大豆细胞色素P450基因GmCYP78A69的克隆和生物信息学分析

干旱胁迫会影响大豆籽粒发育进而影响产量,但其中的机制尚不明确。本研究通过分析基因表达综合数据库(gene expression omnibus, GEO)中受到干旱胁迫的大豆芯片数据,筛选了3个响应干旱的细胞色素P450 (CYP450)基因,且三者均为CYP78A亚家族成员。该亚家族成员在多种植物中被证明参与种子大小的调控。在大豆品种‘齐黄34’中克隆了一个对干旱胁迫响应程度最大的CYP450基因GmCYP78A69。生物信息分析发现该基因含有CYP450家族蛋白的保守结构域,亚细胞定位预测及跨膜结构域分析表明该蛋白定位于内质网,且通过一段跨膜结构域嵌入到内质网膜上。其高级结构以α螺旋和无规则卷曲为主,含有少量的延伸链和β转角。在大豆不同组织中的表达分析表明该基因在各个器官中均有表达,其中在茎尖、花和幼荚中的表达量最高,推测该基因可能与花荚发育有关。本研究为探索GmCYP78A69在抗旱和种子形成等过程中的作用提供了基础,为研究干旱影响大豆种子大小的机制提供了切入点。     

白菜型油菜PABP5基因启动子的克隆及表达特性分析

本研究中利用基因组步移法从白菜型油菜中克隆到Poly(A)结合蛋白基因PABP5起始密码子上游长588 bp的一段序列,经软件分析预测表明,该序列具有典型的启动子结构,并且具有多个与花药特异性表达相关的顺式作用元件,如TATA box,CAAT box,AGAAA motif,AGGTCA motif,AAACCCTAA motif,GTGA motif等.为了研究该片段的表达特性,本文将克隆到的序列置换pPBI121中的CaMV35S启动子,驱动其下游的GUS基因,构建了植物表达载体,转化拟南芥,获得了转基因植株.组织化学染色表明,在PABP5启动子Ppabp5的驱动下,报告基因GUS在拟南芥的根尖、第一片真叶叶原基以及花药中特异表达.本研究为PABP5基因的进一步功能研究奠定了基础.     

白桦4CL基因启动子克隆及表达分析

为研究4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)在白桦木质素合成代谢过程中的组织特异性表达,利用染色体步移法克隆其启动子,用该启动子定向置换pBI121载体的35S启动子,构建重组载体P_(4CL)::GUS。利用瞬时转化法将重组载体转入白桦实生苗茎后进行GUS染色。结果显示:获得了4CL基因编码区起始密码子上游长1344 bp的启动子序列,该启动子除分布有TATA-box、CAAT-box等基本的转录起始元件外,还存在多个顺式作用元件序列位点,包括35S启动子作用元件ASF,参与脱落酸响应的顺式作用元件ABRE,参与茉莉酸甲酯响应的顺式调控元件CGTCA-motif,以及光反应元件G-Box、ACE、4CL-CMA2b等;启动子表达分析结果显示经过瞬时侵染的白桦茎段被染成蓝色。以上结果表明克隆获得的4CL基因启动子具有启动子表达活性,其可能参与了白桦木质部的发育。     

茉莉花MK基因及启动子克隆与表达分析

甲羟戊酸激酶在植物萜类化合物合成中具有重要作用。本研究以茉莉花转录组测序数据为基础,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从双瓣茉莉花中获得甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase,MK)基因,命名为JsMK(GenBank登录号为MH311040)。测序结果显示JsMK全长cDNA为1608 bp,包含开放阅读框(ORF)1164 bp,编码387个氨基酸。生物信息学分析结果表明该基因编码的蛋白可能定位于细胞质中,为非亲水性稳定蛋白,含有与其他MK蛋白所共有的3个保守区,以及GHMP家族特有的N端保守区和C端保守区。Blast比对和系统进化树分析结果表明,JsMK蛋白与野生油橄榄、长春花等多种植物的MK蛋白同源性较高。采用染色体步移技术(Genenome walking technique)扩增MK基因5’端上游调控序列,获得709 bp启动子序列,PlantCare分析表明该序列含有大量基本顺式作用元件TATAbox、CAATbox,还存在生长素(IAA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)等激素响应激素及多个光响应顺式调控元件。利用实时荧光定量PCR检测Js MK在IAA、MeJA、ABA处理下的表达水平。结果表明,JsMK同时受IAA、MeJA及ABA不同程度的诱导表达,其中MeJA对其诱导最明显。本研究通过从茉莉花中克隆并分析JsMK基因及其启动子序列,为进一步研究JsMK基因在萜类合成调控的功能提供科学依据。     

水稻OsGLYI11.2基因启动子的克隆及表达分析

启动子对基因时空表达的调控具有关键作用。本研究利用PCR克隆了一个水稻乙二醛酶(Glyoxalase)基因Os GLYI11.2的启动子区域片段(GenBank:AB017042.1),利用PlantCARE对该片段进行了顺式作用元件分析;构建了pOsGLYI11.2∷GUS表达载体并通过农杆菌介导转入水稻中,通过检测转基因植株中GUS基因在不同器官中的表达,分析了启动子的表达调控模式。结果显示：该启动子含有调控基因表达的7类调控顺式元件,能驱动GUS基因在水稻不同组织中(胚,胚芽鞘,花)表达。说明本研究所克隆的OsGLYI11.2基因上游2 120 bp的DNA片段具有启动子活性,能够驱动报告基因的表达。本研究结果可为进一步研究OsGLYI11.2基因在水稻中的功能及其相关调控机制提供基础。     

小叶杨TMM基因启动子克隆及表达模式分析

气孔作为植物与外界进行气体交换的通道,对植物自身的生长发育至关重要。研究表明植物TMM蛋白与植物气孔的形成发育密切相关。本研究利用PCR技术克隆了小叶杨(Populus simonii Carr.)TMM基因5’端上游的调控序列pPsTMM,长度为2336 bp。生物信息学分析结果表明:小叶杨启动子pPsTMM除了含有TATA-box、CAAT-box等核心启动子元件之外,还含有多种光响应元件、植物激素响应元件、抗逆胁迫相关元件以及生理代谢和生长发育相关元件等,说明转录活性还可能受到光、植物激素、逆境胁迫等因素诱导。利用双酶切法构建植物表达载体pBI121-pPsTMM-GUS,叶盘法稳定遗传转化烟草,GUS化学组织染色显示GUS主要集中在叶芽起始发育部位表达,说明pPsTMM启动活性具有组织特异性。对非生物胁迫的转基因烟草进行GUS化学染色以及进行荧光定量PCR,结果显示pPsTMM对不同因素的非生物胁迫响应程度存在差异性,干旱和盐胁迫下启动活性很低,高温和低温对其调控作用也不明显,但对外在施加的植物激素(GA,NAA,ABA)和水杨酸(SA)响应程度很高,说明pPsTMM启动子对物理因素的响应值要远低于化学因素的诱导。本研究为进一步阐明TMM蛋白表达模式与小叶杨气孔发育特性及抗旱性之间的分子机制提供理论基础。     

贡菊CmNAC78的克隆及启动子元件分析

NAC是植物中特有的一类转录因子,对植物生长发育和抵御非生物胁迫起着重要的作用.本试验以贡菊为材料,克隆CmNAC78基因,其最大开放阅读框(ORF)为1 641 bp,编码547个氨基酸,包含A、B、C、D、E五个结构域;CmNAC78分子量为1 354.64 kD,理论等电点为5.01,不稳定系数为38.37,平均...     

新疆野扁桃CBF基因启动子克隆及瞬时表达分析

CBF基因主要功能是调控下游大量抗冷基因的表达。CBF基因是植物抗冷途径的枢纽,对增强植物的抗冷能力极为重要。本研究利用染色体步移法得到了新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schleche)CBF基因家族成员Als CBF翻译起始位点上游的启动子序列,长度为1 391 bp(Gen Bank登录号:KP662710)。对启动子序列进行生物信息学分析表明,该序列存在启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box,并且含有多个与植物非生物胁迫有关的响应元件:ABA响应元件、MYB、MYC结合位点、光应答元件和LTRE低温应答元件等。在烟草叶片中进行瞬时表达的结果表明,该启动子序列具备在逆境胁迫下诱导驱动报告GUS基因表达的功能。本研究可为揭示CBF基因在野扁桃抗寒性、抗旱性等抗逆过程中的作用机理,以及为增强野扁桃CBF基因在扁桃的抗逆性遗传改良中的作用奠定一定的基础,同时对野扁桃的繁育和保护也有极为重要的意义。     

地被菊CmGATA8基因及启动子克隆与表达分析

地被菊花色艳丽、花型整齐、花香清新淡雅,但在东北地区很多地被菊品种不能越冬.本试验以地被菊'YINGJIE'为材料,克隆CmGATA8,全长为1 152 bp,最大开放阅读框(ORF) 951 bp,编码317个氨基酸,包含一个GATA结构域;CmGATA8分子量为34.75 ku,等电点为6.07,不稳定系数为59....     

柠条锦鸡儿CkF5H基因及启动子的克隆

为了研究CkF5H基因在柠条锦鸡儿中木质素生物合成途径方面中的生物学功能,以我国西北干旱荒漠地区重要的豆科饲用灌木柠条锦鸡儿为材料,克隆了1个木质素合成相关的CkF5H基因,该基因c DNA全长1 679 bp,g DNA全长3 495 bp,具有2个外显子,1个内含子,编码520个氨基酸,Gen Bank登录号HQ829862。通过染色体步移的技术克隆了1 550 bp的启动子序列,对启动子序列上的响应元件进行了分析。结果显示,具有昼夜节律响应元件、防御与胁迫响应元件、赤霉素顺式作用元件和热响应元件等。CkF5H富含二级结构,其中α螺旋占39.81%,β折叠占15.96%,不规则卷曲占44.23%,并预测其三维结构。对CkF5H基因推导的氨基酸序列预测分析得出,CkF5H蛋白等电点为6.45,分子量为58.09 ku,不稳定系数45.72,是不稳定蛋白,总平均亲水性-0.143,属亲水性蛋白。因此,克隆柠条锦鸡儿的CkF5H基因并详细分析,可为进一步研究该基因提供理论依据。     

棉花半乳糖基转移酶基因GhGalT1启动子的克隆及表达分析

糖基转移酶(glycosytransferase, GT)是催化活化的供体糖基转移到特异受体生成糖苷键的酶类, 在应答多种生物和非生物胁迫中起重要作用。本研究利用PCR技术从陆地棉品种Coker 312基因组中分离克隆了GhGalT1基因的启动子, 序列长度为539 bp, 命名为pGhGalT1。启动子分析软件PlantCARE分析表明pGhGalT1含有CAAT-box、TATA-box核心元件, 以及响应干旱、热、脱水、防御与胁迫应答的顺式作用元件MBS、HSE、MYCCONSE、TC-rich repeats和CGTCA-motif等。因此将pGhGalT1构建到启动子检测载体pBI101-GUS上, 形成pBI101-pGhGalT1-GUS融合表达载体, 以检测其启动子活性。通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥, 经卡那霉素抗性筛选及PCR检测成功获得阳性转基因植株。对T₃代转基因拟南芥进行组织化学染色分析显示该启动子主要在生长5~15 d的幼苗主根及侧根根尖表达, 在子叶及莲座叶边缘也有微弱表达。非生物胁迫和激素处理后的组织化学染色、GUS酶活性及GUS基因定量分析结果显示GhGalT1基因的启动子受盐、渗透胁迫和激素(6-BA、MeJA、BL)的诱导, 该结果为合理选用启动子改良作物提供理论依据。     

海岛棉GbCHI基因启动子的克隆及瞬时活性表达分析

查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)是类黄酮代谢途径中关键的限速酶之一,与植物的花色形成、抗虫、抗病等特性密切相关.本研究利用前期转录组测序及差异基因表达分析,筛选到与海岛棉抗枯萎病相关基因GbCHI,并从海岛棉抗病品种'06-146'基因组中克隆了该基因的启动子,序列长度为2 062 bp.启...     

甘蓝型油菜BnaFIL基因启动子的克隆与表达分析

为了进一步了解启动子在甘蓝型油菜FIL基因(BnaFIL)表达调控中的作用,根据甘蓝型油菜基因组数据,以甘蓝型油菜叶片提取的DNA为模板,对甘蓝型油菜BnaFIL基因的启动子序列pBnaFIL进行克隆,长度为1 326 bp。采用PlantCARE在线分析软件对该启动子序列进行生物信息学序列分析,结果表明,该序列含有参与光反应的部分保守DNA模块以及CAAT-box和TATA-box等核心启动子必备元件,与分生组织表达有关的顺式作用的调控元件CAT-box以及光敏反应元件。通过该启动子序列替换pBI121植物表达载体上的CaMV35S启动子,使该启动子与GUS基因融合获得pBnaFIL-GUS表达载体,将载体通过农杆菌花序浸染的方法转入拟南芥中,获得了早花启动子重组质粒阳性转基因株系和晚花启动子重组质粒阳性转基因株系。之后对转基因拟南芥植株进行GUS染色分析,对启动子的表达效果进行了检测,最终在不同的转基因拟南芥植株中均发现了GUS基因的表达。结果表明,早花材料与晚花材料中启动子表达强弱存在差异,早花材料启动子的驱动基因表达效果比晚花材料启动子的驱动效果要好,由此推断,启动子的驱动效果...     

水稻基因启动子Ospz4的克隆与表达分析

利用Affymetrix水稻表达芯片分析了超级稻两优培九母本培矮64S(Oryza sativa L.)在经过低温、干旱、高温等逆境条件胁迫处理后,不同组织器官在不同的生长发育时期全基因组的表达差异。筛选到一个在正常条件和逆境条件下均有较高表达水平的基因Os SG4(Gen Bank登录号:AK068991.1),从水稻日本晴基因组中克隆得到其上游启动子区域Ospz4(1 625 bp),将其与GUS报告基因融合构建植物表达载体p CAMBIA1301P4,并用农杆菌介导法转化台北309获得转基因植株。组织化学染色结果表明,Ospz4启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株的叶片,根、茎、颖花、胚乳及胚芽鞘中均有表达。在该启动子的基础上,构建了4个不同长度的5'端缺失片段启动子与GUS报告基因融合的植物表达载体,通过注射烟草(Nicotiana benthamiana)进行瞬时表达分析,结果表明,4个片段均可驱动GUS基因的表达,其中最短片段(492 bp)的表达活性最强。本研究表明Ospz4启动子可用于研究与遗传改良生产,具有重要的理论与实践价值,并有助于该启动子的改造。     

荔枝GRX基因启动子的克隆与瞬时表达分析

为了研究荔枝GRX基因的调控机理,本研究利用PCR的方法克隆了该基因上游1 996 bp的启动子片段并对其功能进行了初步分析,结果表明:荔枝GRX基因启动子序列中含有大量的TATA-box和CAAT-box保守元件,以及ARE、HSE、MBS、TC-rich repeats、TGA-element等各种转录调控相关的顺式作用元件。基因枪表达分析表明,该启动子能驱动GUS基因在荔枝的花、叶、根、果皮以及果核中表达而在果肉中不表达,具有组织特异性。为进一步研究荔枝GRX基因的表达模式和调控机理提供了基础与依据。     

银杏FLS基因启动子克隆及序列分析

黄酮醇合成酶基因（FLS）是黄酮类化合物合成通路中的重要基因,直接决定着银杏黄酮类化合物的积累量。为了探索FLS基因在转录水平上的表达调控机制,本文在克隆银杏FLS基因启动子序列的基础上,利用生物信息学方法,分析了该基因的启动子结构。结果表明,FLS基因启动子中包含了3个MYB转录因子结合位点和9个光信号应答位点,为确立银杏FLS基因与CHI基因间的共调控关系及揭示FLS基因应答光信号的转录调控机制提供了分子基础。     

文心兰生物钟基因OnELF3启动子克隆与表达分析

为了解文心兰生物钟基因OnELF3的转录调控,本研究采用TAIL-PCR技术从文心兰基因组中克隆到OnELF3基因起始密码子上游2 204 bp的启动子序列。使用BDGP、PlantCARE和PLACE在线软件对OnELF3基因启动子的转录起始位点与顺式作用元件进行预测。结果表明启动子序列除包含TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件外,还包含组织特异性元件、光调控元件、植物激素响应元件、胁迫反应响应元件和昼夜节律调控元件等。为探究OnELF3启动子的表达活性,构建pCAMBIA1301-p OnELF3p:GUS载体,利用农杆菌介导法,转化烟草与拟南芥。烟草叶片瞬时转化表明克隆的OnELF3启动子序列具有启动子活性。转化拟南芥结果表明,OnELF3启动子能够驱动下游的GUS基因在T2代拟南芥中稳定表达,GUS组织染色显示该启动子呈现发育与组织特异性表达。这些结果为进一步研究文心兰OnELF3基因的转录表达调控与相关功能分析提供基础。     

海岛棉GbMYB5基因的克隆及表达分析

为了挖掘鉴定棉纤维发育相关基因,本研究根据海岛棉RIL群体定位的纤维强度QTL位点,结合转录组数据及海岛棉全基因组数据库注释信息,筛选出1个R2R3类MYB转录因子基因GbarA11G032760.1,根据该基因的注释信息,克隆并命名该基因为GbMYB5,qRT-PCR分析发现,在纤维发育15、20、25 DPA (D...