质相关,还参与植物非生物胁迫过程。进化分析表明,高等植物SuSy基因分为三种类型(Group):SUSⅠ、SUSⅡ和SUSⅢ,SUSⅠ又可分为单子叶组(Monocot SUSⅠ)和双子叶组(Dicot SUSⅠ),甘蔗中的5个SuSy基因也被分为三组。同一植物中不同类型SuSy基因的表达具有发育和组织器官特异性,功能也有特异性。许多试验证明蔗糖能够调节SuSy的活性,光也能影响SuSy基因的表达。转基因研究表明,SuSy基因可以调节库强度、影响植株生长和发育。本研究全面总结国内外在植物蔗糖合成酶基因研究方面的进展,并提出问题与研究展望,为进一步研究利用植物SuSy基因改良作物品种提供参考。     

反义Trxs基因导入对弱筋小麦豫麦18淀粉积累及淀粉合成关键酶表达的影响

以转反义硫氧还蛋白基因小麦TY18-99和TY18-100及其相应未转基因对照为材料,于2007-2009年通过盆栽试验系统研究了反义Trxs基因(anti-Trxs)导入对弱筋小麦豫麦18籽粒灌浆过程中淀粉积累、淀粉合成关键酶活性以及淀粉合成酶基因表达的影响。结果表明,反义Trxs基因对小麦籽粒淀粉积累有一定的正效应。2个转基因株系的总淀粉和支链淀粉的积累速率较对照显著提高;在整个籽粒形成过程中,反义Trxs基因导入显著提高了淀粉分支酶(SBE)活性。在籽粒灌浆中期和后期,反义Trxs基因导入显著提高了腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)和可溶性淀粉合酶(SSS)活性,降低了颗粒束缚型淀粉合酶(GBSS)活性。实时荧光定量RT-PCR分析表明,反义Trxs基因促进了AGPase、SBE I和SSS (SSS I、SSS II和SSS III)基因的表达,抑制了GBSS I基因的表达。上述结果说明,反义Trxs基因导入后促进了AGPase、SBE I和SSS基因的转录,从而使籽粒灌浆期间的淀粉积累速率发生了改变,最终显著提高了总淀粉和支链淀粉的含量,降低了直链淀粉含量,进而提高了淀粉的支/直比,这可能是转基因小麦淀粉品质改善和产量提高的主要原因。     

木薯MeSSⅢ基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建及验证

木薯块根淀粉葡聚糖链结构是决定淀粉品质的关键因素,可溶性淀粉合成酶Ⅲ(SSⅢ)是调控植物支链淀粉葡聚糖长链合成的关键酶,木薯有两个MeSSⅢ的同源基因MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2。为了研究木薯MeSSⅢ对木薯块根淀粉品质形成的影响,根据MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2的保守区段,本研究构建了MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2的双基因编辑载体。利用在线软件CRISPR-P v2.0同时设计靶标MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2的sg RNA,通过酶切连接构建重组pCAMBIAP1301-Cas9-MeSSⅢ-gRNA质粒。将基因编辑载体转化农杆菌LBA4404后侵染木薯脆性胚性愈伤组织,筛选阳性脆性胚性愈伤组织,并提取其总DNA。通过PCR扩增靶点MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2的区段,并将扩增片段进行Sanger测序,分析其编辑的靶标位点。结果发现MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2靶标位点被成功编辑,本研究有助于进一步获得MeSSⅢ基因突变体,以深入解析该基因在木薯淀粉合成通路中的作用。     

黄独低温离体保存微型块茎几种酶的qPCR验证

采用qPCR方法检测黄独4℃低温离体保存微型块茎几种酶的活性。研究表明:在黄独微型块茎的4℃低温离体保存中,谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物酶基因上调,表达量升高,其他酶基因(过氧化氢酶,抗坏血酸过氧化物酶,超氧化物歧化酶1(Cu-Zn),谷胱甘肽还原酶,多聚半乳糖醛酸酶,谷胱甘肽硫转移酶,查尔酮合酶,高柠檬酸合酶,超氧化物歧化酶1(Cu-Zn)和蔗糖合成酶均下调),表达量下降,而转录组的结果表明多聚半乳糖醛酸酶、谷胱甘肽硫转移酶、查尔酮合酶和高柠檬酸合酶基因上调,表达量升高,其他酶基因(过氧化氢酶,抗坏血酸过氧化物酶,超氧化物歧化酶1(Cu-Zn),谷胱甘肽还原酶,超氧化物歧化酶1(Cu-Mn),谷胱甘肽过氧化物酶,过氧化物酶和蔗糖合成酶)均下调,表达量下降。这个结果表明,在qPCR检测和转录组结果中,绝大部分酶基因的表达趋势相一致,一小部分基因出现相反表达趋势,可能是由于产物的非特异性扩增造成的。本试验结果可为黄独微型块茎的低温离体保存提供理论依据。     

甘薯细胞壁蔗糖转化酶基因IbCWIN家族成员鉴定及表达分析

甘薯是重要的粮食、饲料、工业原料作物和新型的生物能源作物,细胞壁蔗糖转化酶是植物源、库组织蔗糖代谢的关键酶,但关于甘薯细胞壁蔗糖转化酶基因IbCWIN家族成员的研究尚未见报道。本研究测定供试品种不同组织部位的蔗糖淀粉含量,利用生物信息学方法对IbCWIN基因家族的理化性质、保守结构域、系统进化关系、启动子作用元件、组织特异性表达模式进行分析。结果表明,甘薯茎中蔗糖含量最高,须根和叶次之,块根最低;块根淀粉含量最高,极显著高于其他部位。甘薯中含有10个IbCWIN基因,编码氨基酸442～1115个,蛋白质分子量范围49.56～124.44kD,等电点为5.0～9.1。分布在8条染色体上,都含有Glyco₃2保守结构域及相同或相似的保守基序motif,属于糖基水解酶基因家族GH32。IbCWIN与木薯MeCWINV同源性高, IbCWIN基因家族启动子区域含有多种类型的顺式作用元件。qRT-PCR结果表明,IbCWIN基因家族在甘薯不同组织中均有表达且有多种表达模式,其中IbCWIN2和IbCWIN9在块根中表达量显著高于其他组织部位。本研究为下一步探索甘薯IbCWI...