实验用荣昌猪SLA-1等位基因鉴定及分子遗传特征分析

旨在明确实验用荣昌猪SLA遗传背景，深入研究SLA-1分子相关的抗原递呈和免疫应答机制，本研究对27头荣昌猪采集抗凝血，分离外周血淋巴细胞，提取总RNA,设计特异性引物对SLA-1基因进行RT-PCR扩增、克隆和测序，对获得序列的分子特征进行分析。结果显示，荣昌猪中共获得11个SLA-1等位基因，其中，9个为新等位基因，全部获得GenBank登录号和ISAG SLA命名委员会官方命名，SLA-1^*24:01等位基因在该群体中频率最高。SLA-1基因编码区全长1 086 bp,存在127个核苷酸多态位点，非同义单核苷酸多态性位点数高于同义单核苷酸多态性位点数。核苷酸多样度为0.044 9,单倍型多样度为1,平均核苷酸差异数为48.782,G+C含量为64.9%。SLA-1基因编码的361个氨基酸中，有75个氨基酸变异位点；第2和第3外显子编码区多态性最高，且第2外显子区域的氨基酸变异程度高于第3外显子区，组成抗原肽结合槽6个口袋的33个关键氨基酸位点中，11个在人与荣昌猪之间高度保守，与β2-微球蛋白结合的19个关键氨基酸位点中，10个保持一致，CD8分子与MHC结...     

苏紫猪SLA-1基因多态性及其抗病潜能分析

【目的】探究苏紫猪白细胞抗原-1(swine leukocyte antigen-1,SLA-1)基因多态性,并对其抗病潜能进行分析,以期为苏紫猪分子育种提供理论基础。【方法】以苏紫猪血细胞cDNA为模板,用PCR法扩增苏紫猪SLA-1基因并测序,利用DNAStar和Mega 5.0软件分别进行相似性分析及系统进化树构建;利用NetMHCpan 4.1 server分析SLA-1与非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗原表位结合的能力及特征;运用生物学软件对其编码蛋白的理化性质、亲/疏水性、跨膜区、结构和功能等进行预测。【结果】试验成功扩增6条苏紫猪SLA-1等位基因序列,分别为SLA-1*sz01、SLA-1*sz02、SLA-1*sz03、SLA-1*sz04、SLA-1*sz05和SLA-1*sz06,其高变异位点主要位于肽结合沟(peptide-binding groove, PBG)α1区和α2区;相似性比对结果显示,6条苏紫猪SLA-1等位基因核苷酸、氨基酸序列相似性分别在92.9%～96.9%、87.0%～94.8%之间,与不同品...     

猪SLAⅡ类基因多态性及其与抗病性状关联的研究进展

猪的白细胞抗原（swine lymphocyte antigen,SLA）是猪体内与抗病性和免疫应答密切相关的一组基因群，它不仅编码移植抗原，控制移植排斥反应，还参与免疫应答调控和免疫识别，其中最重要的功能之一就是抗原递呈。对SLA的深入研究不仅可以为兽医临床免疫耐受、表位疫苗的研制提供先进的理论基础，同时还有助于发现猪抗病育种中有效的候选基因。作者就SLAⅡ类基因的多态性及其与抗病性状关联的研究作一综述。     

托佩克猪SLA-1-632-TPK基因的矫正及重组质粒SLA-1-TPK/pMD19-T的构建

猪白细胞抗原（swine leukocyte antigen,SLA）在猪免疫系统中起递呈抗原作用,对其展开研究可为猪相关传染病的预防提供依据。研究发现,托佩克猪SLA-1-632-TPK基因编码序列发生碱基缺失（距离SLA-1-632-TPK基因5'端632 bp处丢失1个碱基"C"）,导致移码突变。为矫正SLA-1-632-TPK基因,设计2对矫正引物,以原重组质粒SLA-1-632-TPK/pMD18-T为模板,利用剪切重叠延伸PCR（splicing overlap extention PCR,SOE-PCR）技术分别扩增SLA-1-632-TPK 5'和3'端,之后进行拼接,最后扩增全序列从而矫正目的基因,并进一步连接pMD19-T Simple载体,通过单菌落PCR筛选阳性克隆并测序,并通过GENETYX version 9.0软件对所测序列进行分析。结果显示,SOE-PCR成功扩增得到5'和3'端片段,大小约为650和590 bp,与理论设计值大小（648和585 bp）接近,经过拼接以后,得到全长约1 200 bp,与理论设计值1 223 bp接近。菌落PCR结果显示,矫正基因成功克隆入pMD19-T Simple载体。序列分析结果显示,托佩克猪SLA-1-632-TPK基因距离5'端632 bp处丢失的碱基"C"得到矫正并正确编码。本研究成功矫正了SLA-1-632-TPK基因,并构建其重组质粒SLA-1-TPK/pMD19-T,为下一步研究SLA-1-TPK蛋白表达和相关功能奠定基础。     

SLA-DRB基因多态性与仔猪腹泻的关联性研究进展

仔猪腹泻是一种以新生和幼龄仔猪为主的肠道感染病,造成腹泻的病因包括病原菌、饲养和遗传因素。猪白细胞抗原(Swine leukocyte antigen,SLA)是猪主要组织相容性复合体(MHC)基因的编码产物,作为动物抗病力的遗传标记,在选择抗病性猪种方面具有重要的辅助性。DR和DQ亚区是SLAⅡ类基因中遗传多态性最为丰富的区域,在控制机体的免疫应答与调节中发挥着重要作用,与猪的抗病能力密切相关。国内大量研究均显示SLA-DRB基因与仔猪腹泻的发病密切相关,本文主要论述SLA-DRB基因多态性与仔猪腹泻的关联性研究进展。     

猪肾上皮细胞SLA-1基因的克隆及分子结构特征分析

【目的】利用猪肾上皮细胞15(PK15)建立系统的猪白细胞抗原1(SLA-1)抗原表位筛选系统。【方法】提取PK15细胞总RNA,设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增SLA-1基因(SLA-1*PK15),将该基因克隆到pMD18-T载体上,并进行双酶切及测序鉴定;利用DNAMAN 5.2.2、Mega 5.0、Multalin及同源建模进行系统进化树、二级结构、三级结构分析。【结果】RT-PCR扩增获得约1 400 bp条带,质粒提取和酶切鉴定结果表明SLA-1成功插入pMD18-T载体;测序结果证实该基因共1 419 bp,其中2-1 087 bp为编码区,共编码361个氨基酸,信号肽为21个氨基酸,符合SLA-1基因特征。进化树分析结果显示,SLA-1*PK15与SLA-1*wxd(中国梅山猪)和SLA-1*0401(中国巴马小型猪)进化关系最近,而与SLA-1*lr02(丹麦长白猪)及SLA-1*0509(中国西藏野猪)进化关系较远。胞外区氨基酸比较分析表明,PK15细胞SLA-1基因与其他SLA-1基因胞外区主要变异位点存在于α1区和α2区,α3区的变异位点较少,无特征性...     

SLA-Ⅰα链和β链的原核表达与抗血清制备

猪主要组织相容性复合体Ⅰ类分子又称猪白细胞抗原Ⅰ类分子(SLA-Ⅰ),参与内源性抗原在体内的递呈过程,其结构包括重链(α链)和轻链(β链)两部分。本研究首先采用RT-PCR从原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增出SLA-Ⅰα链胞外区基因和β链基因;继而利用原核表达系统获得包涵体形式表达的SLA-Ⅰα链胞外区和β链重组蛋白质;将目的重组蛋白质洗涤、复性、纯化后,经Western blot及质谱技术进行验证。以纯化的重组蛋白质免疫兔制备抗血清,经间接ELISA检测其效价达1∶256 000。以制备的抗血清进行Western blot和间接免疫荧光试验,结果显示,所制备的抗血清能够特异性地识别原代及传代PAM表达的SLA-Ⅰα链及β链蛋白。研究结果不仅为SLA-Ⅰ类分子的功能研究提供了有用的分析试剂,也为病毒感染的免疫机制研究奠定了必要的基础。     

甘肃合作猪白细胞抗原经典Ⅱ类分子DR基因克隆及生物信息学分析

为了克隆甘肃合作猪白细胞抗原(SLA)DRA和DRB基因,分析SLA-DR基因特性和抗原多态性,首次研究了甘肃合作猪在异种移植等研究领域中的应用前景.应用RT-PCR分别扩增合作猪SLA-DRA和SLA-DRB基因并进行测序,将所获得基因序列登录GenBank(登录号分别为FJ905823和FJ9058258),再用NCBI中的BLAST和ExPASy等相关软件进行生物信息学分析.发现在猪-人异种移植中,近亲繁殖的合作猪种在与人类主要组织相容性复合体遗传基因水平相似性方面有一定优势,也可作为备选猪种对相关基因进行必要的修饰和改造.     

猪SLA—DRA基因外显子2多态性及其与仔猪腹泻的关联分析

为探索SLA—DRA基因作为猪抗病育种分子标记的可能性，本研究采用PCR—SSCP和克隆测序方法对大白、长白和杜洛克共216头猪的SIA—DRA基因外显子2进行了多态性研究，分析了该基因与仔猪腹泻的关联性。结果表明，在SLA—DRA外显子2上检出了3个等位基因和6种基因型：     

猪SLA免疫学相关研究进展

主要组织相容性复合体(MHC)是一类编码细胞表面糖蛋白的异质二聚体,在脊椎动物中分布广泛,由于具有能够参与免疫应答诱导和调节的特性,使其成为现代免疫学相关研究的热点之一。猪的主要组织相容性复合体又称猪白细胞抗原(SLA),位于第7号染色体并横跨着丝粒,分为Ⅰ类基因、Ⅱ类基因和Ⅲ类基因,它不仅参与移植排斥反应而且在多种免疫应答反应中起到调节作用。文章围绕SLA基因介绍了其免疫抗病现状、在细胞亚群上的表达、对猪免疫生产的影响、参与病原体调控机制及相关T淋巴细胞抗原表位分析等免疫相关研究进展。最后展望了作为抗病遗传标记物的SLA基因在免疫学方面的研究发展方向,认为应该着力探究SLA等位基因和单倍型在控制免疫相关反应时起到的调控作用、确定特异性抗原表位、鉴定关键的免疫细胞亚群和确切的SLA基因座,并对猪基因组序列和基因组学及蛋白组学工具进行更新改良,从而对SLA基因调节的新型免疫相关途径的开发起到指导作用。     

中国2个地方品系猪SLA-3原核表达载体构建及表达

为构建中国地方品系荷包猪及莱芜黑猪SLA-3(命名为SLA-3-HB和SLA-3-LW)原核表达载体及表达目的蛋白,试验通过PCR扩增获得SLA-3胞外区基因,并克隆至pMD19-T Simple载体,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,酶切及测序筛选阳性重组质粒;重组质粒经酶切回收,目的片段进一步连接pET-21a(+)表达载体,并转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导目的基因的表达;SDS-PAGE检测目的蛋白。结果显示,PCR成功扩增SLA-3-HB及SLA-3-LW胞外区,大小约850 bp,目的基因成功克隆至pMD19-T Simple载体,并筛选序列正确的阳性重组质粒。进一步研究证实,SLA-3-HB及SLA-3-LW成功连接到表达载体pET-21a(+),插入片段长度均为831 bp。经诱导后,SLA-3-HB及SLA-3-LW均成功表达,表达蛋白大小为31 ku,相对表达含量达到40%。本研究成功构建了中国地方品系荷包猪及莱芜黑猪SLA-3原核表达载体,为进一步研究其结构和功能奠定基础。     

不同品种猪SLA-DQA、FUT1和MUC4基因遗传变异初析

为了解析地方猪种淮南猪抗逆性强的分子机制,试验采用PCR-RFLP方法对4个猪种(淮南猪、杜洛克猪、大白猪和长白猪共计395头)的猪耳组织白细胞抗原(SLA)-DQA基因、α-1岩藻糖转移酶基因1(FUT1基因)和4型黏蛋白(MUC4)基因进行多态性分析。结果表明:4个猪种在SLA-DQA基因座位存在多态性,AA型在4个猪种中基因型频率最高,淮南猪为中等多态,其他3个猪种为低度多态,淮南猪与长白猪、大白猪品种间基因型分布差异极显著(P0.01),淮南猪与杜洛克猪品种间基因型分布差异不显著(P0.05);FUT1基因座位也存在多态性,GG基因型在4个猪种中基因型频率最高,淮南猪、大白猪和杜洛克猪都是中等多态,长白猪是低度多态,淮南猪与长白猪品种间基因型分布差异极显著(P0.01),淮南猪与大白猪、杜洛克猪品种间基因型分布差异不显著(P0.05);MUC4基因座位同样也存在多态性,AA基因型在淮南猪、长白猪和大白猪中基因型频率最高,AG基因型在杜洛克猪中基因型频率最高,淮南猪和杜洛克猪都是中等多态,大白猪是低度多态,淮南猪与长白猪、杜洛克猪品种间基因型分布差异极显著(P0.01),淮南猪与大白猪品种间基因型分布差异显著(P0.05)。说明淮南猪在这3个基因上都有着较高的遗传多样性,更适合用于抗病育种研究的实践中。     

荷包猪SLA-1重链四聚体前体链的构建及表达研究

试验旨在构建荷包猪猪白细胞抗原1（swine lymphocyte antigen 1,SLA-1）重链四聚体前体链并研究其在表达载体pET-21a（+）中蛋白的表达情况。以SLA-1全基因序列为模板,结合表达载体的特点设计引物,利用PCR扩增技术在SLA-1-HB01胞外区序列C-末端加载上可生物素酰化序列（BirA substrate peptide,BSP）。将PCR扩增产物SLA-1-HB01-BSP克隆到pEASY T1载体上,筛选出阳性克隆菌SLA-1-HB01-BSP/pEASY T1,经双酶切后进一步与表达载体pET-21a（+）连接,再转化到E.coli BL21感受态细胞中构建pET-21a（+）/SLA-1-HB01-BSP重组表达菌,通过IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测蛋白的大小及表达情况,提取包涵体检测蛋白的纯度。PCR扩增结果显示,SLA-1-HB01-BSP大小为898 bp,与理论值相符,扩增片段成功克隆至pEASY T1载体构建克隆菌,经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切筛选及测序,成功获得阳性克隆菌株SLA-1-HB01-BSP/pEASY T1,插入的目的基因片段大小为876 bp。阳性克隆菌株与pET-21a（+）表达载体经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后进行连接,转化E coli BL21感受态细胞后获得pET-21a（+）/SLA-1-HB01-BSP重组表达菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小为31.4 ku。进一步检测分析发现,目的蛋白以包涵体形式存在,且蛋白纯度达到80%以上。本研究成功构建了荷包猪SLA-1-HB01重链四聚体前体链的pET-21a（+）重组表达体系,为下一步进行猪SLA Ⅰ类分子四聚体的检测奠定基础。     

野猪SLA—DQB外显子2的核苷酸多态性分析

本试验采用DNA测序技术测定了15头野猪235bp的SLA—DQB基因外显子2序列．结合GeneBank中报道的另3头野猪和18头家猪共36个个体的相应序列，重点对野猪SLA—DQB外显子2进行核苷酸多态性分析。结果表明野猪SLA—DQB外显子2具有较丰富的核苷酸多态性；在家猪品种改良中，野猪具有潜在的遗传价值。     

撒坝猪SLA-DQB基因与生长性状的相关性分析

<正>猪的主要组织相容性复合体(SLA)新名为Sudo,首先由Vainman等人于1970年提出。SLA位于7号染色体的短臂上,与J、C血型系统连锁在一起,其结构与人的主要组织相容性复合体(MHC)极相似,猪MHC又称为SLA,其Ⅱ类基因位于SLA-D区,它控制机体的免疫应答与调控,在调节机体的抗病能力方面起非常重要的作用。Ⅱ类基因主要包括DRA、DRB、DQA、DQB、DOB、DPA、TAP、LMP等。研究表明,具有Ⅱ类不同多态性的猪对疾病的抵抗能力有差异[1-8]。目前,对SLA-DQB基因的研究主要是针对     

大约克猪SLA-1原核表达载体的构建及表达

为构建大约克猪SLA-1胞外区的原核表达载体及表达目的蛋白,试验设计1对引物,经PCR扩增获得大约克猪SLA-1胞外区基因（命名为SLA-1-DYKe）,将此片段克隆至pMD^®19-T Simple Vector,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切筛选阳性克隆菌并测序,将目的基因插入到原核表达载体pET-28a（+）中,转化至宿主菌BL21（DE3）进行诱导表达,用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况,大量诱导提取包涵体并检测。结果显示,PCR成功扩增SLA-1-DYKe的胞外区,得到大小为837 bp的目的基因,目的基因成功克隆至pMD^®19-T Simple Vector,并获得序列正确的重组质粒。以得到的重组质粒成功构建了SLA-1-DYKe/pET-28a（+）表达载体,目的蛋白大小约为34 ku。本研究成功构建了大约克猪SLA-1原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后研究大约克猪SLA-1的空间结构和基因功能奠定了基础。     

托佩克猪SLA-2与β2m复合体的构建

以托佩克猪重链基因SLA-2和轻链基因β2m为研究对象,体外通过剪接重叠延伸PCR(splicing overlap extension PCR,SOE-PCR)技术重构复合体,并将复合体基因链克隆入p2X表达质粒,导入受体茵TB1并进行表达.结果显示,体外重构的托佩克猪SLA-2与β2m复合体基因以融合蛋白MBP-S...     

撒坝猪及长撒二元杂交猪SLA-DQB基因与繁殖性状的相关性分析

<正>猪主要组织相容性复合物(MHC),又称为SLA,即猪白细胞抗原。SLA位于7号染色体的短臂上,与J、C两血型系统连锁在一起,其结构与人的MHC极为相似。猪MHC的Ⅱ类基因位于SLA-D区,它控制着机体的免疫应答与调控,在调节机体的抗病能力方面起到非常重要的作用。有研究表明,具Ⅱ类不同     

SLA与免疫抗病的研究进展

猪主要组织相容性复合物(SLA)与免疫应答和一些疾病抗性密切相关,对其免疫遗传机制的深入探讨是多年来的研究热点。随着分子生物学和基因工程技术的发展,从遗传选育角度提高猪对病原的抗性,开展抗病育种具有治本的功效。本文就SLA与免疫应答、寄生虫、黑色素瘤的关联分析以及体外重构SLA分子4个方面的研究进展加以阐述,为进一步探讨SLA与抗病遗传育种等功能研究提供了参考。     

肌细胞生成素基因研究进展

本文就猪、鼠及肌细胞生成素(myogenin,MYOG)基因的位置、结构、生物学功能、多态性及检测方法、多态性与生产性能的关系进行了较为详细的论述。对MYOG的进一步研究提出了看法