大豆Nup98蛋白结构及功能预测分析

核膜孔蛋白在植物生长发育中起重要作用。本研究对大豆基因组中的两个Nup98同源基因(Glyma.13g33910.1和Glyma.12G36350.1)揭示了较全面的生物信息学分析、基因克隆及表达分析。为大豆生长发育调控机制研究提供方向。一系列的在线软件分析显示,大豆Nup98启动子可能参与光反应、激素信号转导及抗性调控等途径;两个蛋白均含有保守的N端FG重复结构域和C端自酶解结构域;而大豆Nup98的互作蛋白可能与内质网囊泡形成、m RNA加工、细胞骨架组装、蛋白质合成及其核质运输、信号转导等功能相关;并且其功能与核膜孔上的Nup107-160亚复合物有关。利用Clustal W软件对不同作物中的Nup98同源蛋白进行序列比对分析发现,它们相互间具有高度的序列相似性,说明Gm Nup98基因在进化上功能很保守。实时定量PCR检测Gm Nup98在大豆不同组织器官的表达量,发现两个基因在根、茎、叶、根瘤等组织器官中均有表达,但是以其中一个为主。本研究结果说明,Gm Nup98基因在大豆进化过程中分化出两个拷贝,这两个拷贝在大豆不同植株器官中发挥着相同又有各自特异的功能。因此,通过对大豆核孔蛋白Nup98基因的充分分析,为下一步对该基因功能的深入研究提供理论基础。     

腐霉菌诱导的大豆谷胱甘肽转移酶GmGST26基因的分子特征和表达分析

腐霉根腐病严重影响着大豆种子发芽和植株的生长,谷胱甘肽转移酶是植物与生物胁迫和非生物胁迫相互作用的主要酶,在失活有毒化合物,保护植物细胞免受氧化损伤等方面扮演着十分重要的角色。本研究从腐霉菌侵染的抗病大豆灰不支黑豆中分离出Gm GST26基因,采用生物信息学方法对大豆Gm GST26的序列特征、结构、大豆Gm GST家族基因的进化关系及表达数据进行分析;利用荧光定量PCR技术和DGE表达谱数据分别对Gm GST26基因在不同抗病品种中的表达特点及在抗病大豆互作过程中的表达模式进行分析。研究结果表明,腐霉菌侵染大豆后Gm GST26基因上调表达,Gm GST26编码225个氨基酸,等电点为6.92,具有明显的GSTs蛋白的典型结构域,属于GSTs家族中Tau亚家族,与Gm GST7的相似性为98.22%,属旁系同源基因。组织特异性表达分析,主要在根部表达,其次为花,该基因在腐霉菌、疫霉菌与大豆互作过程中的表达模式为应激反应上调基因,且防卫反应负调控。     

外源抗草膦EPSPs基因在大豆基因组中的整合与定位

通过基因特异引物扩增和免疫层析试纸法分别对EPSPs基因和其编码的蛋白进行检测。结果表明,EPSPs基因不仅已整合到大豆基因组中,而且EPSPs蛋白可以正常表达。利用染色体步移方法获得了转基因大豆插入位点的侧翼序列,序列比对表明35S上游的大豆DNA序列起始于Gm02:7912740,NOS下游的大豆DNA序列起始于Gm02:7777705。外源基因不是以点插入方式整合,而是导致大豆基因组约135 kb片段的移位和重排。基因组序列重排导致一个编码HEC1和HEAT repeat功能域的基因(Glyma02g09790)结构受到影响,该基因在ABA和PEG处理时下调表达。本研究发现外源基因的插入导致插入位点附近DNA序列发生重排,并鉴定出一个编码HEC1和HEAT repeat功能域的基因可能会在ABA信号通路中参与干旱胁迫应答。本研究通过对抗除草剂EPSPs基因在大豆基因组中的插入位点分析,明确了外源EPSPs基因在大豆基因组中的整合、定位及其侧翼序列,为转基因大豆安全评价提供了依据。     

外源抗草甘膦EPSPs基因在大豆基因组中的整合与定位

通过基因特异引物扩增和免疫层析试纸法分别对转基因大豆中外源EPSPs基因和其编码的蛋白进行检测,结果表明,EPSPs基因不仅已整合到大豆基因组中,而且EPSPs蛋白可以正常表达。利用染色体步移法获得了转基因大豆插入位点的侧翼序列,序列比对表明35S上游的大豆DNA序列起始于Gm02:7912740,NOS下游的大豆DNA序列起始于Gm02:7777705。在本研究检测序列范围内发现插入位点两侧不同位置有3个不同的未知片段、2个大豆基因组序列倒位,同时发现2个大豆基因组片段丢失。外源基因不是以点插入方式整合,而是导致大豆基因组约135kb片段的移位;NOS下游大豆基因组序列发生重排,导致一个编码HEC1和HEATrepeat两个功能域的基因(Glyma02g09790)结构受到影响,首次发现该基因在ABA和PEG处理时下调表达,推测该基因通过ABA信号通路参与胁迫应答。本研究通过对抗除草剂EPSPs基因在大豆基因组中的插入位点分析,明确了外源EPSPs基因在大豆基因组中的整合、定位及其侧翼序列,为转基因大豆安全评价提供了依据。     

大豆中2个编码 PR10蛋白新基因的克隆与分析

从抗大豆花叶病毒病（ SMV）大豆材料科丰1号中克隆到2个编码PR10蛋白的新基因Glyma09g05430和Glyma15g15509，Glyma09g04530和Glyma15g15590基因的ORF全长均为477 bp，编码158个氨基酸。序列比对与系统发生树分析结果表明：Glyma09g04530和Glyma15g15590是大豆中2个编码PR10蛋白的新基因。 Glyma09g04530和Glyma15g15590基因在大豆的根、茎及叶中均有表达；接种大豆SMV后，Glyma09g04530和Glyma15g15590基因在大豆科丰1号的叶片中的表达均被强烈诱导并高效表达，显示Glyma09g04530和Glyma15g15590基因与大豆SMV抗性密切相关。     

大豆盐胁迫相关GmNAC基因的鉴定、表达及变异分析

NAC基因在植物的逆境胁迫中发挥着重要作用。本研究参照水稻和拟南芥的逆境相关NAC基因, 采用生物信息学方法鉴定了大豆逆境相关GmNAC基因, 利用荧光定量PCR技术分析了GmNAC基因在耐盐差异的大豆品种根部、叶片的表达及其对NaCl胁迫的应答, 采用反转录PCR技术克隆了表达差异显著的GmNAC基因。结果表明, 大豆GmNAC基因家族包含175个基因, 其中11个GmNAC蛋白与水稻和拟南芥的逆境相关NAC蛋白位于同一进化分支, 这些蛋白具有高度保守的NAC结构域; 这11个GmNAC基因在大豆根部的表达均高于在叶片, 而且在叶片和根部均受NaCl诱导, 部分基因在根部和叶片以及品种间表现出不同的表达规律; 在大豆品种齐黄34、徐豆10和汾豆95中, Glyma06g11970.1存在3个同义突变和1个非同义突变, Glyma06g16440.2存在1个同义突变。     

菜用大豆蔗糖转运蛋白基因Glyma18g15950的克隆及生物信息学分析

为了从分子水平上揭示菜用大豆蔗糖转运蛋白的结构特点,研究从菜用大豆‘闽豆6号’中同源克隆了蔗糖转运蛋白基因Glyma18g15950。经测序发现:该基因CDS长度为1794 bp,编码一个含有597个氨基酸的多肽。生物信息学分析表明,Glyma18g15950蛋白的等电点(pI)为5.81,分子量(Mw)为64.30 kD;为疏水性蛋白。SOMPA分析表明,各个氨基酸残基对应的二级结构分别为α螺旋42.47%、β折叠13.71%、无规则卷曲39.63%和β转角4.18%;氨基酸序列和结构分析显示Glyma18g15950蛋白包含MFS_2结构域。SignalP分析表明该蛋白没有信号肽。系统进化树分析表明菜用大豆Glyma18g15950蛋白与野生大豆(Glycine soja)的亲缘关系最近,同源性达97.34%。将该蛋白与拟南芥的9个SUC蛋白比对表明Glyma18g15950与AtSUC3的亲缘关系最近,属于SUT2亚族。     

大豆ZF-HD转录因子GmZHD1的克隆及表达分析

为了揭示大豆ZF-HD基因的生物学功能,通过PCR的方法,从大豆栽培豆科丰1号中克隆了ZF-HD转录因子Glyma.02g040100,命名为GmZHD1。生物信息学分析表明,该基因的c DNA全长为888 bp,编码295个氨基酸,GmZHD1蛋白分子量约为32.64 k Da,等电点为7.69;序列分析表明,GmZHD1含有ZF-HD家族保守的锌指结构域和同源异形盒结构域,GmZHD1与Ft HB2蛋白序列一致性最高,为44.4%;亚细胞定位结果显示GmZHD1定位于细胞核;荧光定量PCR结果表明,GmZHD1在大豆不同组织中都有表达,其中,花、种子和叶片中表达较高。此外,将GmZHD1基因连接到植物过表达载体p BA002上,为进一步研究大豆GmZHD1基因的功能奠定了基础。     

大豆PHD家族蛋白的全基因组鉴定及表达特征分析

PHD（Plant Homeodomain Finger）基因家族编码一类锌指转录因子,广泛参与植物的生长发育和逆境应答过程。通过全基因组鉴定获得了95个大豆PHD家族蛋白。通过共线性分析、进化树构建、基因结构和功能结构域鉴定、GO注释分析、不同组织间和非生物胁迫下表达分析等,获得了大豆PHD家族基因复制、家族进化、保守结构域及基因表达等信息。结果表明,大豆PHD基因在家族进化、基因结构和保守结构域上存在较大变异,可能参与Zn ²⁺结合、DNA结合及表观遗传调控等分子过程,参与调控植物生长发育和逆境应答。这些结果为进一步研究大豆PHD家族在生长发育和逆境应答中的生物学功能提供重要线索。     

大豆GmGLDH基因的克隆、表达及生物信息学分析

为了探究大豆L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因Gm GLDH-Glyma.02G166300 (以下简称GmGLDH)的功能,本研究采用同源克隆法获得大豆GmGLDH基因,开展了相关生物信息学分析,并对其非生物胁迫下表达模式进行调查。结果表明,GmGLDH基因包含一个长度为1 752 bp的ORF序列,编码584个氨基酸。GmGLDH蛋白为亲水性较强的蛋白;二级结构中以无规则卷曲和α螺旋结构为主;预测亚细胞定位GmGLDH主要分布在线粒体中,分析结果并未发现跨膜结构域和信号肽结构;该蛋白序列中存在磷酸化位点56个。进化分析表明,克隆的GmGLDH氨基酸序列与菜豆、苜蓿的同源关系较近。基因上游顺式调控元件分析表明该基因可能参与光应答、激素响应、高温响应等,但光处理下大豆子叶中Gm GLDH基因的表达变化不大,且和子叶中抗坏血酸含量无相关性;4种非生物胁迫处理下大豆叶片中Gm GLDH基因是先下调后上调表达,和抗坏血酸含量变化呈反相关。本研究为进一步研究GmGLDH基因在大豆抗逆中的作用提供了重要的帮助。     

大豆TRK-HKT家族基因结构及逆境胁迫响应机制

植物TRK-HKT家族基因广泛介导植物Na+/K+运输,参与植物耐逆境胁迫调控。本研究以6个大豆钾利用效率差异品种为材料,利用in silico技术克隆到4个大豆TRK-HKT家族成员(Gm HKT1;1、Gm HKT1;2、Gm HKT1;3和Gm HKT1;4),采用q RT-PCR技术解析这些基因在低钾及逆境胁迫下的表达机制。结果表明,Gm HKT1;2在大豆幼苗根中对低钾胁迫的响应明显高于其他3个基因,且钾高效大豆品种这种响应更明显;同时Gm HKT1;2对不同逆境胁迫(低温、干旱、高盐和ABA)也有较强的响应。蛋白结构分析表明,仅Gm HKT1;2具有4个MPM结构域,4个保守的氨基酸残基空间上形成一个"漏斗样"结构,充当K+/Na+转运通道,通过邻近的ATP结合结构域,为K+/Na+转运提供能量。基因结构分析显示,这些基因均含3个外显子和2个内含子,不同基因间的第一个外显子和内含子片段大小差异显著,导致各基因的基因组DNA(g DNA)大小各异。启动子分析揭示,大豆TRK-HKT家族成员包含参与种子功能定位和各种激素及逆境胁迫应激反应的重要顺式作用元件;进化上该家族基因位于第一进化分支,含保守的Ser–Gly–Gly–Gly基序。     

非生物胁迫诱导的GmMYB的克隆与表达分析

本研究室根据一段抗逆的EST序列, 从栽培大豆东农42中克隆到4个开放阅读框均是外显子和内含子间隔构成的R2R3-MYB基因, 其中Gm02g01300、Gm03g38040和Gm10g01340与已公布的Willams 82基因组序列完全一致, Gm19g40650第375位的单核苷酸突变导致多肽链第125位的氨基酸发生置换(GAG³⁷⁵→GAC³⁷⁵, E¹²⁵→D¹²⁵)。以人工气候箱内模拟非生物胁迫(盐、碱、干旱和低温)处理栽培大豆东农42芽期, 选择适宜时间点, 采用荧光定量PCR技术, 检测R2R3-MYB基因的表达。结果表明, 4个基因的表达水平都存在明显波动, 呈诱导后短暂上调或下调两种表达模式, 但表达时间、强度和趋势存在明显差异; Gm02g01300受干旱诱导明显, Gm03g38040受多种胁迫条件诱导表达强烈, 推测这些基因在大豆非生物胁迫的调控中起到重要作用; 另外, 在子叶与胚间, 单个基因的表达也存在差异; 多种非生物胁迫条件下, 基因的表达不仅存在时空差异, 可能也具有调控模式的差异。     

谷子Ⅲ型PRX基因家族全基因组鉴定及干旱胁迫下表达分析

Ⅲ型过氧化物酶(Class Ⅲ peroxidase, PRX)是植物中特有的过氧化物酶家族,在植物生长发育以及非生物胁迫中发挥重要作用。谷子作为C4植物是禾本科抗逆研究的模式植物,然而目前对于谷子中Ⅲ型过氧化物酶家族基因功能鲜有报道。为探究谷子Ⅲ型过氧化物酶基因家族(SitPRXs)在干旱胁迫和ABA诱导下的表达模式,进行了全基因组表达分析。本研究利用生物信息学方法在谷子全基因组中鉴定出132个Ⅲ型PRX基因家族成员,并根据其在染色体上位置顺序依次命名为SitPRX1～SitPRX132。通过对谷子、拟南芥和水稻的系统进化分析将其分为5个亚家族,基因结构和保守基序分析表明同一亚家族具有较高的保守性。基因复制分析显示, 17个SitPRX基因(13%)存在片段复制,78个SitPRX基因(59%)存在串联复制,串联复制事件在SitPRX基因扩增中起重要作用。谷子与拟南芥、水稻和玉米的物种间同源性分析显示谷子中大多数SitPRXs是在双子叶植物和单子叶植物分化后形成的。转录组分析显示, SitPRX基因家族成员在谷子幼苗、根、茎、叶以及圆锥花序中表达存在差异。启动子顺式作用元件分析显示,...     

大豆蛋白含量主效位点qPRO-20-1的精细定位

蛋白质含量是大豆重要的品质性状,受多基因控制,定位大豆蛋白质含量相关位点并挖掘候选基因,对定向培育高蛋白含量大豆品种具有重要意义。本研究以优良品种黑农88作为母本与高蛋白优异种质P73-6B作为父本杂交,构建了一个由265个单株组成的F₂群体,利用中豆芯1号对F₂群体进行基因型鉴定并构建图谱,结合蛋白质含量表型数据,采用IciMapping 4.2软件在20号染色体上定位了一个QTL,物理距离为2.46 Mb,在区间附近筛选出11个多态性SSR标记并分析群体,将定位区间从2.46 Mb缩小至100.8 kb。增加Gm20＿28349696、Gm20＿30805913、Gm20＿31341532和Gm20＿31483719共4个SNP位点,进一步将区间缩小到95.8kb。对区间内包含的4个基因的9个不同组织在Phytozomev13.1和PPRDRNA-seq2个数据库中的表达量分析得到了2个候选基因,分别为Glyma.20g081800和Glyma.20g082000基因,本试验结果为大豆蛋白质含量基因克隆及蛋白质调控机制研究提供了理论基础,...     

大豆GmNramp3a基因克隆及表达分析

本研究利用RT-PCR技术从大豆中克隆了一个Nramp基因家族成员GmNramp3a,并对其基因序列和蛋白结构、亚细胞定位以及表达模式进行了详细分析。生物信息学分析结果表明,GmNramp3a基因开放阅读框(open reading frame, ORF)长度为1 557 bp,由4个外显子组成;Gm Nramp3a蛋白包含11个跨膜结构域(trans-membrane domain, TMD);进化树分析的结果显示Gm Nramp3a蛋白和模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtNramp2的同源性较高。通过拟南芥原生质体瞬时表达亚细胞定位分析表明,Gm Nramp3a蛋白主要定位于液泡膜。采用实时荧光定量PCR对GmNramp3a在大豆不同组织部位的表达量进行分析,结果表明GmNramp3a在茎、根、花和叶几个部位都能表达,尤其在茎和花中的表达量较高。本研究结果可为将来深入分析Gm Nramp3a的生物学功能提供理论基础。     

大豆GmGRF5基因的组织表达模式与生物信息学分析

Growth Regulating Factor (GRF)家族基因是一类植物特有的转录因子,广泛参与植物多个重要的发育过程。为了研究大豆中的GRF转录因子的功能,本研究从大豆‘天隆1号’品种中克隆获得全长为1 038 bp的cDNA序列,由于该序列的编码蛋白与拟南芥GRF5具有高度的相似性,因此将其命名为GmGRF5基因。通过RT-PCR进行组织部位表达分析,发现GmGRF5基因在大豆各个组织部位均有表达,且在花中的表达量最高。通过ExPASy-Protparam分析发现,该蛋白质的分子量为39.463 48 kD,是具有一定亲水性、不稳定的碱性蛋白。该蛋白含有GRF家族蛋白的两个保守功能域(QLQ和WRC)。利用SOPMA对该蛋白的二级结构预测,显示其主要由无规则卷曲(72.05%)、α-螺旋(13.83%)、延伸链区(9.8%)和β-转角(4.32%)组成。此外,还利用不同的生物信息学软件对其三级结构、跨膜域、亚细胞定位、互作蛋白进行了分析,并构建系统进化树。结果表明,Gm GRF5基因在进化过程中具有高度的保守性,在大豆中具有潜在的功能多样性。     

大豆Gm TIP1;1基因的克隆与表达分析

利用RT-PCR方法从大豆根部组织获得Glyma03g34310.1开放阅读框(ORF)全长, 经测序验证、Blast比对与同源性分析发现该序列编码的蛋白质与其他植物的TIP1;1蛋白具有较高的相似性, 故命名为GmTIP1;1基因(GenBank登录号为AK285481), 该基因ORF长753 bp, 编码1个包含250个氨基酸的蛋白, 在ORF内部第381个核苷酸处含有1个94 bp的内含子, 符合↓GT--AG↓的剪接方式; 系统进化树分析发现Gm TIP1;1聚类到豆科植物分支, 其他不同科的植物也有规律地聚到了不同分支, 推测该蛋白氨基酸序列可以作为植物分类的依据; 半定量RT-PCR结果表明该基因在大豆的不同器官、不同器官的不同发育阶段均具较高且同等的表达水平, 暗示该基因在植物的整个发育进程中均具重要作用; 在盐胁迫的不同时间点其表达量有下降的趋势, 但仍然保持较高的表达水平; 以pYES2为酵母表达载体, 转化酿酒酵母INVSc1菌株, 获得重组酵母INVSc1 (pYES2-GmTIP1;1), 转化菌株在盐胁迫下的存活率明显高于对照INVSc1 (pYES2), 而在干旱胁迫下则没有显著差异, 表明该基因的表达能有效地提高酵母的耐盐性。     

麻疯树PIN基因家族的鉴定与生物信息学分析

PIN基因家族是一类调控植物生长素极性运输的重要载体元件。本研究利用功能已知的拟南芥PIN蛋白家族为参考序列,在麻疯树全基因组数据中共鉴定出9条PIN基因,并针对9条JcPIN基因开展系统的生物信息学研究,开展进化树构建和基序分析以及基因表达研究和密码子偏好性解析。结果发现:9条麻疯树PIN蛋白多属于由碱性氨基酸组成的稳定蛋白,均为位于细胞质膜上的非分泌蛋白;蛋白家族含有保守的N末端结构域,二级结构与拟南芥PIN蛋白相似;进化结果表明麻疯树PIN基因与毛果杨PIN基因家族关系最近;表达分析发现了4个可信度较高的麻疯树PIN基因,密码子偏好性分析确定了13个高频密码子,揭示了异源表达JcPIN时需要改造的密码子。研究结果可为将来开展麻疯树PIN基因家族的功能研究奠定重要基础,也为麻疯树其他基因家族和其他拥有大量数据的植物基因家族研究提供参考。     

烟草过氧化物酶基因NtPOD1的克隆及表达模式分析

为烟草过氧化物酶基因的功能及结构研究奠定理论基础,采用同源克隆的方法,从烤烟品种K326中克隆出了过氧化物酶基因Nt POD1的c DNA全长,并进行了生物信息学分析;同时,运用q RT-PCR的方法,分析了该基因的组织器官及逆境胁迫表达模式。结果显示,该基因c DNA全长981 bp,编码326个氨基酸残基,预测分子量为37.19 ku,等电点为8.89。生物信息学分析表明,该蛋白是一个亲水性蛋白,结构域中含有4个保守的二硫键和2个保守的钙结合位点,可能定位在细胞外(包括细胞壁),属于植物血红素依赖性过氧化物酶超家族的Ⅲ类分泌氧化酶,与渐窄叶烟草POD42、美花烟草POD42、马铃薯POD42等具有很高的同源性。该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中叶中表达量最高,花中表达量最低。同时,Nt POD1的表达受高盐、干旱、低钾、ABA和H2O2诱导。结果表明,Nt POD1基因属于烟草的过氧化物酶,并可能在烟草非生物逆境胁迫响应中发挥作用。     

大豆Glyma08g11030基因结构及原核表达分析

为了进一步明确Glyma08g11030基因的功能,利用生物信息学和PCR的方法,对Glyma08g11030进行序列分析及蛋白结构域分析。生物信息学分析表明,该基因cDNA全长1 419 bp,开放阅读框长1 362 bp,编码453个氨基酸,蛋白质分子质量约为51.288 ku,等电点为8.14。序列分析表明,Glyma08g11030基因组包含2个外显子和1个内含子。多序列比对结果表明,Glyma08g11030蛋白含有1个F-BOX保守域。进化树分析表明,该蛋白与木豆、菜豆、花生、豇豆、红小豆具有同源关系。为了获得纯化的Glyma08g11030蛋白,将扩增片段克隆至原核表达载体pET28a,构建重组质粒pET28a-Glyma08g11030,经过SDS-PAGE电泳检测获得了目的蛋白,结果表明,该蛋白主要以包涵体形式存在。为进一步纯化和鉴定Glyma08g11030蛋白及研究其功能奠定了基础。