巴西橡胶树WRKY转录因子基因HbWRKY41的克隆与表达分析

为阐明巴西橡胶树WRKY转录因子基因Hb WRKY41的分子特征及表达特性,利用RT-PCR方法从巴西橡胶树中克隆了该基因。Hb WRKY41开放阅读框1 020 bp,编码339个氨基酸,预测蛋白分子量为38.48 k Da,理论等电点为5.52。Hb WRKY41含有1个WRKY保守结构域和1个C_2HC型锌指结构,与蓖麻、棉花、大豆及拟南芥WRKY41蛋白聚为一类,属于Ⅲ类WRKY转录因子家族成员。实时荧光定量PCR检测结果表明,Hb WRKY41在巴西橡胶树根、树皮、胶乳、叶和花等组织中均有表达,以在衰老叶片中的表达最高,而在胶乳和树皮中的表达相对较低。干旱、低温及高盐胁迫均可上调Hb WRKY41的表达,其中以低温或盐胁迫下Hb WRKY41的表达持续升高。Hb WRKY41可能在巴西橡胶树叶片衰老和非生物胁迫应答中起着重要调控作用。     

巴西橡胶树HbMADS5的克隆及表达分析

在前期巴西橡胶树胶乳转录组测序的基础上,通过PCR克隆了1个编码巴西橡胶树MADS-box转录因子的基因,命名为Hb MADS5。Hb MADS5全长1 077 bp,编码358个氨基酸,推测Hb MADS5蛋白分子量为40.75 k D,等电点为6.38。氨基酸序列比对分析表明,Hb MADS5具有MADS-box家族典型的MADS-box保守结构域,与蓖麻、葡萄、麻风树、甜橙、木本棉、蒺藜状苜蓿等物种的MADS-box家族成员具有较高的同源性,分别为79%、74%、72%、70%、65%和59%。Hb MADS5与麻风树中的1个MADS-box成员亲缘关系最近。Hb MADS5在巴西橡胶树根、茎、叶、花和胶乳等中都有表达,其中在胶乳中表达量最高,在根中表达量最低;茉莉酸甲酯和乙烯能诱导Hb MADS5的表达,茉莉酸甲酯处理12 h后Hb MADS5表达量提高了10倍,乙烯处理48 h后Hb MADS5表达量提高了2倍。本研究将为进一步研究Hb MADS5在巴西橡胶树中的功能提供了帮助。     

巴西橡胶树HbNAC55的克隆及表达分析

在前期巴西橡胶树胶乳转录组测序的基础上,利用q RT-PCR技术,从巴西橡胶树中克隆得到1个NAC转录因子基因,命名为Hb NAC55。Hb NAC55全长1 755 bp,该基因编码584个氨基酸,蛋白质分子量为65.06 ku,等电点为4.79。蛋白结构分析发现,该蛋白含有一个NAM结构域,具有典型的NAC类蛋白的结构特征,与木薯、胡杨、可可、土瓶草、梅、胡桃、甜橙等物种的NAC家族成员具有较高的同源性,分别为81%、61%、56%、57%、55%和53%。通过q RT-PCR发现Hb NAC55在橡胶树胶乳中表达量最高。茉莉酸和乙烯均能诱导胶乳中Hb NAC55表达上调,其中茉莉酸甲酯处理12 h后Hb NAC55表达量提高了近6倍,乙烯处理48 h后HNAC55表达量提高了近1.7倍。本研究将为进一步研究Hb NAC55在巴西橡胶树中的功能提供了帮助。     

巴西橡胶树REF/SRPP家族基因的克隆及表达分析

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳是天然橡胶的主要来源,橡胶延伸因子(REF)和小橡胶粒子膜蛋白(SRPP)作为胶乳中的两大主要蛋白,被认为参与了橡胶的合成和调控。目前,NCBI蛋白数据库已经登录了巴西橡胶树REF/SRPP家族的6个成员,我们通过研究又获得8个新的REF/SRPP基因家族成员,Hb REF154、Hb REF221、Hb REF296、Hb REF542、Hb SRPP178、Hb SRPP203、Hb SRPP216、Hb SRPP234。这14个成员编码蛋白都具有保守的REF结构域,有两个成员还具有ATP合酶亚基结构域,一个成员具有甲基结合结构域。进化分析显示橡胶树REF/SRPP家族成员与产胶植物REF/SRPP家族成员在进化上较为接近。q PCR分析发现该家族成员都响应割胶刺激表达升高,除Hb REF138外其它成员都响应乙烯处理表达降低。通过shotgun数据分析发现,除Hb REF221外的13个成员都存在于橡胶粒子或C-乳清组分中,Hb REF138、Hb REF154、Hb REF175和Hb REF258主要存在于橡胶粒子中,Hb REF542、Hb SRPP216是橡胶粒子中所特有的,Hb REF296和Hb SRPP200是C乳清中所特有的。该研究结果揭示了REF/SRPP家族成员及其基本的表达特性,为深入研究该家族成员在巴西橡胶树产胶中的具体作用提供了一定的基础。     

蓖麻类钙调蛋白基因RcCML42克隆与表达载体构建

为了探究类钙调蛋白基因家族成员在蓖麻体内的作用及表达模式，在蓖麻体内挖掘家族基因CML42,并对其进行克隆与表达分析。以哲蓖三号植株为试验材料，克隆获得RcCML42完整编码区序列(CDS),利用生物信息学方法对RcCML42基因序列进行分析，包括编码氨基酸、蛋白分子量及等电点、跨膜结构域、氨基酸序列一致性等内容。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术，检测RcCML42基因在蓖麻植株根、茎、叶位置不同时间点的特异性表达情况。结果显示，RcCML42 CDS长度为597 bp,编码198个氨基酸，含有3个EF-hand钙结合结构域。蛋白分子量为22.27 ku,等电点为4.55,不存在跨膜结构域。氨基酸序列一致性分析表明，RcCML42与巴西橡胶树一致性最高，达86.84%。qRT-PCR结果显示，RcCML42基因在蓖麻根、茎、叶组织中均有表达，在经NaCl处理后，RcCML42在根中的表达量呈现先下降后上升的趋势。RcCML42在茎中12 h高度表达，在叶中为8 h高度表达。且在茎中的表达量显著高于其在根、叶中的表达。CML是植物体内最重要的一类钙感受器，通过与钙调素结合蛋白结合...     

巴西橡胶树逆境相关HbCPK1结构与功能分析

钙依赖型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPK,CPK)在植物对生物和非生物胁迫抗性中具有重要作用。为揭示橡胶树CPK家族成员在橡胶树白粉病抗性中的作用,从巴西橡胶树‘热研7-33-97’叶片中克隆了一个CPK基因,其推导氨基酸含有特征性蛋白激酶家族结构域和4个EF手型蛋白结构域,命名为HbCPK1。该基因在花、叶片、胶乳和树皮中均有表达,在花中表达量最高。干旱、机械伤害和白粉病浸染均显著上调该基因在橡胶树叶片中表达。表明HbCPK1主要受非生物胁迫反应诱导,参与橡胶树对逆境响应,本研究为阐明HbCPK1基因在橡胶逆境胁迫响应下的作用提供理论参考。     

巴西橡胶树雄性不育相关基因HbGEX1的克隆与表达分析

蛋白配子表达1项目(Protein GAMETE EXPRESSED 1, GEX1)是一种膜蛋白,在植物物种中非常保守。本研究前期利用转录组测序技术筛选得到了与橡胶树雄性不育相关的差异表达基因GEX1序列,但其相关功能并未得到验证。本研究通过RT-PCR方法从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中克隆得到一个GEX1的全长c DNA序列,命名为HbGEX1,其ORF长度为1 785 bp,编码594个氨基酸,理论等电点为5.51,相对分子质量为68.66 k D,总平均亲水性GRAVY为负值,为疏水性蛋白,亚细胞定位预测结果表明定位于细胞核中不是分泌蛋白,Hb GEX1具有信号肽,且信号肽的剪切位点位于第19和第20号氨基酸之间,具有3个跨膜螺旋结构,进化树显示HbGEX1与木薯(Manihot esculenta)的HbGEX1蛋白聚为一类,亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示,HbGEX1在巴西橡胶雄花中的表达量比较高,在不育品种中基因的表达量高于可育品种,在橡胶树雄花的3个不同发育时期(小孢子母细胞时期,四分体小孢子时期,单核花时期)中可育品种与不育品种的表达均呈...     

巴西橡胶树伤害诱导蛋白基因的克隆及表达分析

为了研究橡胶树在逆境胁迫下的分子机制,根据巴西橡胶树抑制消减(SSH)文库和NCBI数据库中的伤害诱导蛋白基因拼接序列设计嵌套引物,通过RACE技术获得基因的完整开放阅读框,命名为HbWUN1。序列分析表明HbWUN1长872 bp,含有390 bp的开放阅读框,编码129个氨基酸。生物信息学分析结果表明HbWUN1不含信号肽和跨膜结构,为亲水性蛋白。进化分析结果显示,橡胶树HbWUN1与拟南芥NP_974279.1聚成一类。RT-PCR分析结果表明HbWUN1表达无组织特异性,在胶乳中表达量最高。在叶片不同发育时期HbWUN1表达存在变化,在衰老期最高。此外,低温、伤害、高盐、乙烯和茉莉酸处理均调控HbWUN1表达,推测其可能在橡胶树逆境反应中发挥作用。     

橡胶树HbICE1的克隆及表达模式分析

低温是影响植物正常生长发育,导致作物产量和品质下降的主要自然灾害之一。由于橡胶树(Hevea brasiliensis)属于热带植物,不耐寒,所以极易受到低温冷害影响。而Inducer of CBF expression 1(ICE1)是低温胁迫信号通路中的重要转录激活因子,目前橡胶树冷胁迫信号途径中包括Hb ICE1在内的大部分关键基因的研究还比较匮乏。我们从橡胶树中克隆了Hb ICE1基因。经测序发现,该基因开放阅读框为1 407 bp,编码469个氨基酸,蛋白质分子质量约为51 k D,理论等电点(p I)为5.83,为亲水性蛋白。并且利用荧光定量PCR技术分析了Hb ICE1在不同激素(乙烯,脱落酸,茉莉酸)以及H2O2处理后的表达模式,结果表明乙烯、脱落酸、茉莉酸以及H2O2均能调控橡胶树Hb ICE1基因的表达,但不同胁迫处理下的表达模式存在着较大的差异,暗示着Hb ICE1在不同的激素信号途径中发挥的作用差异较大。     

巴西橡胶树产胶基因HbREF、HbHMGR1与MYCs转录因子互作

天然橡胶主要来自巴西橡胶树,巴西橡胶树是海南省主要的经济作物之一。胶乳在乳管中合成储存,乳管数量影响胶乳产量。乳管分化一直被证明与茉莉酸信号途径相关,本实验室已在前期研究中鉴定了茉莉酸信号途径中的关键转录因子MYCs与G-box顺式作用元件的互作,为了验证HbMYCs是否与含G-box(CACGTG)顺式作用元件的产胶相关基因互作,本研究克隆了两个产胶相关基因HbREF与HbHMGR1的全长启动子序列,并设计了相应的单荧光素酶报告基因实验,经生物信息学分析发现,2个基因的启动子上均含G-box (CACGTG)顺式作用元件,单荧光素酶报告基因实验的结果表明,HbREF和HbHMGR1分别与Hb MYC2、Hb MYC3、Hb MYC4互作,且受HbMYCs转录因子的正向调控,说明茉莉酸信号通路中的转录因子可以调控橡胶产排胶基因的表达,对阐明橡胶树产排胶机理具有重要意义。     

巴西橡胶树NAC转录因子HbNAC1基因的克隆及生物信息学分析

为了研究植物特有的NAC(NAM,ATAF1/2和CUC2)转录因子在巴西橡胶树生长发育、胁迫应答和激素调节中的功能,对巴西橡胶树NAC转录因子进行了克隆和分析。根据橡胶树胶乳cDNA文库中筛选到的NAC EST序列,利用RACE-PCR技术克隆了橡胶树HbNAC1的cDNA序列。生物信息学分析显示HbNAC1基因开放阅读框(ORF)为891 bp,编码了一个296个氨基酸组成的中性不稳定水溶性蛋白,该蛋白的N-端具有保守的NAC结构域,C-端高度变异,具备了NAC转录因子的基本特征。HbNAC1定位在细胞核中,具有3个糖基化位点和21个磷酸化位点,三级结构由3个α-螺旋和9个β-折叠组成。序列比对和系统进化分析显示HbNAC1蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC011亚族,推测其可能作为一种氨基酸合成相关的调节酶参与调控植物的免疫反应。     

橡胶树线粒体解偶联蛋白HbUCP5基因的克隆与表达分析

线粒体解耦联蛋白(mitochondrial uncoupling protein, UCP)是位于线粒体内膜上的特殊蛋白,广泛参与生物产热调节和抗氧化防御。为了研究线粒体解耦联蛋白基因在橡胶树中的功能,本研究克隆了巴西橡胶树线粒体解偶联蛋白基因Hb UCP5,对该基因及其编码蛋白进行生物信息学分析,并探究其在橡胶树中的表达模式。研究结果表明巴西橡胶树中HbUCP5基因cDNA序列开放阅读框(ORF)长978 bp,编码325个氨基酸。HbUCP5相对分子量和理论等电点分别为34.72 kD和9.89,是一个疏水的稳定蛋白。HbUCP5有多个磷酸化位点和O-糖基化位点,无信号肽,定位于线粒体。HbUCP5二级结构主要由α-螺旋、β-转角、延伸链和不规则卷曲构成,其中α-螺旋和无规则卷曲占比最高,分别为44%和36%。系统进化分析表明,HbUCP5与其他植物UCP5亚族共同聚为Group IV分支。表达模式分析结果表明,HbUCP5在花、乳管、茎尖等代谢旺盛组织和叶片生长旺盛时期高表达,乙烯利诱导HbUCP5表达,而死皮树中HbUCP5表达下调,排胶顺畅橡胶树品系中显著高表达。HbUCP...     

橡胶树HbMGT4L的克隆及过表达植株的获得

镁离子(Mg²⁺)是植物生长的必需元素,参与调控光合作用等植物体内诸多新陈代谢反应,对植物的生长发育有着至关重要的作用。Mg²⁺在植物体内的运输和稳态主要是由Mg²⁺转运体MGT (Magnesium transporter)维持,但是在海南重要的经济特色作物橡胶树(Hevea brasiliensis Mull. Arg.)中关于MGT的研究还很少。本研究从橡胶树中克隆了Mg²⁺转运体HbMGT4L,序列分析表明HbMGT4L开放阅读框为1 482 bp,编码493个氨基酸,相对分子量约为55 kD,等电点为4.88。HbMGT4L与拟南芥MGT蛋白氨基酸序列比对结果显示：HbMGT4L含有CorA-like转运蛋白特有的GMN序列,与拟南芥MGT具有较高的相似性。进化树分析结果表明HbMGT4L与拟南芥中的AtMGT4的亲缘关系较近。荧光定量PCR技术分析HbMGT4L在不同组织中的表达情况显示：HbMGT4L在胶乳、树皮、根、茎和叶中均能表达,其中在根中表达量较高。将HbMGT4L的CDS构建...     

HbTCTP及其截短体酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为进一步鉴定橡胶树翻译控制肿瘤蛋白(HbTCTP)与橡胶延伸因子1 (HbREF1)互作的分子区域,构建Hb TCTP及其截短体的诱饵载体。本研究利用RT-PCR技术从橡胶树胶乳中扩增出包含HbTCTP不同结构域的片段,克隆到p GBKT7表达载体,通过酶切、菌落PCR和测序鉴定后,转化酵母Y2HGold感受态细胞,检测诱饵蛋白是否具有自激活作用和毒性。结果显示,成功构建6个包含HbTCTP不同结构域的诱饵载体,且诱饵载体对酵母宿主细胞无毒性和无自主激活报告基因的功能。本研究结果为进一步筛选HbTCTP与HbREF1互作的分子区域及阐明HbTCTP的功能提供科学依据。     

巴西橡胶树HbRPB11基因的克隆与表达分析

橡胶树树皮中的次生乳管是天然橡胶合成和贮存的主要场所。生产上施用乙烯利通过延长橡胶树割胶后的排胶持续时间,调节胶乳代谢,从而达到增产的目的。但目前对于转录复合体关键成员RNA聚合酶Ⅱ在胶乳代谢过程中的动态变化尚不清楚。本研究采用RACE和RT-PCR方法,从橡胶树无性系CATAS7-33-97的胶乳中克隆到编码RNA聚合酶Ⅱ关键亚基RPB11的同源基因,命名为HbRPB11。该基因全长659 bp,包含351 bp的开放阅读框,编码一个由116个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质分子量为13.53 k D,理论等电点为5.934。实时荧光定量PCR结果表明,HbRPB11在橡胶树的多个组织中均有表达,其中在成熟叶片和胶乳中的表达量最高,并且受割胶和乙烯利处理显著上调。橡胶树不同种质间的表达模式分析显示HbRPB11基因在橡胶合成效率高的种质中的表达量要显著高于橡胶合成效率低的种质,表明该基因的表达量与橡胶合成效率呈正相关性,有可能作为生产上筛选高效合成橡胶种质材料的分子标记。     

橡胶树品种‘湛试327-13’乙烯响应分子机制分析

橡胶树‘湛试327-13’新品种兼具抗寒和高产的特性,揭示其在乙烯刺激后的分子机制有利于精准鉴定和选育种质资源。本研究以1.5%乙烯利处理橡胶树‘湛试327-13’开割树为材料,利用荧光定量技术分析胶乳和树皮中活性氧淬灭酶、蔗糖转运蛋白和橡胶生物合成关键酶等基因的表达规律,结果表明：乙烯利处理并连续割6刀后,橡胶树活性氧淬灭酶、蔗糖转运蛋白、胶乳抗性和橡胶生物合成关键酶基因在树皮表达量高于其在胶乳中表达量。与对照相比,随着割胶刀数的增加,‘湛试327-13’树皮脂肪氧化酶(HbLOX1)和过氧化物酶基因(HbPOD1)基因表达显著上调,最高为22.15和31.95倍;蔗糖转运蛋白HbSUT1、HbSUT2a分别提高66.11和58.50倍;几丁质酶(HbCHI)、葡聚糖酶(HbGLU)和橡胶素(HbHEV)分别提高16.93、8.09和10.37倍;橡胶生物合成关键酶基因HbGGPPS和HbHMGS1分别提高了14.71和15.05倍。说明乙烯刺激橡胶树后,‘湛试327-13’胶乳和树皮中活性氧淬灭酶、蔗糖转运蛋白、胶乳抗性和橡胶生物合成关键酶基因依次高表达且持续时间长达6刀(18 d...     

木薯转录因子MeERF117的克隆及表达分析

AP2/ERF (APETALA2/ethylene responsive factor)类转录因子是植物应答多种逆境胁迫机制中的关键组分,研究木薯AP2/ERF家族成员将有助于解析该家族在木薯抗逆胁迫中的功能。基于已有木薯基因组序列信息,以木薯块根cDNA为模板,克隆得到一段长度为927 bp的cDNA,命名为MeERF117,该基因编码308个氨基酸。MeERF117蛋白分子量为35.08 kD,且该蛋白仅含一个AP2/ERF结构域,属于ERF转录因子家族。在进化关系上,Me ERF117蛋白与巴西橡胶树的ERF蛋白最相近。亚细胞定位观察到MeERF117蛋白分布于细胞质和核中。实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR)方法检测MeERF117基因在木薯块根采后生理性变质(Post-harvest physiological deterioration, PPD)过程中的相对表达量,发现PPD的发生可提高MeERF117因子的表达水平,在PPD后期(48 h)时MeERF117的相对表达量是未发生PPD (0 h)时的2倍,表明木薯块根PPD的发生...     

巴西橡胶树RALF基因家族的鉴定及其表达分析

快速碱化因子(rapid alkalinization factors, RALFs)是一种植物多肽类激素,参与胞内MAPK信号传递、细胞伸长调控、花器官发育及免疫应答等植物重要生理过程。本研究利用生物信息学方法对橡胶树RALF基因家族进行全基因组鉴定,对其序列特性、基因结构、保守基序、系统进化及表达特性进行系统研究。通过同源比对在橡胶树基因组中共鉴定到16个RALF基因,分别命名为HbRALF1～HbRALF16。序列分析结果表明,这些基因编码氨基酸数目介于108～149 aa之间,分子量和等电点分别介于11.92～16.88 kD和5.41～9.33。多序列比对结果表明,HbRALFs含有S1P蛋白酶识别位点、受体蛋白识别位点YISY保守序列和四个保守半胱氨酸。基于转录组数据的组织和乙烯刺激表达特性分析显示,16个橡胶树RALF基因至少在一个组织中表达,8个胶乳中高表达的RALF还参与乙烯刺激响应。本研究为进一步研究RALF基因家族在橡胶树关键农艺性状调控中的作用提供参考依据。     

巴西橡胶树幼叶和成熟叶比较蛋白质组学初步研究

为研究不同发育时期橡胶树叶片的功能代谢及揭示天然橡胶胶乳的合成调控机制,本研究以巴西橡胶树古铜期幼嫩叶片（幼叶）和稳定期完全成熟叶片（成熟叶）为实验材料,提取蛋白并进行双向电泳分离,结果发现幼叶与成熟叶相比,蛋白表达图谱差异显著,鉴定出的已知蛋白中多数参与了碳代谢及蛋白的翻译后修饰功能。本研究建立了成熟的巴西橡胶树叶片比较蛋白质组学研究的技术体系,获得了高分辨率的叶片蛋白双向电泳参考图谱,鉴定出来的腈裂解酶A链,核酮糖1,5-二磷酸羧化酶和肌动蛋白等在幼叶和成熟叶片中的表达量不同,这些结果为进一步揭示天然橡胶合成调控机制提供了一定的技术支撑与实验数据,对天然橡胶合成机制的研究以及其它热带植物叶片的蛋白质组学研究具有一定的参考意义。     

巴西橡胶树FKBP基因家族成员的鉴定及表达分析

FKBP蛋白是PPIase蛋白酶家族的重要成员,在植物生长发育及响应外界胁迫中起关键调控作用。利用已发表的水稻和拟南芥FKBP序列为诱饵,本研究从橡胶树全基因组数据中鉴定出23个HbFKBPs。进化树分析表明这些成员可归为三个亚类;基因结构结果显示每个成员至少含有两个内含子,且亲缘关系较近的成员具有类似的内含子数目和排布方式;转录组数据分析表明HbFKBPs在橡胶树不同组织、叶片不同发育时期及乙烯利处理后不同阶段胶乳中的表达存在差异。橡胶树HbFKBPs的鉴定为深入探索橡胶树生长发育及响应外界胁迫中的分子机制提供一定基础。