菘蓝开花抑制基因IiFLC的克隆和表达分析

为探索菘蓝生殖生长过程中的开花机理,利用PCR技术对菘蓝FLC基因进行克隆和表达分析。在获得的IiFLC基因的cDNA序列全长中含有一条长为585 bp的开放阅读框,可翻译为编码194个氨基酸残基的多肽链,具有典型的MADS-box结构域。通过与十字花科其他植物中的FLC蛋白质序列的系统进化分析发现,菘蓝与它们具有高度的同源性。应用实时荧光定量PCR技术对山西菘蓝自交一代材料的FLC基因的表达量进行定量分析,结果显示在菘蓝不同的器官中的表达量有显著差异,其中菘蓝根中的基因表达量最高,茎中的表达量最低,并在抽薹现蕾期至果期呈现明显的先减后增的变化趋势。     

苹果MdPDS基因的克隆及表达分析

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是苹果类胡萝卜素生物合成途径的关键酶。本研究运用电子克隆与RACE技术克隆得到‘澳洲青苹’苹果Md PDS基因(Gen Bank登录号:KU508828),该c DNA序列全长2 005 bp,包含1 725个碱基(121~1 845 bp)的完整开放阅读框,编码575个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,Md PDS编码的氨基酸序列与其他植物的PDS蛋白具有很高的同源性;其同样含有一个二核苷酸结合域和一个类胡萝卜素结合域。系统进化树分析表明,Md PDS与杏、碧桃和草莓蛋白亲缘关系较近,聚为一类。实时荧光定量PCR结果表明,Md PDS在‘澳洲青苹’苹果不同组织均有表达,其在树皮、果皮及叶片中的表达要明显高于花中的表达。此外,Md PDS在着色期套袋果实果皮中的表达量随果色增加而上升,而在非套袋果皮中的表达则变化不明显。上述结果表明Md PDS在苹果果实色泽发育过程中起着重要作用,也为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

牡丹PsAP1基因的表达分析及功能鉴定

为进一步探讨MADS-box基因家族在牡丹花器官发育和开花时间调控中的功能提供理论依据,为培育早花品种提供候选基因。以RACE扩增获得Ps AP1基因的全长c DNA为基础,分析了其表达模式和功能,以牡丹课题组利用454测序得到的类AP1基因的部分c DNA序列为基础,利用RACE扩增方法获得1 130 bp牡丹Ps AP1基因全长c DNA,同源性分析表明,牡丹Ps AP1与葡萄Vv AP1的相似性最高,为80.4%。实时定量PCR分析了其初花期的表达模式,结果表明,Ps AP1基因在萼片中转录量最高,其次为花瓣,在雄蕊中表达量最低。将Ps AP1基因在拟南芥中异源表达,分析鉴定了3个转基因株系的表型,结果发现异源表达Ps AP1拟南芥开花时间较野生型提前了约3 d。     

乌菜抽薹开花转录抑制因子BcFLC2的克隆与表达分析

抽薹开花是白菜类作物很重要的农艺性状。开花抑制基因FLOWERING LOCUS C(FLC)是春化过程中的关键基因,并受多个途径的调控。本研究从乌菜(Brassica campestris L.ssp.Chinensis var.Rosularis)中克隆得到FLC序列,命名为BcFLC2,开放阅读框长度591 bp,编码196个氨基酸。序列分析表明,该基因属于Ⅱ型MADS-box家族基因,其蛋白序列二级结构主要由α-螺旋、β-转角及无规则卷曲构成,属于亲水蛋白,亚细胞定位于线粒体中。序列比对及进化树分析发现,该蛋白序列与紫菜苔(B.rapa var.purpuraria)、菜心(B.rapa subsp.chinensis)FLC序列具有较高的同源性(98%)。荧光定量PCR分析表明,随着乌菜的发育,BcFLC2基因在叶片中的表达量逐渐降低;在不同组织中表达差异显著,其中,叶中表达量最高,茎和蕾次之,根中不表达。以上结果表明,BcFLC2基因在乌菜抽薹开花中起到重要的作用。     

桂花香气相关基因DXPS基因克隆及表达分析

本研究以四季桂花瓣和叶为材料,采用RT-PCR和RACE技术获得四季桂DXPS基因c DNA全长,并用凝胶定量软件Quanlity-One对四季桂不同季节花瓣和叶片及不同花期花瓣的半定量PCR产物的凝胶图像进行分析。结果表明,四季桂DXPS基因c DNA全长2 185 bp(Gen Bank登录号:KT099324),其中阅读框长1 926 bp,编码641个氨基酸,含有保守功能结构域TPP-DXS、TPP-PYR-DXS-TK-like及Transketolase-C;半定量PCR结果分析表明,四季桂DXPS基因表达量在花朵盛开期最高,花蕾期次之,衰弱期最低;在花瓣中的表达量要明显高于同时期在叶片中的表达量;在花瓣中,12月份DXPS基因的相对表达量最高,3月份次之,在6月份和9月份DXPS相对表达量较低。研究结果初步阐明了DXPS基因在四季桂开花过程中的表达模式,可为深入研究香气合成途径及开展花香植物的分子育种提供科学基础。     

梅花花器官发育相关基因PmSOC1-like的功能初探

SOC1/TM3(SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1/Tomato MADS-box gene 3)是MADS-box家族一员,它能够整合多条开花途径的开花信号,调节植物由营养生长向生殖生长的转变。在从梅花长蕊绿萼品种中克隆到3个SOC1同源基因PmSOC1-1、PmSOC1-2和PmSOC1-3的基础上,构建由CaMV35S启动子驱动的植物表达载体,并在拟南芥中过量表达,以研究其功能。通过对转基因植株表型观察发现,3个PmSOC1-like基因都具有使野生型拟南芥提前开花的作用。其中,PmSOC1-2作用最强,PmSOC1-1居中,PmSOC1-3作用最弱。对转基因拟南芥内源成花基因的qRT-PCR检测说明,PmSOC1-like基因主要是通过上调其下游花分生组织特性基因(AGL24、LFY、AP1和FUL)来促进植物开花;此外,PmSOC1-1和PmSOC1-2还导致了花瓣细丝状、花萼叶片化、花瓣和花萼宿存等花器官形态的改变,说明它们可能还具有影响花器官发育的功能。研究结果将有助于阐明梅花由营养生长向生殖生长转变的分子机制。     

苹果MdCPS基因的克隆、定位及其在柱型/普通型间的表达差异分析

为研究赤霉素合成途径关键酶基因,了解果树的矮化机理。以苹果品种富士当年生新梢的茎尖为试材,以苹果基因组数据库为依据,克隆了编码苹果CPS的基因MdCPS(GenBanK登录号：KC433942.1)。该基因gDNA序列含有15个外显子和14个内含子,其编码序列( Coding sequence,CDS)长度为2400 bp,共编码799个氨基酸。在已发表的金冠苹果基因组中,与该基因相对应的转录本是MDP0000147908,它的定位区间为chr11：32433834~32439214。同源性分析表明,MdCPS与其他植物的CPS间有较高的相似性(49%~67%)。以杂交组合富士(普通型)×舞姿(柱型)的亲本品种及F1后代当年生新梢的茎尖组织为试材,实时荧光定量PCR( qRT-PCR)分析表明,尽管该基因在柱型亲本中的表达水平显著低于普通型亲本,但在其后代的柱型与普通型群体间差异并不明显。同时,在柱型杂种及其普通型突变体间的分析结果也表明,MdCPS的表达水平与柱型性状没有明显的相关性。可见,柱型苹果茎尖组织中活性赤霉素含量偏低受其合成早期步骤关键酶基因MdCPS的影响不大。     

春兰AGL6基因的克隆及实时定量表达分析

本研究采用RT-PCR结合RACE技术从春兰(Cymbidium goeringii)中分离到一个AGL6基因。序列分析表明,该基因含有一个729bp长的开放阅读框(ORF),共编码242个氨基酸。系统进化树分析显示,该基因属于MADS-box基因家族AP1/AGL9组的AGL6同源基因,其编码的蛋白与其它植物AGL6类蛋白具有较高的同源性,命名为CgAGL6(基因登录号为HM208533)。实时荧光定量表达分析表明,CgAGL6基因春兰不同组织中均有表达,其中在唇瓣、花芽和子房中的表达量较高,在花瓣和萼片中的表达量次之,在根、叶和蕊柱中的表达量最低,显示了CgAGL6基因可能在春兰成花转变和花器官的形成过程中起着重要作用。     

矮牵牛DFR-A基因的克隆与表达分析

通过分离矮牵牛DFR-A基因,研究其在不同部位的表达规律和酶活性变化,为花色素苷合成的结构基因分离及其他研究奠定基础。基于已公布的矮牵牛DFR序列,直接从矮牵牛花瓣中分离了DFRA基因序列,利用实时荧光定量PCR技术研究其在不同器官中的表达特性,同时测定了不同器官中的DFR酶活性。（1）矮牵牛DFR-A基因cDNA序列为1473 bp,该基因最大开放阅读框为1143 bp,编码380个氨基酸。（2）DFR-A基因在矮牵牛各种器官中均有表达,但不同组织中表达量存在差异,在花药中的表达量最高,其次是初开和盛开花瓣中,各期花蕾中的表达量都较低,而在叶中表达量最低。（3）DFR酶在叶片及花药中几乎无活性。在初开花瓣中达到最高峰。（4）除花药以外的部位,DFR酶活性与DFR mRNA浓度存在线性相关性。矮牵牛DFR酶活性主要受转录调控,活性在初开花瓣中最高。     

外源基因在苹果转基因植株的稳定性研究

以继代培养13年的转豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因和新霉素磷酸转移酶(nptⅡ)基因苹果嘎拉、王林、乔纳金和富士组培苗及田间定植6～8年的转基因植株为试材,应用卡那霉素筛选和PCR扩增分析对外源基因的稳定性进行研究。结果表明,在57个苹果转基因株系组培苗中均可检测出CpTI特异基因片断;转化株系在添加50mg/L卡那霉素的培养基中生长正常。田间株系PCR检测结果表明,转入的外源CpTI基因在所测株系的叶片、花粉及大部分根系中稳定存在,有极少数株系的根系中未检测到特异表达条带。结果说明外源基因可以在转基因植株中稳定存在,但在不定根发生过程中有可能会丢失。     

双色鸳鸯美人蕉中花青素合成关键基因的克隆与表达分析

本研究以双色鸳鸯美人蕉为试材,采用RT-PCR技术扩增查尔酮合成酶基因(CHS)及二氢黄酮醇4-还原酶基因(DFR)序列,并利用RT-q PCR技术检测CHS、DFR及查尔酮异构酶基因(CHI)在双色鸳鸯美人蕉同一朵花不同颜色部位、不同发育时期的表达差异以及在不同花色美人蕉中的表达特性。结果显示:通过扩增分别获得了549 bp的CHS基因片段及570 bp的DFR基因片段,与红掌、百合等相应基因的同源性达70%~95%。基因表达分析表明,CHS及DFR在红色花瓣中的表达量高于黄色花瓣,CHI在黄色花瓣中的表达量高于红色花瓣;CHS与CHI在红色花瓣中随着发育表达量逐渐增大,在黄色花瓣随发育表达量呈先增加后减少的趋势;DFR在红色及黄色花瓣的发育后期表达量逐渐增大;在不同花色美人蕉花瓣中,这三个基因的表达模式各不相同。     

棉花GhMADS7基因正调控棉花花瓣发育

MADS-box基因家族作为一类重要的转录因子,主要参与植物花器官的生长发育。GhMADS7/98具有保守的MADS-box及K结构域,属于AG亚家族MIKC~C型MADS-box基因。通过同源序列比对发现,GhMADS7/98与拟南芥AtAG (AT4G18960)基因的蛋白序列具有64%的同源性。组织表达分析表明, GhMADS7基因在花瓣、花药、柱头和胚珠等花器官组织中均有表达。为进一步研究该基因的功能,构建了该基因的RNAi干涉载体并转化棉花,获得了表达量明显下调的转基因株系。表型观察发现,在干涉植株长度为5~6 mm和7~8 mm的花蕾中出现花瓣发育延缓的表型;通过对干涉系转基因植株花瓣进行石蜡切片观察发现,相较于野生型植株,干涉系植株花瓣中的维管束存在明显的收缩现象;通过qRT-PCR检测发现,转基因株系中控制花瓣发育的A、B类基因的表达量出现异常。因此推测GhMADS7在棉花花瓣发育过程中起着重要的作用。     

北美鹅掌楸CCD1基因的克隆与表达分析

本研究以北美鹅掌楸为试验材料,从北美鹅掌楸和鹅掌楸转录组数据库中挖掘出37条CCD基因家族的EST序列,并将这些序列归类于CCD基因家族中。以其中一条预测为CCD1的EST序列为基准设计引物,通过反转录PCR(RT-PCR)与c DNA末端快速扩增(RACE)技术从北美鹅掌楸中克隆得到一条全长为1 929 bp的序列,命名为LtCCD1基因。该基因包含102 bp 5'端、177 bp 3'端非翻译区序列和1 650 bp的开放阅读框,共编码549aa。LtCCD1基因与多个物种CCD1基因相似度大于80%,其编码的蛋白质拥有CCD基因家族典型的结构域RPE65。系统发育分析发现,LtCCD1基因编码的蛋白质与Anthurium amnicola、Crocus ancyrensis和番红花的CCD1基因编码的蛋白质亲缘关系较近。LtCCD1蛋白质分子量为61.96 kD,等电点为6.10,属酸性蛋白;无规则卷曲是该蛋白质二级结构的主要成分。利用在线软件Target P进行亚细胞定位预测并结合CCD1蛋白在其它植物中的定位信息,推测该蛋白可能位于细胞质内。使用实时荧光定量PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析,发现LtCCD1基因在北美鹅掌楸的花瓣、花萼、雄蕊、雌蕊、花芽、叶、叶芽、茎8个组织中均有表达,表达量从大到小的顺序依次为:叶、花萼、花瓣、茎、雌蕊、叶芽、花芽、雄蕊。该研究结果可为进一步分析北美鹅掌楸中CCD1基因的功能奠定基础。     

芒果FLC同源基因的克隆和表达分析

开花抑制基因FLC (FLOWERING LOCUS C)是春化作用中的关键基因,为探索MADS-box转录因子在芒果花器官发育中的作用,本研究利用RT-PCR克隆得到芒果MADS-box转录因子MiFLC的cDNA全长,序列分析显示该基因具有MADS_MEF2_like和K-box结构域,属于MADS-box基因家族,MiFLC基因编码区长576 bp,编码191个氨基酸,蛋白质相对分子质量22.08 kD,等电点为9.18。MiFLC的生物信息学分析表明该蛋白序列的二级结构主要由α螺旋、无规则转曲及延伸链构成,属于亲水性氨基酸。序列分析和系统进化树分析显示,MiFLC基因编码的蛋白与橙子、枳、龙眼、克莱门柚的蛋白序列同源性高,亲缘关系较近。组织特异性表达分析表明,MiFLC基因在芒果不同品种和每个品种的不同组织部位均有表达,在‘桂七’、‘金煌’、‘凯特’3个品种的表达量呈现出一致性,在营养器官中表达量最高,在花器官中表达量较低,表达量顺序依次是叶茎果花。     

菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择

实时荧光定量PCR具有灵敏度、特异性和重复性好等优点,是植物中常用于基因表达和转录分析的重要手段。在分子生物学的研究中,选择表达相对稳定的内参基因是分析实时荧光定量实验数据的前提。本研究以菊芋(Helianthus tuberosus)开花时期的幼根、嫩茎、叶片、块茎和花瓣为材料,运用荧光定量PCR方法分析了18S rRNA、EF1α、Actin、β-actin、GAPDH、25S rRNA和UBQ5 7个内参基因的表达量,通过Ge Norm、Norm Finder和Best Kkeeper软件的综合分析,发现25S r RNA的稳定性最好,可用于菊芋基因表达的内参基因。而GAPDH在不同样品中稳定性最差,不适合作为内参基因。本研究为菊芋实时荧光定量PCR中内参基因的选择提供了参考。     

金鱼草丙二烯环化酶基因AmAOC的克隆及表达分析

作为植物信号分子的茉莉酸(JA)参与植物的发育与代谢过程,丙二烯环化酶(AOC)是JA合成途径的关键酶。在本研究中,利用同源克隆结合RACE技术从金鱼草中克隆AOC基因,命名为Am AOC。Am AOC基因开放阅读框长762 bp,由254个氨基酸残基组成,该基因包含一个Alleneoxcyc结构域,有两个内含子和三个外显子。同源比对分析结果表明Am AOC与其他植物的AOC有较高的同源性。Am AOC基因在不同组织中的表达分析发现金鱼草花中的Am AOC相对表达量较高,不同花期金鱼草RT-PCR表明,花蕾期的Am AOC相对表达量最高,盛花期的不同花器官荧光定量PCR分析表明,金鱼草花筒和花萼中Am AOC相对表达量较高。     

萝卜开花基因RsFLC3的克隆与表达分析

植物开花春化途径中关键抑制因子FLC基因属于MADS-box基因家族,为探索萝卜开花抑制基因FLC3的功能,以抽薹开花差异较大的萝卜品种YZH(易抽薹)和XHT(耐抽薹)为研究材料,对萝卜开花基因进行生物信息学分析,克隆了萝卜RsFLC3基因,并进行亚细胞定位和两个萝卜品种不同时期的qRT-PCR分析。结果表明,共鉴定出萝卜开花相关基因638个,亚细胞定位显示该基因编码的蛋白定位于细胞核,RsFLC3基因在萝卜抽薹开花过程中表达量整体呈下降趋势,但不同品种间大部分时期的表达量差异较大。     

一个苹果β-微管蛋白基因及其启动子序列特征分析

为了探讨来自苹果的β-微管蛋白基因家族成员之一(转录本号:MDP0000749824.1)对茎生长的影响,以普通型苹果品种烟富3号和柱型苹果品种舞姿的茎尖为材料,克隆到了该基因的编码序列,该序列全长1 332 bp,编码443个氨基酸。DNAMAN比对结果表明,烟富3号和舞姿上该基因的编码序列完全一致。以舞姿及烟富3号的DNA为模板,用启动子特异性引物PCR扩增后,均获得一段1 661 bp的核苷酸序列,二者有6处碱基差异。启动子序列分析发现,其中具有赤霉素、脱落酸、茉莉酸甲酯和水杨酸等激素响应元件。构建Cam35S-MDP0000749824-GFP重组载体,在烟草叶片中完成瞬时表达,激光共聚焦显微镜观察结果表明,MDP0000749824.1编码蛋白位于细胞膜和微管上。以普通型苹果品种烟富3号和柱型苹果品种舞姿的茎尖组织为试材,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明,该基因在柱型苹果舞姿茎尖中的转录水平显著低于普通型的烟富3号。因此,推测该基因的表达水平可能受激素调控的作用,进而对茎的伸长生长造成影响。     

蝴蝶兰SOC1基因的克隆及表达分析

为了研究蝴蝶兰SOC1基因的功能,为蝴蝶兰分子育种等方面的研究提供一定的理论依据。本研究以蝴蝶兰"聚宝"盛花期的花瓣为材料提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆蝴蝶兰SOC1基因的编码区序列,片段长度为682 bp,共编码219个氨基酸,该基因命名为SOC1,登录号为:KT852838。对蝴蝶兰SOC1基因进行同源分析及构建系统发育树,分析结果显示,与SOC1核苷酸序列同源性最高的是小兰屿蝴蝶兰(Phalaenopsis equestris),达到93.72%,SOC1基因与兰科植物小兰屿蝴蝶兰及石斛的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,SOC1基因在的不同时期不同部位都有表达,但表达丰度不一致。在根中,营养生长期表达量最高;在叶中,抽葶期表达水平最高;在花葶中,抽葶期、开花期和子房发育期的表达水平相当;在花器官中,以蕊柱的表达量最高,其次是子房,而花萼、唇瓣、侧瓣中只有微量表达。研究认为SOC1基因在蝴蝶兰生长发育中既调控营养生长,又调控生殖生长;在花器官中主要参与蕊柱和子房的发育。     

苹果轮纹病抗性候选基因的表达分析

轮纹病菌侵染苹果植株,使树体减弱,严重影响苹果产量和品质。研究苹果轮纹病抗性候选基因的表达分析,以期为揭示苹果轮纹病的抗病机制提供参考。本研究以河北农业大学苹果课题组筛选出的抗病株系‘1-1-46’和感病株系‘1-1-40’为试材,对枝条接种轮纹病菌(B.berengeriana f.sp.piricola)和空白培养基,观察0~40 d内枝皮中的轮纹病抗性候选基因的表达量。结果表明:接种轮纹病菌后感病株系‘1-1-40’可以观察到明显的病变现象,皮孔凸起呈瘤状,抗病株系‘1-1-46’无明显的变化。对枝皮进行抗病候选基因Mdcf3、MdMBP2(苹果甘露糖结合蛋白)和MdACBP2(苹果酰基辅酶A结合蛋白)的表达分析,结果表明,接种轮纹病菌后,Mdcf3基因的相对表达量感病株系‘1-1-40’低于抗病株系‘1-1-46’,MdACBP2基因和MdMBP2基因相对表达量抗病株系‘1-1-46’低于感病株系‘1-1-40’。由此认为,对一些试材测定基因的相对表达量可以作为植株抗、感性鉴定的参考评价指标。