一种优化的辣椒尖孢炭疽菌遗传转化体系

由辣椒尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)侵染引起的炭疽病是辣椒生产中最具有破坏性的真菌病害,严重影响辣椒的品质和产量。本研究以辣椒尖孢炭疽病菌HHDL02为对象,采用1 mol·L^-1 NH₄Cl 2%的酶裂解液裂解分生孢子萌发2 h的芽管,裂解2～3 h可以高效制备原生质体,结合PEG介导转化法成功将GFP基因导入,其转化菌株菌落形态、菌丝生长速率、分生孢子形态、孢子萌发、附着胞形成、产孢量和致病性与野生型菌株无明显差异,且后代荧光信号遗传稳定。PEG介导的原生质体转化适合辣椒尖孢炭疽菌遗传操作,有助于其致病机理的研究。     

根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立

本研究基于农杆菌介导的遗传转化方法,建立了芒果胶孢炭疽菌高效的遗传转化体系,获得一批炭疽菌的T-DNA插入突变体,其目的是为炭疽菌的功能基因组学研究和致病相关基因的克隆奠定基础。结果如下:通过摸索并优化了体系的各项因子,在潮霉素筛选浓度为200μg/mL,菌液浓度为OD₆₆₀=0.15条件下,AS为200μmol/L,选择pH5.5的IM共培养基中转化效果最好;进一步通过对转化子的继代稳定性和PCR检测,结果发现潮霉素抗性稳定遗传和假阳性率低;通过菌落形态观察和产孢能力的测定获得3个菌落形态异常突变体,6个产孢能力下降突变体。     

辣椒胶孢炭疽菌生物学特性初步研究

从广西南宁市采集辣椒炭疽病果实病害标本,进行病原菌分离培养、致病性测定及形态学鉴定,选择引起辣椒炭疽病的病原菌之--胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)进行生物学特性研究,结果表明:在测试的不同温度、pH、湿度、光照和营养中,该菌的菌丝体生长和产孢的最适温度分别为25℃和30℃,菌丝体生长和产孢的最适pH值为7,光照对菌丝生长的影响不大,在光暗交替下可促进产孢;分生孢子萌发的最适温度为30℃,最适pH值为7,分生孢子在相对湿度为100%和100%+水滴中能萌发,在100%+水滴中萌发率最高,为99.5%,光照对孢子萌发影响不大;辣椒煎水和辣椒煎水+蔗糖可促进附着胞形成,附着胞在辣椒煎汁中形成率最高,达到90%.     

引起油茶炭疽病胶孢炭疽菌种群遗传结构研究

 胶孢炭疽菌是引起油茶炭疽病的主要病原之一。目前对于该病原菌种群的遗传结构尚未见报道。研究病菌种群的遗传结构对制定科学的防治方法具有重要意义。本研究比较中国6个省12个不同地区的126个胶孢炭疽菌的ITS序列的差异,以期研究各不同群体的单倍体型多样性,不同地区群体之间的遗传关系,以及遗传距离与地理距离的线性关系。遗传分析发现,得到的126个胶孢炭疽菌样品ITS序列可定义为27种单倍体型。27种单倍体型中,一个主要的单倍体型(Haplotype12)含有78个样品,且基本上每个样品采集地都有分布。遗传分化指数(Fst)表明病菌不同地理种群间的遗传分化较大。AMOVA分析显示,种群间的遗传变异占总变异的6%,种群内部变异占总变异的94%。Mantel测试显示地理距离与遗传距离没有显著的线性关系。对所有地理种群病原菌ITS序列的核苷酸不配对进行分析,发现油茶炭疽病菌未经历过大规模的种群扩张过程。系统发育分析表明,来自不同地区的油茶炭疽病菌散乱的分布在系统树中。研究结果表明油茶炭疽病菌种群具有丰富的遗传多样性。     

莲腐败病菌遗传转化体系的构建

由共享镰刀菌Fusarium commune引起的莲腐败病是我国莲生产上的主要病害之一。本研究以强致病力菌株FCN23为供试菌株,通过PEG介导的遗传转化法研究了菌龄、酶解时间和渗透压稳定剂等对原生质体制备的影响。结果表明,分生孢子在YPD液体培养基培养24 h获得新鲜菌丝,在酶解时间为2.5 h,渗透压稳定剂为0.7 mol/L NaCl溶液时原生质体制备效率最高。进而将遗传霉素的抗性基因和绿色荧光蛋白基因转入莲腐败病菌原生质体中,获得了稳定表达的转化子,能够稳定遗传gfp基因,说明莲腐败病菌的遗传转化体系构建成功。该体系的建立为莲腐败病菌的侵染过程及基因功能研究奠定了基础。     

梨黑斑病菌遗传操作体系的建立与RFP标记转化子的致病性分析

由链格孢(Alternaria alternata)引起的梨黑斑病是我国梨生产上的主要病害之一,导致梨叶与果实产生黑斑症状及早期落叶,对我国梨产业的健康发展构成严重威胁。本实验在前期获得强致病性梨黑斑病菌菌株HN-5基础上,建立该病菌的遗传转化体系。通过优化原生质体制备过程以及转化体系发现梨黑斑病菌HN-5原生质体制备的最优条件为:菌丝在M R液体培养基中培养36 h;以0.7 M NaCl+0.8 M Mannitol为稳渗剂,配置复合细胞壁裂解酶(1%崩溃酶+1%裂解酶+1%纤维素酶+1%蜗牛酶),酶解菌丝3 h,原生质体的产量可达0.5×10~7个·mL~(-1)。通过PEG介导的原生质体遗传转化体系,将含有RFP基因的质粒p KD7转入链格孢菌HN-5中,转化效率为6个·μg~(-1)DNA。PCR检测和转化子荧光观察均表明RFP基因整合到了HN-5基因组中并成功表达。致病性分析发现RFP (Red Fluorescent Protein)标记转化子致病性未发生变化。本研究成功建立了PEG (Polyethylene glycol)介导的梨黑斑病菌遗传转化体系,构建了RFP标记菌株,为研究该病菌的致病机理奠定基础。     

一株辣椒尖孢炭疽病菌拮抗菌株的分离鉴定与发酵条件优化

 为了探寻辣椒尖孢炭疽病的生防药剂,从而控制该病在辣椒生产上的扩散。以辣椒尖孢炭疽病菌（Colletotrichum acutata）为指示菌,从浏阳河风光带土样中分离筛选出6株拮抗放线菌株,其中菌株ND045对指示菌的拮抗效果最好,菌丝生长抑制率高达71.6%。经形态观察、培养性状、生理生化鉴定,并结合16S rDNA序列分析,将ND045菌株鉴定为吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）。抗菌谱研究表明,该菌株对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、黄瓜枯萎病菌（Fusarium omysporum）和辣椒白绢病菌（Sclerotium rolfsii）都具有较强的拮抗作用,抑菌率达40.58%～72.00%。通过单因子变量法和均匀设计法对菌株ND045进行发酵条件研究,结果表明,其最佳的发酵条件为：15 g大米粉、5 g大豆粉、0.5 g MgSO₄、0.01 g FeSO₄·7H₂O、1.5 g NaCl、水1 000 mL、30℃、pH 8。经优化后,菌丝生长抑制率最高达到82.61%,比优化前提高了11.01%。该研究结果为辣椒尖孢炭疽病的生物防治提供科学依据。     

农杆菌介导的西瓜枯萎病菌遗传转化

为获得带GFP标记的西瓜枯萎病菌转化株,用于后期观察病原菌侵染过程,采用农杆菌介导的方法,对西瓜枯萎病菌1号生理小种进行了遗传转化。结果表明:共培养时间为36h,枯萎病菌孢子和农杆菌AGL1比例为1∶1时该菌株的遗传转化效率最高,可以达到117.33个转化子/107个孢子。转化株的孢子、菌丝体及萌发的孢子均能发出稳定而强的绿色荧光。转化株的致病力检测显示其致病力与转化前的野生菌株致病力无明显差异。结果表明本研究获得的带GFP标记的西瓜枯萎病菌转化株可用于观察病菌在西瓜根系的侵染过程。     

几种杀菌剂对胶孢炭疽菌的室内毒力测定

由胶孢炭疽菌侵染引起的辣椒炭疽病在辣椒栽培中普遍发生,成为辣椒生产中的主要病害之一。为了更加有效地防治该病害,找出高效防治该病害的杀菌剂,采用生长速率法,测定了3神杀菌剂对胶孢炭疽菌的毒力。结果表明,参试的3种杀菌剂中,70％甲托效果最佳,其EC50值为228．559μg／mL,其余两种药剂的抑制效果不很明显。     

甘蓝枯萎病菌REMI转化体系的建立

建立高效、稳定的甘蓝枯萎病菌REMI转化体系,为进一步获得特定表型突变体及基因功能研究建立技术储备.利用REMI(restriction enzyme mediate intergration)转化方法,将线性化的含有潮霉素抗性基因的pUCAT-PH质粒转化甘蓝枯萎病菌A6菌株的原生质体,摸索获得转化子最适的潮霉素筛选浓度以及不同限制性内切酶和酶量对转化效率的影响;利用PCR(polymerase chain reaction)技术对潮霉素抗性转化子进行验证.结果表明转化子的最适潮霉素筛选浓度为50 μg/mL;转化效率较高的限制性内切酶为HindⅢ,并且转化效率最高时的酶量为20 U.利用该转化体系构建了含1 050个转化子的甘蓝枯萎病菌转化子库,对转化子进行Southern验证,证明该转化体系是可行的.     

江苏省葡萄炭疽病菌群体对4种杀菌剂的敏感性

为明确江苏省葡萄炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides群体对苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、咯菌腈和戊唑醇4种杀菌剂的敏感性和抗性水平,本研究采用菌丝生长速率法测定了来自江苏省7个地区的68株葡萄炭疽病菌对上述4种药剂的敏感性,建立敏感基线,并分析菌株抗性水平和抗性频率。结果表明：苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、咯菌腈和戊唑醇对供试68株葡萄炭疽病菌的EC₅₀范围分别为0.03～1.20、0.05～3.48、0.14～1.20 mg/L和0.50～12.30 mg/L;对苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯和咯菌腈的敏感基线分别为(0.53±0.032)(1.00±0.15) mg/L和(0.38±0.024) mg/L。68株菌株对戊唑醇的EC₅₀平均值为3.61 mg/L,因敏感性频率分布不符合建立敏感性基线要求,故未建立敏感性基线。供试菌株对苯醚甲环唑均表现为敏感,对吡唑醚菌酯和咯菌腈呈现一定的低抗水平,抗性频率分别为4.41%和3.03%;对戊唑醇呈低抗和中抗水平,抗性频率分别为16.18%和5.88%。该研究为防控江苏省葡萄炭疽病提...     

纳米材料二氧化钛对胶孢炭疽菌的抑制作用

对纳米材料TiO2的性质及其对胶孢炭疽菌的抑制作用进行了研究。TiO2在190～240nm处有强的吸收峰。在短波光日光灯和蓝光下TiO2具有较强的抑菌作用，TiO2A对胶孢炭疽菌的菌丝生长、产孢量及孢子萌发抑制率分别为15．21％、54．68％、80．68％，TiO2 B为30．84％、39．70％、86．70％。TiO2 A和TiO2 B的最适抑菌浓度分别为0．5和0．4mg／ml。     

胶孢炭疽菌CgSho1基因的克隆与功能分析

HOG-MAPK(high osmolarity glycerol mitogen-activated protein kinase)信号途径是真菌MAPK途径中参与渗透压响应的一条重要通路,在植物病原菌生长发育及致病过程中发挥着重要的作用。Sho1(synthetic high osmolarity-sensitive protein1)是HOG-M APK信号途径上游的一个重要感受器,在不同真菌中常具有不同的功能。本研究从胶孢炭疽菌中克隆了Sho1的同源基因,命名为Cg Sho1,该基因编码一个291个氨基酸的蛋白,含有4个跨膜结构域和一个SH3功能域。利用同源重组的方法获得了该基因的敲除突变体,与野生型相比,敲除突变体表现为营养生长缓慢,菌丝稀疏且疏水性增强,产孢量下降,对氧化压力和渗透压更加敏感,致病力明显减弱。上述结果表明,Cg Sho1参与调控胶胞炭疽菌的营养生长、分生孢子产量、氧化应激反应、渗透压响应及致病性。     

Molecular and biochemical characterization of Colletotrichum gloeosporioides isolates resistant to azoxystrobin from grape in China

Anthracnose, caused by Colletotrichum gloeosporioides, is one of the most important diseases in grape-growing regions worldwide. In Jiangsu Province of China, quinone-outside inhibitor fungicides (QoIs) have been extensively sprayed as disease control for more than 10 years. A spore germination assay of 64 isolates obtained from 32 commercial vineyards was used to assess isolate sensitivity to azoxystrobin and 62 were found to be resistant to azoxystrobin. The biological fitness of QoI-resistant (QoI^R) isolates was significantly lower than the sensitive isolates (QoI^S) in terms of mycelial growth and conidiation. Nucleotide sequence alignment of CgCytb genes from the QoI^R and QoI^S isolates revealed that two point mutations (F129L and G143A) are involved in the QoI resistance. Isolates with the G143A mutation expressed high resistance to azoxystrobin, whereas isolates carrying the F129L mutation exhibited moderate resistance. Positive cross-resistance was observed between azoxystrobin and kersoxim-methyl, pyraclostrobin, or benzothiostrobin, but not with fluazinam. This study provides important information for management of QoI^R populations of C. gloeosporioides in the field.     

火把对柑桔炭疽病菌的室内毒力试验

采用菌丝生长速率法,用杀菌剂火把对柑桔炭疽病菌进行了室内毒力测定,测得火把对柑桔炭疽病的EC50值为0.8110μg/mL,EC98值为10.5435μg/mL,确定了其在室内有效抑菌浓度。本试验有利于指导进一步的室外药效试验以确定实际应用中的最佳施用浓度。     

草莓胶孢炭疽菌CFEM候选效应子的生物信息学鉴定及其侵染过程中的转录分析

病原真菌通常分泌效应子到寄主组织中调控寄主的生理过程,从而有利于其侵染。CFEM(common in several fungal extracellular membrane)蛋白是真菌所独有的,且与致病性密切相关。本研究利用Pfam数据库对草莓胶孢炭疽菌全基因组进行搜索,鉴定获得22个CFEM蛋白。对CFEM蛋白的信号肽、跨膜结构域和亚细胞定位进行分析,结果表明仅有8个CFEM蛋白为分泌蛋白。对CFEM分泌蛋白在不同侵染阶段的转录情况进行转录组学及RT-PCR分析,结果显示8个CFEM蛋白在侵染后不同时期均有表达。其中,1个CFEM分泌蛋白于附着胞形成期特异表达,2个于活体寄生阶段特异表达,2个于死体寄生阶段特异表达。综合上述分析结果,预测这8个分泌蛋白可能为草莓胶孢炭疽菌的效应子。本研究为深入解析植物病原真菌CFEM效应子提供了理论依据。     

芒果炭疽病菌对多菌灵的抗药性

对来自广东和海南等不同果园的芒果炭疽病菌进行了对多菌灵的抗性测定.结果表明,敏感菌株的最小抑制浓度(MIC)为0.110μg/mL,而抗性菌株在多菌灵500μg/mL下仍生长良好.抗性菌株经继代培养10代后抗性几乎不变,说明其抗性稳定.对抗、感菌株的生物学特性进行测定,然后以产孢量和致病力分别用MIC做简单相关性分析,证明病菌的生物学特性、产孢量、致病力与抗药性无关,因此可以认为病菌对多菌灵的抗药性突变并不影响其正常的生理功能.抗性菌株对甲基硫菌灵、苯菌灵、噻菌灵表现正交互抗性,而对乙霉威和咪鲜胺敏感.病菌在含药培养基上测定的敏感性与在经多菌灵处理过的离体果实上的敏感性有较好的对应关系,可用于大田抗药性的初步检测.