小麦 TaGF14m基因的克隆及其盐胁迫响应分析

14-3-3蛋白家族在真核生物中广泛存在且高度保守,可结合多种靶蛋白参与植物代谢、发育以及胁迫响应等多种生理过程和信号途径。 TaGF14m基因是14-3-3基因家族成员之一。本研究以中国春为材料,对其进行了克隆和分析,并通过在拟南芥中过表达,分析该基因在盐胁迫下的功能。结果表明, TaGF14m基因含有5个外显子和4个内含子,开放阅读框为789 bp,编码262个氨基酸;小麦幼苗叶片中 TaGF14m基因在盐胁迫下上调表达;与野生型拟南芥相比,过表达 TaGF14m的转基因拟南芥在盐胁迫下生长受到明显抑制,根长也显著变短;SOS途径相关基因表达分析显示, TaGF14m基因可能通过SOS途径负调控盐胁迫耐受性。     

玉米ZmSAMS1基因在盐、干旱等逆境胁迫下的表达分析

采用Northern杂交对玉米S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因ZmSAMS1在玉米幼苗期根、茎、叶中的表达及盐胁迫下外施不同甲基供体试剂处理下的表达进行分析。结果表明,ZmSAMS1在根、茎中均有表达,叶中信号较弱;盐胁迫外施甜菜碱、氯化胆碱、叶酸条件下该基因表达量不同,推测ZmSAMS1可能参与盐胁迫下玉米根茎木质化和栓质化过程。荧光实时定量PCR分析表明,ZmSAMS1在干旱和高温胁迫下表达量上调幅度较大,在盐、低温和ABA胁迫下表达量上调或下调幅度较小,揭示ZmSAMS1可能参与干旱、高温等逆境胁迫应答。     

小麦TaNIP4-1基因的克隆及生物信息学分析

水通道蛋白不仅控制着水分和一些小分子溶质的跨膜运输,也是植物体应对非生物胁迫的重要组成部分。为了进一步研究小麦水通道蛋白的功能,本研究以NCBI和Ensemble Plant数据库中查找出的已报道的小麦水通道蛋白基因序列为模板,针对其保守区设计了19对引物,应用PCR的方法从5个小麦品种中克隆出19个基因片段。通过比对鉴定到一个此前未曾报道的新基因,并对其进行生物信息学分析,将其命名为TaNIP4-1。理化特性分析表明,该基因位于3A染色体短臂,基因全长1 315bp,CDS序列长度864bp,含有3个外显子和2个内含子,编码含有288个氨基酸的多肽,含有保守的沙漏模型,有6个跨膜区和2个保守的NPA基序。亚细胞定位预测结果表明该基因位于质膜上。该基因启动子序列含有与逆境响应相关的顺式调控元件,而对7日龄的麦苗进行干旱和盐胁迫处理后,其qRT-PCR结果显示,干旱和盐处理5h后,TaNIP4-1基因在小麦叶片中的表达量明显上调;盐处理7d后,TaNIP4-1基因在小麦根部的表达量显著上调。由此可见,TaNIP4-1基因参与了小麦应对逆境的过程。     

小麦 TaCP3基因的克隆及其参与非生物胁迫的表达分析

半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease,CP)是植物中重要的蛋白酶家族之一,广泛参与植物的各种生理过程;TaCP3属于papain-like(木瓜蛋白酶)家族的半胱氨酸蛋白酶,在小麦的生长发育及抗逆中起到重要作用。为研究 TaCP3基因的结构特征,以及在干旱、高盐、低温和高温胁迫下的表达情况,从小麦抗旱品种西农538中克隆了 TaCP3基因,该基因仅含1个1125 bp的开放阅读框,编码374个氨基酸,在蛋白氨基端有一个28个氨基酸残基组成的信号肽,羧基端具有木瓜蛋白酶亚家族的保守结构域。生物信息学分析表明, TaCP3与大麦和山羊草半胱氨酸蛋白酶基因相似性最高。同时,本研究构建了pcold-TF/TaCP3原核表达载体,通过转化大肠杆菌BL21(DE3),成功表达了TaCP3重组蛋白,分子量约为40 kD。qRT-PCR结果表明, TaCP3的表达对干旱、高盐、低温和高温胁迫均有响应,初始都呈先降后升的趋势;且对干旱胁迫有强烈的正向响应。     

小麦G6PDH基因家族的鉴定与表达分析

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是磷酸戊糖途径中的关键限速酶,在植物生长发育及非生物胁迫响应中发挥重要作用。本研究利用生物信息学对小麦 G6PDH基因家族成员进行鉴定,并对该家族基因编码蛋白的理化性质、进化关系、亚细胞定位、基因复制事件以及在不同组织和不同胁迫下的表达模式进行分析。结果表明,在小麦基因组中共鉴定到14个 G6PDH基因家族成员,分布在小麦2A、2B、2D、4A、4B、4D、6A、6B和6D染色体上,其中5个基因编码的蛋白为胞质型,9个为质体型。亚细胞定位预测表明,胞质型G6PDH蛋白主要定位于细胞质上,而质体型G6PDH蛋白主要定位于叶绿体上。根据系统进化和保守结构域特征,可将14个小麦G6PDH蛋白分为Cy、P0、P1和P2四个亚组。共线性分析表明,小麦 G6PDH基因家族成员存在17对片段重复基因。RNA-seq分析结果表明,小麦 G6PDH基因家族成员在不同组织中存在明显的表达差异,其中 TaG6PDH1-2A/2B/2D基因在根中的表达量最高; TaG6PDH2-2A和 TaG6PDH2-2B基因在干旱胁迫后1 h以及热胁迫后6 h均上调表达。进一步利用qRT-PCR检测6个小麦 G6PDH基因在干旱和盐胁迫下的表达模式,发现分别有5个基因在小麦根中均上调表达,推测小麦 G6PDH基因在非生物胁迫响应过程中发挥着重要功能。     

小麦TaHTAS-5A基因的克隆、表达分析及亚细胞定位

非生物胁迫对小麦的生长发育具有不良影响,克隆与非生物胁迫相关的基因,并对其结构及表达特性进行分析,可以为进一步探索小麦的抗逆机制和抗逆育种奠定基础。本研究利用同源克隆技术从普通小麦品种中国春中克隆了水稻E3泛素连接酶基因OsHTAS的同源基因TaHTAS-5A(GeneBank登录号:MF967573),并利用生物信息学方法对其基因序列特征进行分析;利用qRT-PCR技术对该基因在小麦不同组织及不同逆境胁迫下的表达模式进行分析;同时,对该基因的表达产物进行了亚细胞定位。结果表明,小麦TaHTAS-5A基因含有220bp的5′UTR、1 242bp的ORF以及126bp的3′UTR,共编码413个氨基酸;基因组分析表明,该基因全长3 819bp,共包含4个外显子和3个内含子;缺体-四体定位表明该基因位于小麦5A染色体上;蛋白结构分析显示,TaHTAS-5A蛋白的N端包含四个跨膜结构域,C端包含一个E3泛素连接酶特有的RING finger保守结构域,具有植物E3泛素连接酶的结构特征;qRT-PCR结果显示,TaHTAS-5A对高温、低温和ABA都有响应,对干旱和盐响应不敏感;TaHTAS-5A在小麦的根、茎、叶和幼穗等不同组织中均有表达,但表达量有差异,在叶和穗中的表达量明显高于根部和茎部;亚细胞定位结果表明,TaHTAS-5A位于细胞膜上。本研究为进一步探究小麦TaHTAS-5A基因的功能奠定了基础,也为小麦非生物胁迫抗性改良提供了一定的理论依据。     

小麦丙氨酸-乙醛酸转氨酶基因（ TaAGT2）的克隆、生物信息学预测及表达分析

光呼吸是植物细胞H_2O_2的重要来源,也是维持细胞氧化还原的重要成分,影响植物对生物和非生物逆境的应答,因此,挖掘与光呼吸有关的基因对提高植物的抗逆性具有重要意义。本研究以耐旱小麦品种青麦6号转录组数据为基础,通过RACE技术克隆得到小麦 AGT2基因的全长cDNA,将其命名为 TaAGT2,并对其进行了生物信息学预测及表达模式分析。结果表明, TaAGT2开放阅读框长1 434bp,编码477个氨基酸。该蛋白属于亲水性稳定蛋白,定位于线粒体中,二级结构以α-螺旋(42.14%)和无规则卷曲(32.91%)为主。 TaAGT2基因包含AAT-I基因族保守区域,与二穗短柄草 AGT2的相似性高达97%。通过qRT-PCR对基因 TaAGT2在不同组织中(根、茎和叶)及4种非生物胁迫(低温、ABA、干旱、高盐)下的表达特性进行分析,结果表明, TaAGT2在根、茎和叶中均有表达,茎中的表达显著高于根和叶,在不同胁迫条件下上调表达,表明该基因可能参与调控植物的抗逆反应。     

小麦品种东农冬麦2号根中TaEXPA7部分同源基因的克隆及表达特性分析

膨胀素(expansin)是植物生长发育过程中诱导细胞壁松弛和伸展的蛋白,包括EXPA、EXPB、EXLA、EXLB四个基因家族,对植物根系的形成及快速发育具有重要作用。本试验以寒地冬小麦品种东农冬麦2号两叶一心期的根为材料,克隆了TaEXPA7基因的3个CDS全长,其氨基酸序列同源性较高,仅信号肽处有两个氨基酸不同,其核酸序列长度均为777bp,编码258个氨基酸,分别命名为TaEXPA7-A、TaEXPA7-B、TaEXPA7-D,且分别定位于2AL、2BL、2DL染色体。蛋白均含有DPBB-1和Pollen-allerg-1两个保守结构域,分子量为27 670.74Da,等电点为8.09,均为疏水性蛋白;与节节麦、二穗短柄草的相似性分别为99%和92%。采用两叶一心期的根进行qRT-PCR分析发现,TaEXPA7-A/B/D三个基因在根尖中的表达量均较高,伸长区和成熟区次之;对冬小麦根进行低温、干旱和激素处理后,这三个基因均下调表达,并且TaEXPA7-B基因的相对表达量较高,TaEXPA7-D的相对表达量较低。由此可见,多倍体小麦不同染色体上的基因在应对不同环境胁迫时,表达以及应答模式存在差异,并且在不同的环境胁迫下,发挥主导作用的染色体也存在差异;此外,该基因在根中的表达可能与低温、干旱以及外源激素的胁迫有一定的关系,可能是促进根系生长的重要基因。     

玉米泛素活化酶基因家族鉴定及表达模式分析

通过生物信息学分析,从B73玉米全基因组中鉴定出4个泛素活化酶基因,分别命名为Zm UBA1~Zm UBA4。4个Zm UBA基因编码氨基酸数目在1 030~1 056 aa,编码蛋白分子量在114.63~117.39 k D,等电点在5.18~5.80,且均含有5个内含子。蛋白二级结构预测,4个基因编码的蛋白主要以α–螺旋和不规则卷曲为主,亚细胞定位预测4个基因均定位于细胞核中。荧光定量PCR结果表明,Zm UBA1基因在根、茎、叶、雄穗和雌穗中呈现组成性表达,Zm UBA2和Zm UBA4基因在雄穗表达量最高,Zm UBA3在叶片表达量最高,呈现组织特异性表达。Zm UBA3在盐和低温胁迫上调表达,Zm UBA4在盐胁迫时下调表达,说明Zm UBA3基因可能参与玉米低温和盐胁迫的应答,Zm UBA4可能参与玉米盐胁迫应答。     

小麦冷休克蛋白基因TaCSP的克隆及表达分析

为深入研究小麦冷休克蛋白(cold shock proteins,CSPs)基因,根据大肠杆菌(E.coli)CSPs蛋白保守氨基酸序列,借助生物信息学技术检索小麦EST序列,采用同源序列法拼接了小麦3个冷休克蛋白基因,并以小麦叶片总RNA为模板,采用RT-PCR对其进行扩增;同时,采用荧光定量PCR对3个基因的组织表达特性以及ABA、低温、高温、干旱和盐胁迫条件下的表达模式进行了研究。结果表明,小麦3个冷休克蛋白基因TaCSP1、TaCSP2和TaCSP3全长分别为290、374和377bp,各编码69、69、80个氨基酸残基。序列分析表明,TaCSP1、TaCSP2和TaCSP3之间氨基酸相似性为72.9%~84.3%,与大肠杆菌来源CSPs的相似性为40.0%~79.7%。荧光定量PCR表达谱分析显示,TaCSPs在抽穗期小麦的根、茎、叶和幼穗中均能表达。胁迫分析表明,3个冷休克蛋白基因在小麦幼根中的表达,在低温和ABA处理下,表现为早期诱导、后期抑制,在高温、干旱和盐胁迫下,则表现为早期抑制、后期有所恢复。克隆获得的小麦3个冷休克蛋白基因在根组织中强烈表达,并受ABA和冷胁迫诱导,推测其在小麦抵御逆境胁迫过程中发挥重要作用。     

转小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥植株的主要抗旱性研究

核氧还蛋白（nucleoredoxin,NRX）可通过还原目标蛋白的二硫键来调控其生物活性,在植物的生长发育和抗逆境胁迫中发挥着重要作用。蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）、h型硫氧还蛋白（h-type thioredoxin,TRXh）和蛋白磷酸酶2A催化亚基（protein phosphatase 2A catalytic subunit,PP2Ac）是小麦核氧还蛋白TaNRX1的互作蛋白。为了明确TaNRX1互作蛋白的抗旱性功能,本研究在拟南芥中过表达了小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因,对野生型和转基因拟南芥的表型和抗旱相关生理指标进行了鉴定。结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的根长、存活率、脯氨酸含量均大于野生型,离体叶片失水率、丙二醛（MAD）含量均小于野生型。二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）对H₂O₂组织定位染色结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的H₂O₂含量均低于野生型。上述结果说明,TaNRX1的互作蛋白基因 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D增强了拟南芥对于干旱胁迫的抵抗能力。本研究可为小麦抗旱育种提供候选基因和理论基础。     

玉米Opaque-2基因在毕赤酵母中的表达

从玉米自交系辽2345授粉后18 d的胚乳中提取总RNA,经反转录后得到第一链cDNA,利用Opaque-2基因的特异引物克隆出该基因的全编码区,将该编码区的全序列以正确的阅读框架利用Infusion同源重组的方法亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9的α因子下游,并置于AOXⅠ启动子控制下,利用pPIC9表达载体上的特异引物进行PCR鉴定,鉴定后的重组质粒用Bgl Ⅱ酶切线性化后,电转化导入甲醇型毕赤酵母菌株GS₁15中,利用MM、MD和菌落PCR的方法筛选出Mut⁺表型,得到的重组子以甲醇诱导表达蛋白。经SDS-PAGE结果显示,Opaque-2蛋白得到表达,其相对分子质量（Mr）约为47 KD。     

玉米灌浆期3种鳞翅目害虫的空间分布

采用网格式取样200株玉米,整株剖秆调查亚洲玉米螟、桃蛀螟和棉铃虫在玉米上的数量,用地统计学的方法分析和模拟它们在田间的水平分布;采用生态位理论分析3种害虫在玉米植株上的生态位和种间竞争。结果表明,亚洲玉米螟、桃蛀螟和3种鳞翅目害虫整体在玉米田中的水平分布分别适合球形、高斯、球形模型拟合,均属于聚集分布。Kriging插值模拟图显示,亚洲玉米螟和桃蛀螟为核心分布型;在垂直分布上,雌穗上3种害虫数量最多,占总虫量的69.82%。亚洲玉米螟的基础生态位宽度最大,在整株玉米上都可危害;桃蛀螟则主要在玉米中、上部;棉铃虫基础生态位最窄,只在雌穗附近危害。3种害虫在玉米茎秆上种间竞争激烈,异种害虫无法共存;雌穗上种间竞争程度小于茎秆,异种害虫可以共存。     

荆州黑麦 NPR1同源基因 ScNPR1的克隆与特性分析

为了明确荆州黑麦ScNPR1基因的功能,对荆州黑麦 NPR1同源基因ScNPR1进行克隆并分析了其表达特性。利用同源序列法和RACE技术从荆州黑麦中克隆得到 NPR1同源基因的3 185 bp全长cDNA序列,该基因包含了一个编码507个氨基酸(1 524 bp)的开放阅读框、终止密码子TGA、5′端1 517 bp的非编码区和3′端144 bp的非编码区,命名为ScNPR1。利用生物信息学软件对其结构进行分析,ScNPR1编码的氨基酸序列与已知的小麦、水稻 NPR1基因编码的氨基酸序列具较高的同源性,分别达到92.4%和90.3%。荧光定量PCR发现,ScNPR1基因在小麦不同器官中均有表达,在叶、茎、根中表达较高;ScNPR1基因在植物抗病相关信号分子水杨酸、茉莉酸和乙烯处理后上调表达,在白粉病菌、纹枯病菌和赤霉病菌的诱导下,ScNPR1基因也上调表达。研究结果表明,ScNPR1基因与水杨酸和乙烯信号转导途径有关,参与寄主对病原菌侵染的防御反应。     

新疆杂草黑麦染色体核型分析

为了对新疆杂草黑麦的种质鉴定、起源分析、良种培育和遗传多样性研究提供依据,采用常规压片法制片结合显微摄影技术,分析了3个新疆杂草黑麦居群和1个栽培黑麦品种的核型并比较他们的异同点.结果表明,四种黑麦材料的染色体均为二倍体,染色体数目为14,不同材料之间染色体形态具有丰富的多态性.新疆杂草黑麦居群89R4的染色体核型公式为2n=2x=14=12m+ 2sm,除第7对为近中着丝粒染色体外,其余染色体均为中间着丝粒染色体,核型不对称系数为61.70％,核型类型为1A型,属于基本对称型.新疆杂草黑麦居群89R14的核型公式为2n=2x=14=8m+ 6sm(2sat),除第5、6、7对为近中着丝粒染色体外,其余染色体均为中间着丝粒染色体,其第7对染色体具有随体,核型不对称系数为60.88％,核型类型为2A型,属于基本对称型.新疆杂草黑麦居群89R60的核型公式为2n=2x=14=14m(2sat),其全部染色体均为中间着丝粒染色体,第3对染色体具有随体,核型不对称系数为60.47％,核型类型为1A型,属于基本对称型.栽培黑麦材料H36的染色体核型公式为2n=2x=14=10m+ 4sm,除第5、6对为近中着丝粒染色体外,其余染色体均为中间着丝粒染色体,核型不对称系数为61.20％,核型类型为1A型,属于基本对称型.     

引发小麦赤霉病和茎基腐病禾谷镰孢菌的生物防治初探

禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)是小麦上的重要病原真菌。通过致病性测定从江苏小麦茎基腐病病害样本分离菌中筛选到了对小麦赤霉病和茎基腐病都有强致病力的F.graminearum菌株GF1117。为了对F.graminearum进行生物防治,利用稀释涂布平板法和平板对峙法从小麦不同生境中分离筛选到35株对GF1117具有明显拮抗效果的细菌菌株,分别在田间和温室进行了小麦赤霉病和茎基腐病的生物防治试验。结果表明,35株拮抗细菌对小麦赤霉病均有一定的防治效果,且在小麦感病品种和中抗品种上对茎基腐病的防效不同;菌株1-8对两种病害的防效都在45%以上。     

华山新麦草穗发芽抗性相关基因AIP2的克隆及其序列分析

为了挖掘和利用华山新麦草(Psathyrostachys huashanica,2n=14,NsNs)的优良基因,拓宽小麦穗发芽抗性基因资源,以华山新麦草为材料,采用同源克隆的方法克隆AIP2基因,利用生物信息学软件分析其基因结构及功能。结果表明,从华山新麦草中成功克隆AIP2基因,该基因的开放阅读框为840bp,编码279个氨基酸残基,结构域预测结果显示AIP2蛋白含有完整的Ring保守域,属于锌指环家族成员。AIP2的gDNA含5个外显子,4个内含子,华山新麦草AIP2氨基酸序列与感穗发芽小麦品种中优9507的AIP2氨基酸序列的相似性为84%,与中优9507相比缺失了44个氨基酸,与抗穗发芽的乌拉尔图小麦的AIP2氨基酸序列的相似性为80%,华山新麦草和乌拉尔图小麦都有氨基酸缺失,推测这些缺失的氨基酸可能与华山新麦草穗发芽抗性强有很大关系。本研究为小麦穗发芽抗性改良提供了新的候选基因。     

Prior weakening of Macrophomina phaseolina and Fusarium propagules for enhancing efficiency of Brassica amendments

In a two year field study, the effect of varying intensities of sub-lethal heating on the efficiency of Brassica amendments in controlling viable populations of Macrophomina phaseolina and Fusarium oxysporum f sp. cumini was determined in an arid region of India. After 30 d of dry summer exposure of pathogen infested soil, incorporation of mustard residues and oil cake (0.18% and 0.04% w/w) and then applying one irrigation caused significant reduction by 75.3–81.3% in viable counts of M. phaseolina that causes dry root rot of legumes and by 93.9% in counts of F.o. f. sp. cumini causing wilt of cumin (Cuminum cyminum L.) at 0–15 and 16–30 cm depths. Increasing duration of summer exposure to 60 d improved the reductions in viable propagules of M. phaseolina by 83.6–90.4% and in F.o. f. sp. cumini by 78.2–94.8% at same soil depths. At certain heat levels, reduction in viable population of Fusarium due to amendments and irrigation was greater than that recorded in Macrophomina. Significantly low levels of reduction in pathogenic propagules of Macrophomina (63.9–71.4%) and Fusarium (48.0–57.2%) under shade compared to unshaded conditions indicated that mild heating did not cause discernible weakening effect. In second season also, 89.2–91.5% and 78.5–95.8% reduction in counts of Macrophomina and Fusarium, respectively was achieved by the application of amendments after 60 d of summer exposure at 0–30 cm soil depth. These results suggested a new approach to improve the control of soil-borne plant pathogens in hot arid regions by combining prolonged sub-lethal heating, effective naturally available on-farm wastes as soil amendments and one summer irrigation.     

分子标记辅助小麦抗白粉病基因Pm21和Pm13聚合育种

为了获得同时具有抗白粉病基因Pm21和Pm13的材料,利用与抗白粉病基因Pm21和Pm13共分离或紧密连锁的分子标记SCAR1400、CINAU161650和SCAR564、BE398268,对分别含Pm21和Pm13的小麦品系杂交F2代进行检测。结果表明,在764个F2代单株中,能同时检测到显性标记SCAR1400和SCAR564的有404株,阳性率为52.9%,经标记CINAU161650和BE398268检测,同时携带纯合Pm21和Pm13的单株有47株,阳性率为6.15%,两个显性抗病基因在F2代群体中的分离比例符合孟德尔独立分配定律。获得的聚合单株可作为小麦抗白粉病育种的亲本资源。     

乌拉尔图小麦WOX基因的克隆与表达分析

WOX基因家族是一类植物特有的转录因子基因家族,在植物的生长发育过程发挥重要作用。本研究通过同源克隆的方法,得到乌拉尔图小麦(Triticum urartu)WOX基因家族的6个成员: TuWOX1、 TuWOX2、 TuWOX3、 TuWOX4、 TuWOX5和 TuWOX3a。生物信息学分析表明, TuWOX2、 TuWOX3和 TuWOX3a属于WUS支/进化支, TuWOX4属于古老支, TuWOX5属于中间支。除这三个分支外, TuWOX1自成一支,说明在乌拉尔图小麦中可能出现了不同功能的WOX家族基因。利用qRT-PCR技术对得到的WOX基因在乌拉尔图小麦不同组织的表达模式以及幼苗在不同非生物胁迫处理下的表达情况进行了分析,结果表明,WOX基因在乌拉尔图小麦各组织中均有表达,但在不同组织中的表达量差异较大,说明WOX基因在不同的组织中发挥作用;非生物胁迫条件下WOX基因表达水平发生了变化,表明其可以响应外界的胁迫。