基于ESTs序列的杨树木质部形成相关EST-SSRs标记的开发与应用

ESTs数据库的发展为分子标记的开发提供了宝贵的资源。本研究从NCBI下载与杨树木质部形成相关的5359条ESTs序列,在其中257条序列中检测到279个SSRs位点,检出率为5.2%。全部SSRs共分为84种重复单元,平均长度18.2bp,变幅为15～36bp,平均分布频率1/6.94kb。所有类型中三核苷酸重复单元占总SSRs的41.3%,处于主导地位。AAG占三核苷酸重复单元的比例为27.0%,是三核苷酸重复单元中的优势重复类型。利用primer3在线设计引物,通过生物信息学方法筛选出7对引物,其中6对扩增效果较好。利用筛选出的引物对19个杨树无性系进行扩增,每对引物产生多态性条带数目为3～6条,平均4.16条。引物多态信息量变化范围为0.2267～0.9845,平均0.5485。应用NTSYS软件在相似系数为0.68水平可将19个杨树无性系准确聚类。研究结果表明,利用ESTs序列进行SSRs的开发是一种切实有效的方法,为EST-SSRs在杨树遗传图谱构建以及遗传多样性等方面的应用奠定了基础。     

鹅掌楸EST-SSR引物开发及通用性分析

通过对6520条鹅掌楸EST序列进行检索,在364条ESTs中发现394个SSRs,鹅掌楸EST-SSRs平均密度为每8.5kb含有1个SSR;在检索出的SSRs中,二核苷酸重复单元的SSRs类型最多,占总数的61.9%。利用SSR-ESTs序列共设计176对EST-SSR引物,其中132对在鹅掌楸上有扩增产物,66对扩增出多态,多态性引物占所设计引物的36.9%。这批EST-SSR引物在物种之间具有较高的通用性。研究表明在鹅掌楸中表现多态的66对EST-SSR引物,85%在中国马褂木中有扩增,54%在白玉兰中有扩增。     

辣椒EST-SSR标记的开发

对4000条辣椒EST序列进行筛选,获得了119条含有SSR的EST,共设计出35对EST—SSR引物,占所有EST序列的0．87％。在所有的SSR—ESTs中,二核苷酸重复含量最高,其次是三核苷酸重复。GA和AGA分别是二,三核苷酸重复中含量最高的重复基元。以不育系（cytoplasmic male sterility,CMS）,保持系基因组DNA为模板,对EST—SSR引物进行筛选,首次获得Pe21、Pe26和Pe27等3对特异引物,并扩增出特异片段分别为CMSPe2160、CMSPe260、CMS Pe27300. EST—SSR标记作为功能基因的一部分,可以直接揭示或反映相关基因功能,特异标记基因的一部分序列,它的应用将对进一步研究辣椒胞质雄性不育分子机理带来一定的促进作用。     

甘薯近缘野生种三浅裂野牵牛EST资源的SSR信息分析

利用生物信息学方法对NCBI公共数据库的1 458条三浅裂野牵牛ESTs序列进行EST-SSRs信息特征分析。结果显示,剔除低质量的和冗余的序列后,得到总长度为334.368 kb无冗余序列868条。这些无冗余序列中有35个微卫星简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR),分布于35条EST中,出现频率为4.03%,平均分布距离为9.55 kb。在2～6核苷酸的重复类型中,二、三核苷酸SSR之和占总EST-SSR的68.57%,其中三核苷酸SSR占总SSR数量的45.71%。在所有重复单元中,所占比例最高的是AT/AT(14.29%),其次是TCT/AGA为11.43%,TAA/TTA为8.57%列第3位。在所有的SSR中,EST-SSRs重复次数5次的有13个,占全部SSR的37.14%,其次是重复次数为4次和7次,各有5个,占全部SSR的14.29%。结果说明,甘薯近缘野生种三浅裂野牵牛的EST-SSR出现频率较高、类型丰富、具有一定的研究利用价值。     

桃(Prunus persica [L.] Batsch)转录组SSR信息分析及其分子标记开发

利用MISA软件筛选桃(Prunus persica[L.]Batsch)转录组数据,获得的109 248条Unigene,检测出24 102个SSR位点,分布于22 689条Unigene中,出现频率为20.76%。SSRs位点中主导类型是以AG/CT(占总SSRs的18.70%)为主的二核苷酸重复,占总SSRs的33%;其次是三核苷酸重复,出现频率为27%;四核苷酸重复,占总SSRs的25%。利用Primer 5共设计出9 657对SSR引物。随机选择50对引物进行PCR扩增,其中20对扩增出清晰可重复的条带,并且在同属材料(苹果试材)中也能获得理想结果,引物多态性检测发现,在15份桃试材中,10对引物具有多态性,利用UPGMA作图,可将15个桃材料很好区分。结果表明,桃转录组测序产生的Unigene是开发SSR标记的有效信息,为SSR标记在桃的遗传分析上提供可靠的标记选择。     

濒危珍稀植物半枫荷转录组中SSR位点分析

分析半枫荷转录组中的SSR位点信息,并设计简单重复序列(SSR)引物,以期为半枫荷EST-SSR分子标记提供有力工具。利用MISA工具筛选了半枫荷转录组测序获得的77629条Unigenes,对其SSR位点信息进行了分析;在此基础上利用Primer 3.0设计SSR引物,并随机选择50对SSR引物对4株不同来源的半枫荷进行多态性扩增分析。在半枫荷的转录组中,共找到15041个SSRs,分布于10669条Unigenes,SSR位点发生频率为13.74%,含多个位点的序列数为3114,占SSRs位点总数的29.19%,以复合形式出现的位点数2044个,占SSRs位点总数的19.16%,SSRs的平均距离是3.2 kb。SSRs位点中二碱基重复是主要类型,占总SSRs的42.17%;其次是单碱基重复基序(38.25%)SSRs。所包含的重复基元中,单碱基重复基元A/T(5572),二碱基重复基元AG/CT(4845)是优势重复基元类型,分别占总SSRs的37.05%、32.21%。利用Primer 3共设计出28590对SSR引物。随机选择50对引物进行PCR扩增,其中44对(88.0%)扩增出清晰、可重复的条带,15对(34.1%)扩增条带表现出多态性。半枫荷转录组SSR位点出现频率高,类型丰富;大量的SSR为其遗传多样性分析、分子标记辅助育种和遗传图谱构建提供了丰富的候选分子标记。     

枳壳EST-SSR标记的开发

GenBank上已公布的枳壳EST序列为开发新的SSR标记提供了宝贵的数据资源。本研究利用在线SSR鉴定软件SSRIT分析来自枳壳EST数据库的11029条Unigene序列。分析结果共发现327条EST序列含有348个SSR位点,占总数的2.96%。其中,三核苷酸重复的SSR类型最多,共有161个,占检索总数的46.26%。Primer 3.0设计合成58对EST-SSR引物,其中36对能扩增出产物,6对引物产生多态性分离,分别占所设计引物总数的62.07%和10.34%。本文研究成果为今后枳壳遗传多样性分析、遗传图谱构建及比较基因组等研究方面奠定了基础。     

棉花非冗余性EST-SSR新标记的开发及其评价

利用Clustal X等软件对公共数据库现有的393 753条棉花EST序列分析,得到349 815条非冗余EST序列,借助自主开发的SSRmine软件共发掘SSR位点11 372个,分布于10 507条EST中,EST-SSR的频率是3%,平均相隔21 kb出现一个SSR。在2~6 bp的重复基元中,三核苷酸和六核苷酸分别占34.1%、40.6%,二、三、四、五和六核苷酸基序分别以AG/CT、AAG/CTT、AAAT/ATTT、AAAAG/CTTTT和AAAAAG/CTTTTT的类型最多。利用去冗余的且在亚洲棉、陆地棉、海岛棉中没有被开发过的410条EST序列设计开发了200对非冗余性SSR引物,利用自主开发的SSRD软件通过SSR引物序列下载、预处理、Blastn、提取相似性分值≥81%的引物编号、提取引物冗余对、冗余引物写成一行等6个步骤去除来源于自身部分同源序列以及与CMD释放的不同棉种相似性SSR引物,得到了非相似性引物,定名为CRIXXX (CRI即Cotton Research Institute)。并分别选用棉花12个种的代表性材料对其中100对进行引物功效评价,包括多态信息含量(polymorphism information content, PIC)及引物通用性研究。结果显示,从自主开发的100对SSR引物筛选出56对均能在12份材料间扩增出稳定明显的条带, 其中多态性引物35对,多态率占35%。引物的PIC变幅为0.097~0.888,平均为0.482;1对海岛棉EST-SSR引物在12份材料间的通用性为100%,25对亚洲棉引物通用性为81%,74对陆地棉引物通用性为80.1%。     

小麦2B染色体新SSR标记开发

为开发用于小麦育种的新SSR分子标记,利用普通小麦中国春2B染色体25 Mb的DNA序列进行了SSR筛选,在检测到的2 852个SSR中80.40%是二核苷酸重复。二、三、四、五核苷酸重复序列分别有6,30,17,1种类型。二核苷酸中GA/CT、AG/TC、AT/TA数量最多,分别占SSR总数的20.44%,19.00%,17.15%;三核苷酸中CTT/GAA的数量最多,占SSR总数的2.56%;四、五核苷酸重复出现的频率都较低。进一步分析SSR的重复次数,发现二核苷酸重复次数总体较高,重复次数≥10的SSR数量有327个,占所有二核苷酸序列的14.26%,其中,AG/TC、AT/TA的重复次数≥10的SSR数量分别有98,97个。三核苷酸的重复次数总体偏低,重复次数≥8的SSR数量仅有62个,占所有三核苷酸序列的11.55%,其中TTC/AAG的重复次数≥8的SSR数量最多,有12个。四核苷酸中只有ACAT/TGTA、TAGA/ATCT的重复次数分别达到了16,14次,其他重复基元的重复次数主要为5～7次。根据筛选到的SSR位点共设计合成了135对SSR引物,发现有101对(74.81%)引物在小麦品系Cf5019-21和Cf5240-41扩增出清晰的DNA条带,17对引物在二者间表现出差异扩增。     

大白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)EST-SSR信息分析与引物筛选

为了研究大白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV),对大白菜及芸薹属中与抗性有关的EST序列进行了搜索和SSR筛选,并根据SSR两端的序列设计引物,以1对大白菜TuMV抗、感材料的基因组DNA为模板,对上述引物进行了筛选。结果表明,在132条大白菜EST和895条芸薹属抗性EST序列中,共筛选出166个符合条件的SSR(16.2%)。其中包含6种核苷酸重复基元,占主导地位的分别是二核苷酸重复(33.7%)和三核苷酸重复(50.0%),其余重复类型所占比例较小。根据上述SSR两翼的序列,共设计引物196对。引物筛选结果表明,能够进行成功扩增的有156对,占79.6%,其中35对引物在2份材料中具有多态性。因此,利用芸薹属中抗性有关的EST序列设计SSR引物,可用于大白菜TuMV抗性有关基因的标记。     

马铃薯基因组编码区域SSR位点的分布、特征和所编码蛋白功能分析

在不同物种中,微卫星(simple sequence repeats,SSR)序列的数目、类型及其分布情况有很大差异。本研究利用Perl语言开发用于探寻编码区SSR位点的程序,并用SSRHunter软件验证,来分析马铃薯基因组编码区中SSR位点的分布情况。结果显示:在马铃薯的56 218条编码区序列中,检索到2 920条共含有3 512个SSR位点的序列,其中2 519条序列只含有一个SSR位点(占86%);含三核苷酸、六核苷酸重复单元的SSR数目最多,分别为2 358和1 075个,两者占总数的98%,其他类型的重复单元出现次数较少;构成微卫星序列的不同重复单元有603个;六个核苷酸的重复单元重复次数一般最少为三个,三核苷酸GAA重复单元重复次数最高,为193次。在自然选择规律下,编码区中SSR序列长度趋向于密码子的整数倍。运用Pfam数据库对含有SSR的编码序列进行功能分类,其中最多的是RPW8抗性蛋白功能。可利用SSR序列的特异性,筛选马铃薯不同物种的相关编码序列。     

基于RNA-seq牡丹SSR标记开发及通用性分析

从牡丹花色候选基因中开发一套SSR标记,为牡丹花色分子遗传学研究和分子标记辅助育种提供帮助。本研究基于高通量转录组测序技术(RNA-seq)获得了278条涉及调控牡丹花色形成的Unigenes序列,利用SSRIT在128条Unigenes中检测到215个SSR位点,出现频率为46.04%。其中优势重复基序为二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复,分别占总SSR位点的18.60%、41.86%和36.28%,优势重复基元为TC/GA和AT/TA,分别占二核苷酸重复的30.00%和27.50%。在此基础上,从中选择100对SSR引物合成,以牡丹品种基因组DNA为模板,验证其有效性和多态性。结果表明,有效引物50对(占50%),多态性引物12对(占24%)。12对多态性引物在芍药属12个不同种质内进行通用性检测,转移率范围为83.33%~100%,平均转移率为96.53%,表明牡丹SSR标记在芍药属内具有较高的通用性。利用高通量RNA-seq开发牡丹候选基因SSR标记可为牡丹功能基因挖掘、品种分子身份证构建、遗传多样性分析和分子标记辅助选择育种等提供重要的遗传资源。     

辣椒花药转录组SSR位点信息分析及标记开发

为开发高效实用的EST-SSR标记,对辣椒(Capsicum annuum L.)花药样品的转录组进行测序,去冗余后得到44 832条转录本序列。对所有转录本进行SSR分析,共检测出7 189个SSR位点,分布于5 721条转录本上。SSR位点出现频率为16.04%,平均每7.90 kb检出1个SSR位点。分析SSR位点特征发现,97.80%的SSR重复序列长度在10～30 bp之间,单核苷酸和三核苷酸为主要重复基元类型,各占SSR总数的45.31%和35.99%;全部SSR位点共有159种重复基元,除单核苷酸重复外,AG/CT、AAG/CTT为优势重复基元,分别占SSR总数的9.72%和8.43%。随机选择29对EST-SSR引物在8个供试辣椒自交系中进行扩增发现,引物有效性为93.10%,多态率为17.24%。本研究中开发的EST-SSR标记可为辣椒的种质资源遗传多样性分析、分子标记辅助育种等提供支持。     

南瓜属EST-SSR标记的开发及在杂种纯度鉴定中的应用

为利用SSR标记进行快速、准确的南瓜杂交种纯度分析,进行了南瓜EST-SSR标记的开发.从NCBI数据库下载1 457条南瓜属作物EST序列,去除冗余序列后进行SSR位点搜索,共得到215条含有SSR位点的EST序列.这些SSR位点包含111种重复基元,其中二核苷酸(62个,占28.84％)和三核苷酸(86个,占40....     

基于花椒转录组序列SSR分子标记开发及花椒种质鉴定

为拓展分子标记在花椒种质资源分析中的应用、开发花椒EST-SSR功能性分子标记、分析花椒DNA指纹图谱,利用凤县大红袍花椒的茎尖节点转录组c DNA数据库中45 057条长度大于200 bp的非冗余Unigene序列,使用MIcro SAtellite(MISA)软件搜索SSR位点,分析花椒c DNA序列中SSR位点的频率和密度、SSR重复基元种类及比例、SSR重复次数与数量等分布特征;用Primer 3.0软件在线设计SSR引物并经PCR扩增筛选适合的多态性引物;用Quantity One软件统计多态性条带和分子量大小;NTsys 2.0软件分析12份花椒种质的遗传距离、构建树状聚类图及DNA指纹图谱库。结果表明,45 057条序列中有3 315条Unigene序列包含SSR位点,共3 814个,3 315条序列中SSR位点出现频率为7.07%;在检索出的SSR位点中,二核苷酸、三核苷酸是主要重复类型,分别占29.42%和58.58%,二核苷酸重复中以AG/TC、CT/GA出现频率最高,三核苷酸重复中GAA/CTT、AGA/TCT出现频率最高;二、三、四、五、六核苷酸重复基元总数随着重复次数的增加呈明显下降趋势。利用Primer 3.0设计的64对EST-SSR引物中,55对引物能产生预期片段大小的PCR产物,其中18对引物具有多态性;利用18对引物对12份花椒种质进行PCR扩增,共产生81条扩增条带,其中多态性条带73条,多态率为90.12%;各花椒种质的遗传相似系数为0.552 6~0.894 7,平均为0.725 0;经UPGMA聚类分析在相似系数0.70处12份花椒种质共分为3类,即顶坛花椒为Ⅰ类、竹叶椒为Ⅱ类、其他花椒为Ⅲ类;指纹图谱分析中,8对引物在5份种质中能扩增出特征带型,最少用3对引物进行组合即可将12份花椒种质区分开。成功在凤县大红袍花椒的茎尖节点转录组c DNA序列中开发SSR标记,设计并筛选出8对能扩增出特征带型的引物,最少用3对引物进行组合即可将12份花椒种质区分开,这为今后花椒遗传多样性分析、遗传图谱构建等方面提供新的引物序列并奠定了基础。     

花生栽培种EST-SSRs分布特征及应用研究

利用自行开发的20 160条花生栽培种荚果EST, 通过序列拼接, 获得8 289条无冗余EST。经搜索, 共检测出740个SSR位点, 分布于651条EST中, 发生频率为7.8%, 平均每6.8 kb EST序列含一个SSR位点。功能注释结果表明具生物过程、分子功能和细胞组分的EST分别为73、111和56条。在花生荚果EST-SSR中, 三核苷酸重复类型出现频率最高, 占总SSR的62.8%, 其次是二核苷酸重复类型, 占总SSR的33.6%。在出现的26类重复基序中, AG/TC重复基序出现频率最高, AAG/TTC次之。利用Primer premier 5从651条含有SSR的EST中共设计引物233对, 从中随机选取100对引物检测EST-SSR在花生栽培种中的多态性及在野生种中的可转移性。结果表明, 有86对引物在供试的22个花生栽培品种中得到有效扩增, 其中10对在栽培种中具有多态性, 每对引物检测出的等位基因数2~3个, 平均2.2个。可扩增引物在野生种中的可转移率为12.5%~100%,平均96%。在野生种间检测出多态性的引物76对,每对引物检测出等位基因2~9个, 平均4.06个。     

NCBI和cDNA文库中栽培花生EST-SSR分子标记的开发及其特点

本研究利用NCBI的GenBank数据库中公布的花生86 132条EST序列以及利用高油酸品种E12所创建的cDNA文库中的12 501条EST序列,对这些序列进行前期处理,总共获得非冗余且拼接较长的singleton 11 260条,contig 9 972条.通过MISA软件分析发现两个EST库中共包含有3 104个SSR位点,占到总共非冗余序列的11.08%.这些SSR位点被分成二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复、六核苷酸重复以及混合核苷酸重复等,其中三核苷酸重复占的比例最多,分别占到NCBI和cDNA文库的43.0%和56.8%,二核苷酸和五核苷酸重复占到所有重复位点的第二位和第三位,六核苷酸重复的比例最少.在所有重复基序中,AG/TC重复的数量最多,分别占到NCBI和cDNA文库的8.65%和13.42%.在三核苷酸重复中,CTT/GAA出现的频率最大,分别占到6.7%和13.42%.所有这些SSR基序的长度在4～51个之间.     

谷子基因组SSR信息分析和标记开发

对从Phytozome数据库中获取的谷子基因组序列进行搜索,在21150.78kb序列中发现2872个SSR,平均每7.36kb就有一个SSR;共发现126种重复基元,其中二核苷酸和三核苷酸类型分别占63.41%和31.86%。初步设计了74对SSR引物,其中64对引物可以稳定扩增。利用40对引物对27份谷子品种进行多态性检验,27对引物扩增良好且多态性丰富,共扩增出220个等位变异,平均每个位点8.15个。     

马铃薯SSR引物的开发、特征分析及在彩色马铃薯材料中的扩增研究

彩色马铃薯较普通栽培马铃薯具有更丰富的营养物质,特别是富含抗氧化物质花青素,是近年来育种家研究的焦点。迄今为止开发的马铃薯SSR引物数量有限,特别是彩薯相关的SSR引物。本研究基于马铃薯全基因组序列利用MISA软件对SSR位点进行了分析。研究发现,在马铃薯全基因组序列中共获得218,997个SSR位点,平均3.39 kb出现一个SSR位点。单核苷酸是主要重复类型,占总SSR的62.05%,其次是二核苷酸和三核苷酸,所占比例为22.39%和13.11%。6种核苷酸类型的重复次数分布在5～746次,以5～10次为主,占总SSR的60.9%。在检测到的全部SSR中,共获得215种基元类型,除六核苷酸重复类型外,其他5种核苷酸重复类型的优势基元均以含有A/T-的基序为主。SSR基序长度主要分布在12～20bp之间,占全部SSR的43.19%。通过Primer5共设计出100对SSR引物,利用彩薯双亲的DNA初步筛选出48对可以扩增出条带的引物,有效扩增率达48%。进一步验证引物的有效性,随机选择F2群体的6个单株进行PCR扩增,筛选出条带清晰稳定,多态性较高的引物26对,平均多态性比率为72....     

苦荞种皮转录组SSR位点信息分析及其分子标记的开发

为开发苦荞新的SSR标记,本研究利用MISA软件对苦荞种皮转录组测序数据进行SSR位点信息搜索,利用Primer 3设计引物并随机选择53对引物进行验证。结果表明:苦荞种皮转录组数据库中共搜索到9 094个SSR位点,其中,单核苷酸、三核苷酸和二核苷酸重复类型占优势,占总SSR的63.99%、19.35%、15.49%;共发现70种重复基元,其中A/T、AT/AT、AAG/CTT基元是优势基元。设计合成的53对引物中,41对引物(77.36%)获得有效扩增,21对引物具有多态性。本研究从转录组序列中大规模开发的SSR分子标记将有助于苦荞遗传多样性与分子育种研究。