西瓜根系蛋白质双向电泳体系的建立及优化

为建立高效、稳定的西瓜根系蛋白质双向电泳技术体系,对西瓜根系蛋白质样品等电聚焦(IEF)条件、样品上样量、IPG胶条p H值范围、染色方法等参数进行优化。结果表明,采用TCA/丙酮法提取西瓜根系总蛋白,裂解液组成为7 mol/L Urea、2 mol/L Thouirea、4%CHAPS(m/V)、1%Cocktail(V/V)、65 mmol/L DTT、2%p H值4~7 IPG Buffer,上样量为800μg,p H值4~7 IPG(13 cm)胶条、IEF条件为48 000 Vh,分离胶浓度为12.5%,CBB-R250染色时,可获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,该技术条件为适合西瓜根系蛋白分离的较优双向电泳体系。     

玉米籽粒蛋白质双向电泳技术体系的优化

为了获得玉米籽粒双向电泳中蛋白质提取的最佳方法,建立最佳的玉米籽粒蛋白双向电泳技术体系,对酚抽提法、三氯乙酸/丙酮沉淀法(TCA/丙酮沉淀法)和可溶性蛋白提取法3种不同提取方法得到的蛋白质进行了分析,并在相同条件下进行双向电泳比对分析,结果表明:可溶性蛋白提取法获得的蛋白纯度高、浓度适中、双向电泳蛋白质点最丰富,最适合双向电泳研究;利用可溶性蛋白提取法获得的蛋白,对第一向等电聚焦参数等条件,以及不同p H值范围的IPG预制凝胶条进行了比较分析,结果表明:采用p H值3~10的IPG预制凝胶条时,采取电压梯度上升的方式,总聚焦70 000 Vhs、上样量800μg效果最佳,采用p H值4~7的IPG预制凝胶条时,总聚焦80 000 Vhs、上样量900μg效果最佳,并且采用p H值4~7的IPG预制凝胶条相比p H值3~10的凝胶条能分离到更多的点,最后结合蛋白质点MALDI-TOF-TOF质谱鉴定分析,建立了一套适用于玉米籽粒的蛋白质双向电泳技术方法,即采用可溶性蛋白提取法提取蛋白,采用24 cm、p H值4~7的IPG干胶条,上样900μg电泳效果最佳,等点聚焦程序:500 V、1 h,1 000V、1 h,2 000 V、1 h,4 000 V、2 h,8000 V、4 h,8 000 V、80 000 Vhs,500 V保持。试验研究为后续玉米籽粒发育差异蛋白研究奠定了技术基础。     

蓖麻种子蛋白质双向电泳优化体系的建立

为建立蓖麻种子蛋白质双向电泳优化体系,本研究以‘2129’品系蓖麻种子为试验材料,采用2-DE技术的方法,对其进行研究。结果表明:酚提取法比TCA/丙酮沉淀法更适宜提取蓖麻种子的总蛋白质;24 cm pH 3-10NL的干胶条比pH 4~7的干胶条更适宜应用在蓖麻种子的2-DE电泳中;对蛋白质样品进行除杂比不除杂得到的蛋白质图谱更加清晰,且横条纹和纵条纹都有所减少;蛋白质上样量为800μg时获得的蛋白质图谱最佳。本研究将为蓖麻种子蛋白质组学的研究提供基础数据和技术支持。     

百合总蛋白质提取及双向电泳技术体系优化

本研究以百合组培苗叶片为试验材料,研究不同蛋白提取方法的得率、电泳上样量及聚焦除盐时间对双向电泳图谱的影响。结果表明:采用三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法提取百合叶片蛋白质比Tris-HCl法效果好,蛋白得率为38.5 mg/g,且颜色较白,获得的2-DE图谱较好;上样量为600μg时得到的图谱分辨率高、蛋白斑点分布均匀、清晰;等电聚焦(Iso-electrofocusing,IEF)中的2个除盐步骤的时间分别为2 h和2.5 h时,可以较好地去除盐分,顺利完成聚焦并得到较好的双向电泳图谱。该体系的建立将为下一步百合蛋白质组学研究及利用分子育种技术培育抗病品种提供技术资料。     

薄皮甜瓜果实总蛋白质双向电泳优化体系的建立

为建立适宜的薄皮甜瓜果实总蛋白质双向电泳的试验体系,以‘京蜜11号’薄皮甜瓜为试材,从果实总蛋白质的提取方法、等电聚焦条件、IPG胶条梯度等方面进行了探索优化。结果表明,酚-甲醇/醋酸铵沉淀法能够高效的提取薄皮甜瓜果实总蛋白质,选用24 cm pH 4~7的IPG胶条,800 μg上样量,120000 Vhs聚焦,SDS-PAGE电泳后采用胶体考马斯亮蓝染色。该优化的体系可以获得背景清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。     

刺参体腔液蛋白质双向电泳体系的建立及优化

为了探索并建立刺参的体腔液蛋白双向电泳体系,实验对刺参体腔液的蛋白质制备方法、上样量、IPG 胶条的pH选择及等电聚焦程序进行了优化,并利用银染法进行染色。结果表明：改进的TCA-丙酮沉淀法增加了提取的蛋白量和纯度;采用8.5 cm,pH 4~6.5的IPG胶条,45 μg蛋白上样量,等电聚焦先设250 v电压,7 mA电流,聚焦时间30 min后,再将电压升至1000 v,聚焦时间3 h,能有效提高双向电泳(2-DE)图谱中蛋白点的分离度和分辨率。本实验可用于筛选刺参差异表达蛋白以及后续的刺参蛋白质组学研究。     

甘蓝型油菜蛋白质双向电泳体系的建立

选用油菜品种08127,采用TCA-丙酮提取方法,pH 4~7胶条和改进的IEF聚焦程序,得到较好的蛋白质双向电泳结果,建立了一种适合甘蓝型油菜的双向电泳体系;利用其他甘蓝型油菜品种的幼苗、叶片和茎中的蛋白检验了建立的实验体系,都能得到较好的蛋白质双向电泳结果;利用该实验体系比较甘蓝型油菜幼苗不同发育时期蛋白质双向电泳图,找到二者之间的差异点,选取部分点成功进行了质谱分析。     

棉花根系总蛋白质提取及双向电泳方法的改良

对棉花根系蛋白的双向电泳提取技术进行改良,以获得更好的分离效果,为棉花根系蛋白质组学研究奠定基础。以鲁棉研28为材料,分别采用TCA/丙酮法、改良TCA/丙酮/SDS法、饱和酚-甲醇醋酸铵法这3种根系蛋白质提取方法,提取棉花幼苗根系总蛋白,并进行双向电泳进行蛋白质分离。在蛋白质含量、蛋白纯度和电泳图谱等方面对3种方法进行比较。利用饱和酚-甲醇醋酸铵提取法提取的棉花根系蛋白,其蛋白样品纯度高,SDS-PAGE电泳图谱清晰,蛋白点数量最多为601个点;TCA/丙酮法提取得到的蛋白总量最高约为7.53 mg/g,但样品纯度低,SDSPAGE电泳图谱模糊,蛋白点数量最少为417个点。采用考马斯亮蓝染色,上样量为1 500μg获得的凝胶图谱效果较好。总之,适合棉花根系蛋白质提取的方法为饱和酚-甲醇醋酸铵法,在考马斯亮蓝染色蛋白质上样量为1 500μg时能获得优良的分离效果。     

棉花叶片蛋白质组双向电泳技术的优化

 以棉花叶片为材料,针对试材中含有大量色素、酚、醌等干扰物质的问题,从蛋白提取方法、裂解液成分、上样量等方面对棉花叶片蛋白质组双向电泳技术进行优化。结果表明：采用改良的TCA/丙酮法提取棉花叶片总蛋白,含有7 mol·L^-1尿素、2 mol·L^-1硫脲、4% CHAPS、80 mmol·L^-1 DTT、1 mmol·L^-1 PMSF、0.3%载体两性电解质的裂解缓冲液,上样量为600 μg,采用pH 4～7、24 cm的IPG胶条进行双向电泳时,2-DE图谱的蛋白点分布均匀、清晰且重复性好。本体系为开展棉花蛋白质组学研究奠定了技术基础。     

花生叶片蛋白质双向电泳的方法与优化

以花生品种鲁花14为试验材料,提取叶片可溶性蛋白进行双向电泳分析。在三氯乙酸/丙酮沉淀法的基础上,对样品抽提、样品溶解、胶条pH范围选择、蛋白上样量、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等关键步骤进行改进,获得了蛋白点较多、重复性好的双向电泳图谱,为开展花生叶片蛋白质组研究奠定了基础。     

甜菜双向电泳体系条件的优化

为了获得甜菜叶片双向电泳中蛋白质最佳提取方法,建立甜菜叶片蛋白质双向电泳最佳的双向电泳体系。以甜菜叶片为材料,通过比较分析,研究甜菜叶片总蛋白提取方法、IPG胶条pH值及其对应上样量等因素对甜菜叶片蛋白质双向电泳结果的影响。结果表明:酚提取法、TCA/丙酮提取法和可溶性蛋白提取法3种蛋白提取方法中TCA/丙酮法提取效果较好,pH值4~7与pH值5~8的双向蛋白电泳比较发现:pH值4~7胶条蛋白点清晰且在图谱上的蛋白点分布均匀,无蛋白点集中现象,更适合甜菜叶片的蛋白质组分析。采用7 cm线性固相IPG胶条进行双向电泳,150μg上样量蛋白点明显增多,双向电泳效果更好,pH值4~7的17 cm胶条300μg上样量胶点更多更清晰,试验结果为甜菜蛋白质组学的研究提供了最佳的试验方法。     

陆地棉花药蛋白质组分析中双向电泳技术体系的建立与优化

建立了适用于陆地棉花药蛋白质组研究的双向电泳技术.以陆地棉花药为材料,采用液氮研磨的方法破碎组织,然后用三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法和苯酚抽提结合甲醇/醋酸铵沉淀法提取蛋白质.采取载体两性电解质pH梯度等电聚焦/SDS-PAGE和固相pH梯度等电聚焦/SDS-PAGE双向凝胶电泳,对陆地棉花药总蛋白质进行了分离.通过...     

籽粒苋根系蛋白的提取与双向电泳体系的建立

本研究以籽粒苋根为试验材料,比较3种不同蛋白提取方法对蛋白质双向电泳的影响,并对其中的蛋白上样量和等电点聚焦时间进行了优化。结果表明:与酚抽提法和TCA-丙酮法相比,Tris-Hcl法提取籽粒苋根系蛋白效果较好;上样量800μg和聚焦时间70 000 Vh的条件下会得到理想的双向电泳图谱。采用优化后的条件,可以得到蛋白点数量多、背景清晰的双向电泳图谱,将为下一步镉胁迫下籽粒苋根系蛋白质组学研究及利用分子育种技术培育耐镉的籽粒苋新品种提供技术资料。     

叶用莴苣叶片蛋白质双向电泳技术体系的建立

为建立适用于生菜的(Lactuca sative L.)蛋白质组研究的双向电泳技术(2-DE),以叶用莴苣S24为材料, 采用TCA/丙酮沉淀法提取叶片蛋白,比较了两种标准曲线对蛋白浓度测定的影响,同时探讨了蛋白裂解、等电聚焦(IEF)条件以及其他一些关键技术,结果显示：与传统标准曲线相比,采用改良后标准曲线测定的蛋白浓度更准确,得到了背景清晰、重复性好、蛋白点分辨率较高的双向电泳图谱。初步建立了叶用莴苣叶片蛋白质的双向电泳技术(2-DE)体系。     

虉草种子破眠蛋白质双向电泳体系的建立

为了建立一套适合于虉草种子破眠蛋白质双向电泳的技术体系,以内蒙古民族大学农学院选育的通选一号虉草种子为试验材料,对其蛋白质提取方法、分离技术等进行了探讨。结果表明:采用三氯乙酸/丙酮沉淀法(TCA/A法)提取种子蛋白,结合使用p H 4~p H 7的18 cm IPG胶条,200μg的上样量,12%SDS-PAGE胶,硝酸银法染色,可得到清晰、丰富的蛋白质点。     

黄瓜雌花花冠蛋白质双向电泳技术体系的建立

[目的]为建立适合黄瓜(Cucumis sativus L.)雌花花冠蛋白质双向电泳技术体系,[方法]以开花当天的黄瓜雌花花冠为试验材料,从蛋白质提取方法、IPG胶条梯度、等电聚焦程序、蛋白质上样量、染色方法等方面进行了探索。[结果]结果表明：酚抽提法得到的黄瓜雌花花冠蛋白质纯度高、产量高。17cm pH4~7 IPG胶条得到的双向电泳图谱蛋白质点分布均匀、清晰。优化后的等电聚焦程序适当增加了低压除盐步骤和时间,得到的双向电泳图谱蛋白质点圆且多。300μg上样量的双向电泳图谱蛋白质点可达400多个,低丰度蛋白质点清晰。硝酸银染色的双向电泳图谱蛋白质点较多。[结论]该实验获得了蛋白质点分布均匀、背景清晰、分辨率高、质量高的双向电泳图谱,为研究黄瓜雌花花冠蛋白质组学奠定了基础。     

苦瓜种子蛋白质组双向电泳技术条件的优化

通过对苦瓜种子蛋白质样品的提取方法、等电聚焦参数、SDS-PAGE分离胶浓度以及胶条pH范围的优化筛选,建立了适合苦瓜种子蛋白组分析的双向电泳体系.结果表明:使用TCA-丙酮提取方法提取苦瓜种子蛋白,更适用于双向电泳分析,结合使用pH=5~8 IPG胶条以及优化的聚焦程序,能获得分辨率较高、蛋白点清晰、重复性好的2-DE图谱.经银染显色,可检测约660个蛋白点,主要分布在p H=5~8;该体系适合用于分析苦瓜种子的蛋白质组.     

薄壳山核桃蛋白质测定方法比较以及双向电泳体系的建立

本研究以薄壳山核桃生长季方块芽接不同发育时期的嫁接为材料,采用不同的蛋白质抽提方法(TCA-丙酮沉淀法,改良TCA-丙酮沉淀法,Tris-HCL浸提法和酚抽提法)、上样量及IPG胶条p H范围等关键因素进行探索与优化,旨在获得薄壳山核桃蛋白的最佳提取方法,并建立适用、高效的薄壳山核桃蛋白质双向凝胶电泳技术体系。Tris-HCL浸提法进行蛋白质的提取效果最佳,可检测到的蛋白质点数量最多约为1 504个,蛋白质中杂质较少,凝胶背景较清晰,基本无横向和竖向条纹,分离出的蛋白质点基本没有拖尾现象。以p H 4~7的IPG胶条、上样量260μg进行双向电泳,蛋白点数量多,分离效果好,基本没有重叠现象,效果最佳。     

玉米蛋白质组研究中双向电泳技术条件的优化

为了优化玉米叶片双向凝胶电泳技术条件,通过比较3种总蛋白提取方法对玉米双向电泳结果的影响,并对蛋白质上样量、IEF等电聚焦条件及SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度等参数进行探索、优化;结果发现,与酚提取法和磷酸缓冲液法相比,采用改进的TCA/丙酮法提取总蛋白操作简单、方便,所得的2-DE图谱中蛋白质点数量多、背景清晰,是一种适用于提取玉米苗期叶片总蛋白的有效方法;同时筛选出:第一向IEF等电聚焦样品上样量为800μg,聚焦条件为20 000 V/h,在浓度为12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,能够在17 cm的IPG胶条上获得背景低、分辨率较高、重复性好的双向电泳图谱,该优化体系适用于玉米叶片蛋白质组双向电泳分离,对玉米蛋白质组学研究具有重要参考价值。     

大白菜cDNA-AFLP分析体系的优化

本研究以高感、高抗大白菜小黑点病的大白菜叶柄为试材,对影响cDNA-AFLP分析体系的几个关键因素进行分析,建立了适宜大白菜的cDNA-AFLP分析体系,并得到了较为清晰可辨的cDNA-AFLP图谱。结果表明:试剂盒法提取的NA较完整,纯度较高;400ng的cDNA利用FastDigest EcoRⅠ和Fast-Digest MseⅠ进行快速双酶切50min,酶切充分;在20μL的体系中,连接产物取原液作为预扩增反应的模板,并且预扩增反应的循环数为35,预扩增产物稀释20倍作为选择性扩增的模板,扩增结果最佳;MBI2×PC Master Mixture反应体系满足扩增反应的需要,不需要另外摸索反应条件,节省了试验成本;选用64对AFLP引物进行扩增,筛选出具有多态性条带丰富的AFLP引物45对。本研究为利用cDNA-AFLP分析大白菜小黑点病的的发病机理奠定了基础。