TILLING技术在水稻耐盐基因SKC1突变体筛选中的应用

TILLING技术是一种高效检测SNP的反向遗传学方法。根据已克隆的水稻耐盐主效基因SKC1设计特异引物,以化学诱变剂EMS(甲基磺酸乙酯)处理获得的1310份M2代水稻为材料,利用TILLING技术检测突变位点。经过2011~2012年2年M2、M3代的连续检测及测序分析,获得SKC1基因纯合突变体5份,杂合突变体14份,研究结果表明利用TILLING技术进行水稻耐盐突变体筛选是非常有效的。     

水稻耐盐基因SKC1等位变异突变体耐盐性评价

SKC1基因是已经克隆的水稻耐盐主效基因,位于水稻1号染色体。为了在水稻育种中高效利用SKC1耐盐基因,前期研究利用TILLING技术检测宁夏水稻主栽品种宁粳28号EMS诱变群体,得到了SKC1基因的SNP突变体。本研究通过芽期、苗期、孕穗期、全生育期耐盐性鉴定,对16份农艺性状优良的水稻耐盐基因SKC1等位变异突变体的耐盐性进行了全面评价,结果表明:耐盐性强的突变材料有:18NY-10、18NY-12、18NY-14,耐盐性较强的突变材料有:18NY-2、18NY-4、18NY-5、18NY-6、18NY-7、18NY-8、18NY-13、18NY-16。结果可为宁夏水稻耐盐育种提供种质资源。     

稻瘟病抗性基因Pi25特异性CAPS标记的开发与验证

为在水稻育种中快速与高效利用稻瘟病抗性基因Pi25, 本文利用该基因不同等位基因编码区序列差异开发了4套CAPS标记(CAP1/Hinc II、CAP3/Bgl II、CAP3/Nde I和CAP3/Hpy 99I), 并利用169份稻种资源、98个重组自交系(RIL)以及217个水稻转基因后代, 对4套标记的准确性和选择效果进行了验证。结果表明, 4套标记均能准确地检测Pi25/pi25座位。其中, 标记CAP1/Hinc II和CAP3/Hpy 99I特异性识别并酶切显性等位基因, 而标记CAP3/Bgl II和CAP3/Nde I特异性识别并酶切隐性等位基因。利用稻瘟病菌株JS001-20接种RIL与转基因材料, 抗性表现与标记检测的结果完全一致, 表明该CAPS标记准确可靠。分析稻种资源后发现, Pi25基因频率较低(1.2%), 说明该基因在我国水稻稻瘟病抗性育种中还没有被充分利用。本文的研究结果特别是开发的2对识别并酶切显性等位基因的CAPS标记可用于分子标记辅助选择, 改良我国早籼稻的稻瘟病抗性。     

水稻耐盐性基因SKC1的KASP标记的开发与利用

籼稻品种‘Nona Bokra’中携带的SKC1^NB等位基因水稻耐盐性的主效QTL (Quantitative trait locus)位点。为了提高对水稻SKC1基因型鉴定效率,根据SKC1^NB基因中的功能性SNP位点开发了一个KASP分子标记SKC1^NB-KASP,利用该标记对‘Nona Bokra’与粳稻品种‘繁14’、‘花B’和‘武1B’的回交BC₃F₂群体进行SKC1等位基因的分型,发现在BC₃F₂群体受测的65个单株的DNA样品中,有16份样品的基因型与供体亲本‘Nona Bokra’相同,31份样品显示杂合基因型,18份样品与轮回亲本基因型相同。对这65份DNA样品的,SKC1基因进行测序以检验KASP标记基因分型结果的准确性,发现测序结果与KASP标记分型的结果完全一致。以上结果说明SKC1^NB-KASP标记可以高效、准确地鉴定,SKC1位点的基因型,大大提高了耐盐性水稻分子标记辅助选择育种的效率...     

CAPS标记开发及其在D8基因功能标记开发中的应用

本研究以我国160份来源于温带、热带与亚热带玉米自交系为材料,根据已经公布的D8基因序列及已鉴定的677功能位点,开发CAPS标记。结果发现限制性内切酶Bss SⅠ可用于该位点酶切分型,15个样品的分型结果与测序结果完全一致;利用开发的CAPS标记,对160份玉米自交系D8基因677位点进行基因分型,结果表明在160份自交系中共有151份能扩增出清晰条带,在9份自交系未扩增到条带;20份自交系D8基因677位点基因型为G型,131份自交系基因型为C型。该结果与Thornsberry等(2001)研究结果中该位点基因型的趋势一致,D8基因677位点开发的CAPS标记可用限制性内切酶快速检测,在玉米分子育种中有潜在的利用价值。     

番茄黄化卷叶病毒病抗病基因Ty-1的CAPS标记建立

本研究旨在筛选获得与番茄黄化卷叶病毒抗病基因Ty-1紧密连锁的分子标记,为番茄抗病育种提供技术支撑。根据与抗病基因Ty-1紧密连锁的RFLP标记序列设计特异引物,以抗病杂合体（Ty-1/ty-1）、抗病纯合体（Ty-1/Ty-1）和感病纯合体（ty-1/ty-1）材料提取的DNA为模板,进行PCR扩增,而后经不同的核酸内切酶酶切处理,筛选获得与Ty-1基因紧密连锁的CAPS标记。结果显示从4个标记中筛选获得了2个稳定可靠的CAPS标记,即TG97和Mi23。TG97标记在抗病杂合体产生398 bp、303 bp和95 bp 3个特异片段,抗病纯合体产生303 bp和95 bp 2个特异片段,感病纯合体产生398 bp一个特异片段。Mi23标记在抗病杂合体产生402 bp和354 bp 2个特异片段,抗病纯合体产生402 bp一个特异片段,感病纯合体产生354 bp一个特异片段。研究结果表明TG97和Mi23这2个CAPS标记均为共显性标记,可用于番茄抗病育种的辅助选择中。     

一种水稻高氮利用率NRT1.1B基因功能标记的开发与应用

水稻NRT1.1B是一个高氮利用率基因,在育种中有着重要的应用价值。为提高NRT1.1B基因的选择效率,根据野生型NRT1.1B与突变型nrt1.1b基因存在的单核苷酸差异,结合四引物扩增受阻突变体系PCR的技术原理开发基因功能标记。使用8份含NRT1.1B基因的常规籼稻、8份含nrt1.1b基因的常规粳稻及4份含NRT1.1B/nrt1.1b基因的F1材料对功能标记进行检测验证,结果表明,所开发的基因功能标记可准确区分NRT1.1B基因的纯合显性、纯合隐性和杂合基因型,其扩增带型与基因型完全吻合,是一种鉴定NRT1.1B基因的有效方法。该方法操作简便,且费用低廉,可广泛应用于水稻NRT1.1B基因的资源鉴定和分子标记辅助选择育种。利用NRT1.1B功能标记,对本课题组的籼粳杂交育种材料进行鉴定,筛选出了一批含高氮利用率NRT1.1B的材料,为进一步的育种利用奠定了基础。     

水稻氮高效、耐冷基因OsGRF4功能标记的开发及其利用

通过分子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection,MAS)培育氮高效水稻品种是减少氮肥使用量、发展绿色农业和可持续农业的一个重要途经。水稻OsGRF4基因编码生长调节因子蛋白,编码区第487和488碱基由TC变异为AA,导致丝氨酸突变为赖氨酸,使得水稻具有氮高效利用、高产和耐冷的特性。为了提高OsGRF4基因在育种中的选择效率,本研究根据功能SNP(single nucleotide polymorphism)位点设计和筛选出等位基因特异PCR(polymerase chain reaction)功能标记PF+DMR+PR和PF+XMR+PR。利用此功能标记对不同品种(品系)和川大粒/巨穗稻的F2群体进行基因型检测,结合测序分析验证,能准确快速鉴定OsGRF4的纯合显性、纯合隐性和杂合基因型,且具有操作简单、成本低的特点。本研究开发的功能标记为通过MAS方法利用OsGRF4基因培育氮高效、高产和耐冷水稻新品种提供了技术支撑。     

甜瓜单性花相关基因CmACS-7的分子标记开发与应用

甜瓜(Cucumismelo L.)性型中主要是雄花、两性花同株型(雄全同株,简称两性花),雌雄异花同株型(单性花)比较少见。甜瓜育种工作中为提高制种效率,往往将母本系转育成单性花。传统方法筛选单性花植株耗时长,占地面积大。根据CmACS-7基因序列设计引物进行PCR扩增,甜瓜9份材料均可获得188 bp的片段。多序列比对发现,材料单性花性状与扩增片段的碱基变异相关联,关联位点为限制性内切酶AluⅠ的识别位点。扩增产物进行酶切,甜瓜单性花材料CmACS-7基因的PCR扩增产物均可以被酶切成两条带(160 bp和28 bp),两性花材料CmACS-7基因的PCR扩增产物不能被酶切(188 bp),因此建立CmACS-7基因的CAPS分子标记。利用此标记对58份甜瓜材料进行验证,甜瓜单性花性状与分子标记结果显著相关。基于甜瓜单性花决定基因CmACS-7的CAPS分子标记可用于单性花的选育。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除OsEIL1和OsEIL2基因改良水稻耐盐性

为了培育耐盐水稻品种,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在水稻品种东农427的耐盐负调控基因OsEIL1和OsEIL2设计1个敲除靶点对其进行同时敲除。通过PCR和测序的方法,在T_0共检测出了5个突变单株,其中有1株为双基因同时突变的植株。在该植株的T_1株系中,获得了4株双基因纯合突变且不含T-DNA元件插入的植株。在T_2进行苗期耐盐性鉴定,成熟期考察农艺性状指标。结果表明,在苗期200 mmol/L NaCl溶液处理5 d后,突变体植株的鲜质量和干质量显著高于野生型植株,地上部及地下部钠离子含量均显著低于野生型植株,钾离子含量与野生型植株无明显差异。恢复7 d后,突变体植株幼苗存活率(75.0%)显著高于野生型植株(8.3%)。在成熟期,突变体的主要农艺性状未发生明显变化。综上,利用CRISPR/Cas9技术对水稻品种东农427进行了耐盐改良,为耐盐水稻品种的培育提供了理论和材料基础。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻pi21基因编辑材料的创制及稻瘟病抗性鉴定

利用CRISPR-Cas9技术,对水稻稻瘟病感病品种日本晴pi21基因进行定点突变,获得了抗稻瘟病的pi21隐性突变株系。基因编辑载体T0转化植株的检测结果表明,86.7%的T0植株的pi21基因靶序列发生了碱基缺失。通过T-DNA序列的PCR检测,剔除携带T-DNA的T1植株,从23个T1株系筛选获得107个不含T-DNA转基因序列的植株。然后对pi21的编辑位点进行酶切和测序分析,获得了21株pi21纯合突变体。对1个pi21突变株系进行稻瘟病菌孢子喷雾接种,与未转化日本晴相比,突变株系显著抗病。对接种水稻样品的6个病程相关基因进行q RT-PCR分析,与感病日本晴比较,pi21突变株系在接种稻瘟病菌后,病程相关基因诱导表达的速度更快,表达量更高。本研究利用基因编辑技术,实现了对感稻瘟病水稻的定点突变并提高了其稻瘟病抗性水平,为利用该技术培育持久抗稻瘟病水稻品种奠定了研究基础。     

一个新的水稻叶绿素缺失黄叶突变体遗传分析及其基因定位

粳稻品种"嘉花1号"经60Coγ射线辐照后,在其后代中筛选到一个黄叶的突变体(yl6),经过表型分析,发现该突变体幼苗期不论在低温(20℃)还是在高温(32℃)培养条件下,与野生型相比叶色均呈现出淡黄色,表明其为一温度不敏感突变体。光合色素含量测定结果显示,yl6突变体的黄叶突变性状主要是由叶绿素含量下降所导致。电镜结果显示,yl6突变体内叶绿素合成受阻且叶绿体的正常发育受到影响。遗传分析表明,该突变性状受一对隐性核基因(yl6)所控制。利用该突变体与籼稻"培矮64S"杂交产生的F2、F3群体中分离出的608个突变体型单株作为定位群体,结合SSR和CAPS分子标记将yl6基因定位在水稻第6染色体短臂上的CAPS1和RM2353分子标记之间,其物理距离约为271kb,目前该区域内没有发现与水稻叶绿素合成/叶绿体发育相关已知功能基因。本研究结果可为yl6基因的克隆和功能分析奠定了基础。     

大白菜抗根肿病基因位点CRa和CRb的分子标记鉴定

利用大白菜抗根肿病基因CRa和CRb分子标记(SC2930和KBr H129J18R)引物组,对78份大白菜材料进行抗根肿病分子标记鉴定。结果表明,在这78份材料中,有34份材料含有SC2930-T(CRa抗病标记)标记,其中杂合抗病位点材料17份,纯合抗病位点材料17份。有37份材料含有KBr H129J18R抗病标记,其中纯合抗病位点材料15份,杂合抗病位点材料22份。有20份材料不含有CRa和CRb所对应的抗病标记,23份材料含有2个抗病标记。该研究初步明确了78份参试大白菜材料所含抗根肿病基因CRa和CRb类型,为大白菜抗根肿病育种提供材料选择依据。     

甘蓝型油菜抗根肿病KASP标记开发和利用

为了准确高效的筛选抗根肿病材料,提高甘蓝型油菜根肿病抗性育种效率。通过对甘蓝型油菜抗病亲本的Crr1基因与感病亲本中相应的同源基因LOC103834349进行测序,寻找SNP位点,针对第1 486-1 487上的非同义突变位点,开发了一套精准检测抗感根肿病基因型的竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)标记。利用该KASP标记对来自42个F_2群体的771个单株进行分型检测,其中315个单株含有纯合感病基因型GG,322个单株含有纯合抗病基因型AA,134个单株含有杂合等位基因型GA。其中对编号为2033的F_2群体中125株材料的KASP分型情况进行χ~2检测,其中纯合抗病基因型AA 30株,纯合感病基因型GG 33株,杂合基因型GA 62株,经χ~2检测,抗病材料与感病材料符合3∶1理论值,抗病纯合基因型、抗病杂合基因型与感病纯合基因型的比值符合1∶2∶1理论值,说明该抗病位点为显性单基因抗病位点。结合田间表型检测鉴定,AA分型和杂合的GA分型单株田间检测均为抗病表型,GG分型均为感病表型,KASP分型结果与田间鉴定结果一致。比对结果说明该KASP标记对根肿病抗、感植株进行正确分型,表明基于Crr1基因和LOC103834349的SNP位点开发的KASP标记可以准确高效的应用于油菜抗根肿病材料的分子标记辅助选择育种。     

两个低谷蛋白基因插入缺失标记的设计与验证

低谷蛋白稻米是肾脏病人极有效的食疗辅助品,培育低谷蛋白功能性水稻品种具有重大意义。低谷蛋白基因Lgc1作为培育低谷蛋白功能性水稻品种的优质资源,受到了育种家的青睐。为提高低谷蛋白基因Lgc1分子标记辅助选择的准确性,我们根据其突变体在两个谷蛋白基因GluB4和GluB5间的碱基缺失,设计出了Lgc1基因的插入缺失标记InDel-Lgc1-A和InDel-Lgc1-B。利用InDel标记对W3660(Lgc1低谷蛋白品种)/南粳46(谷蛋白正常品种)的F2分离群体和13份水稻品种进行检测验证。依据其PCR扩增产物的电泳带型,可准确地区分出低谷蛋白纯合基因、谷蛋白正常纯合基因和杂合基因型3种带型,且3种带型与其植株或品种相应的蛋白性状表现完全一致,表明这两对InDel标记可用于Lgc1低谷蛋白基因资源的鉴定以及分子辅助育种。     

水稻矮秆突变体sde(t)的遗传分析与基因初步定位

矮生突变体的引入掀起了第一次“绿色革命”。但近年来,在水稻育种中矮生基因遗传单一的问题越来越突出,已经严重影响了水稻产量的持续提高。从籼稻品种中籼3037中发现一个矮秆自然突变体,该矮秆突变体和中花11杂交F2的遗传分析表明该材料的矮秆性状由1对隐性单基因控制,并暂命名为sde（t）。利用已有的INDEL分子标记将sde（t）基因定位在水稻1号染色体的长臂上,然后通过扩大群体和新发展的INDEL与CAPS标记,将sde（t）基因定位在2个INDEL标记之间,两者间的物理距离大约是400kb。     

水稻稻瘟病抗性基因Pi2-InDel标记的开发与评价

通过对水稻抗稻瘟病基因Pi2/9位点上已克隆的功能基因及非功能位点序列的相互对比,鉴定到Pi2特异的核苷酸差异,开发了基于PCR技术的Pi2基因的插入/缺失(insert-deletion,InDel)标记,能有效地将Pi2与其它抗性等位基因及感病等位基因区分开。利用Pi2基因的分离群体进行标记选择与接种鉴定,结果表明Pi2-InDel标记能精确地选择Pi2基因。用Pi2-InDel标记对20份水稻品种和育种亲本进行分子检测,该标记能准确地将抗性基因分离开来。这为筛选水稻稻瘟病抗性种质资源,以及抗性标记辅助抗病育种提供了便利。     

水稻广亲和基因S5-n的功能标记开发及其应用

广亲和基因S5-n是能够恢复籼、粳杂种育性的基因,利用常规育种方法回交转育广亲和基因需要通过配组杂种F₁,根据F₁的育性判断和选择S5-n,选育周期长,方法繁琐。因此,在广亲和遗传改良和聚合育种中需要寻找一种快速、简便的广亲和基因检测方法。本研究根据水稻广亲和基因和籼粳S-5等位基因序列存在136 bp缺失的特征,设计了InDel标记S5136。前人研究已经明确02428、Dualr、CPSLO17具有S5-n,分子标记S5136 PCR扩增这3个材料的带型为缺失带型,而不携带广亲和基因S5-n的材料的带型为非缺失带型。利用该标记对3037与02428的F₂群体分析表明,该标记能准确区分S5-n、S5-i纯合及杂合基因型,标记基因型符合1∶2∶1比例,没有发生偏分离现象。利用该标记从554份水稻品种资源(O. sativa L.)和27份普通野生稻(O. rufipogen Griff.)以及24份江淮流域杂草稻资源中筛选出具有缺失带型的资源材料13份,并对其PCR产物测序证实为S5-n,对Kasalath的广亲和性进行了初步验证;从20份02428的高世代育种材料中,筛选到携带广亲和基因S5-n的恢复系2份。该标记可以用于S5-n基因资源筛选、分子标记辅助选择育种和培矮64S为母本的杂交种种子纯度鉴定。     

应用CRISPR/Cas9系统编辑水稻SBE3基因获得高抗性淀粉水稻新品系

SBE3是位于水稻第2号染色体上的水稻淀粉分支酶基因,该基因表达量的降低引起水稻抗性淀粉(resistant starch,RS)含量的提高。本研究应用CRISPR/Cas9系统对SBE3基因进行编辑,根据基因编码区序列(CDS)在第8外显子区域设计长度为20 bp的引导序列,化学合成引导序列并构建成sgRNA,将其插入到Cas9质粒骨架载体中,转化农杆菌。通过农杆菌介导的遗传转化方法将构建好的p CAMBIA1300:SBE3sgRNA:Cas9表达载体转入水稻受体材料沪LPR18中。使用PCR扩增转基因阳性植株中含有CRISPR/Cas9靶点的片段并测序验证,确定12个突变单株,其中2个是纯合型,通过后代分离,得到没有潮霉素基因筛选标记的SBE3纯合突变单株,测定其抗性淀粉含量高达10%以上。以上结果表明,本研究已经通过CRIPR/Cas9技术获得稳定的高抗性淀粉水稻纯合突变体材料,为高抗性淀粉育种提供了新的种质资源和创建方法。     

水稻中脉缺陷突变体dl-6的遗传分析与精细定位

为了克隆DL-6基因,以dl-6与9311配制正反杂交组合进行性状分析发现,dl-6突变性状受1对隐性核基因控制,利用SSR分子标记将控制dl-6性状的基因DL-6初步定位在水稻第3染色体的短臂上,进一步利用新发展的InDel标记将DL-6基因精细定位在I3-5和I3-8之间85 kb的物理距离内。对该区段内存在的开放阅读框( ORF)进行分析,发现其中ORF9编码的YABBY基因是一个与叶脉发育相关的基因,对突变体dl-6和野生型中YABBY基因进行测序,将测序结果与数据中日本晴序列进行比对发现,突变体dl-6中YABBY基因的第1个外显子存在1个单碱基突变,该突变导致野生型中编码的半胱氨酸突变为突变体中的精氨酸;同时突变体dl-6在YABBY基因的3′端还存在8个碱基的缺失。这2个突变位点哪个是导致dl-6突变的功能区目前还不确定,有待进一步研究。