玉米抗病相关基因ZmEDS1的克隆及表达分析

从玉米中克隆ZmEDS1基因的cDNA序列,全长2 164 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)长1 860 bp,编码619个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白等电点为6.05,分子量为68.74 kDa,内部无信号肽结构,N端有一个酯酶结构域。系统进化树分析表明,玉米ZmEDS1蛋白和高粱EDS1L蛋白的亲缘关系最近,同源性高达94%。采用实时荧光定量PCR分析病毒侵染下该基因在感性材料郑58和抗性材料D863F中的表达模式,在两种材料中,ZmEDS1基因均在病毒侵染48 h的表达量最高,分别达到0 h对照组感、抗材料的1.56、3.47倍,在抗病材料D863F中的表达水平高于感病材料郑58。初步判断,ZmEDS1基因应答病毒的侵染过程,且在感病材料和抗病材料中的响应模式存在差异。     

小麦灌浆相关基因TaGIF1的克隆及表达分析

GIF1( grain incomplete filling 1)编码了一种质外体途径中催化蔗糖不可逆水解的细胞壁蔗糖转化酶,主要在组织生长旺盛并且需要供能的库中表达,是影响灌浆的关键基因。根据水稻 OsGIF1基因序列,同源克隆了普通小麦第2部分同源群染色体上的 TaGIF1基因,它包含7个外显子和6个内含子,与水稻OsGIF1基因结构相似。小麦 TaGIF1-2A基因含有237 bp的5′UTR、1 986 bp的ORF、262 bp的3′UTR,编码661个氨基酸。通过分析15份大小粒小麦品种的gDNA序列,在 TaGIF1-2A基因中共发现21个SNP位点,9个位于编码区,12个位于非编码区。SNP分组发现,15份大小粒小麦品种中 TaGIF1-2A基因共存在8种单倍型。氨基酸序列比对显示,共存在2个氨基酸变异位点,其余SNP位点未引起氨基酸的改变。大小粒品种中无特异SNP变异,表明该基因编码区序列高度保守。就 TaGIF1-2A启动子区而言,大粒材料元件数量和种类均多于小粒材料,而且这些元件均与籽粒发育相关,说明 TaGIF1-2A基因启动子的活跃程度与最终籽粒灌浆饱满度的形成可能存在密切联系。qRT-PCR分析表明, TaGIF1-2A在籽粒和颖壳中都有表达,在不同小麦材料中表达模式相同,说明与籽粒大小无关;而在2～6 DAA的籽粒中,表达量剧烈上调,而后急剧下调,由此推测 TaGIF1-2A可能影响籽粒灌浆,在灌浆前期与籽粒发育密切相关。亚细胞定位结果表明,TaGIF1-2A主要作用在细胞壁上。     

青稞HvnWRKY26基因的克隆及表达分析

WRKY家族转录因子广泛参与植物的生物和非生物胁迫过程。为探索WRKY家族转录因子在青稞抗条纹病过程中的作用,本课题组前期利用条纹病菌分别侵染抗病青稞品种昆仑14号和感病品种Z1141,并进行转录组测序,发现一个在侵染时期差异表达的WRKY基因家族成员。序列分析发现,该基因的开放阅读框为765 bp,可编码255个氨基酸,具有典型的WRKY结构域,属于WRKY基因家族。Uniprot注释结果表明,该蛋白为HvnWRKY26。启动子区域预测表明,该区域含有脱落酸和茉莉酸响应元件以及与干旱、低温、盐胁迫和防御应激等逆境胁迫相关的顺式作用元件。序列比对分析显示,HvnWRKY26蛋白与其他物种中同源蛋白的氨基酸序列一致性均不高,但该蛋白与大麦HvWRKY26蛋白的WRKY结构域序列完全相同。系统进化分析表明,青稞HvnWRKY26与大麦WRKY26的亲缘关系最近;进一步对HvnWRKY26及与其亲缘关系较近的大麦、玉米、水稻WRKY蛋白进行进化分析,发现这些WRKY蛋白被分为A、B和C三大类,其中HvnWRKY26蛋白属于A类。RNA-seq和qRT-PCR分析结果表明,青稞在遭受条纹病菌侵染时,HvnWRKY26基因的相对表达量在抗病品种昆仑14号和感病品种Z1141中均显著上调表达,且抗病品种的表达量显著高于感病品种,推测HvnWRKY26基因在青稞抗条纹病过程中发挥重要作用。     

玉米氮胁迫响应NRT基因的鉴定及ZmNRT2.5的克隆和表达分析

硝酸盐转运蛋白(Nitrate Transporters,NRTs)在植物根系NO₃^-吸收或转运中发挥重要作用。为探究玉米NRTs基因在氮素吸收中的功能,从前期转录组数据中鉴定出7个响应氮素处理的差异表达ZmNRTs基因。启动子顺式作用元件分析表明,这些ZmNRTs基因的启动子均含有多个植物逆境或激素应答元件,推测他们可能与玉米非生物胁迫应答或植物激素调控氮素吸收相关。从玉米根系中克隆了对氮素处理响应最大的ZmNRT2.5,该基因CDs全长为1 563 bp,编码520个氨基酸。进化树分析结果表明,ZmNRT2.5与AtNRT2.5同源性最高,含有保守的硝酸盐转运结构域,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,含11个跨膜结构域。实时荧光定量PCR分析表明,ZmNRT2.5主要在根、老叶和叶鞘中表达。低氮处理显著诱导ZmNRT2.5在根中的表达,植物激素脱落酸、赤霉素和乙烯均参与调控ZmNRT2.5的表达。同时,ZmNRT2.5基因的表达受到盐胁迫的显著抑制。     

小麦近等基因系TcLr19中TaABCF基因的克隆及表达分析

为了挖掘新的抗小麦叶锈病基因,以被无毒小麦叶锈菌诱导的TcLr19为研究对象,通过cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术在TcLr19中克隆到抗病相关基因TaABCF,并对其进行表达分析。序列分析表明,TaABCF基因的DNA和cDNA序列长度分别为3 100bp和1 885bp,包含4个内含子和5个外显子,含有两个核苷酸结合域,具有WalkerA、WalkerB和WalkerC保守序列。系统发育分析表明,TaABCF基因与来自乌拉尔图小麦的EMS53714.1基因亲缘关系最近。实时荧光定量分析表明,TaABCF基因在小麦TcLr19与小麦叶锈菌FHPL非亲和互作前期表达提高,而在感病小麦Thatcher与小麦叶锈菌FHPL的亲和互作后期表达受抑制,且在脱落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理下的表达早于水杨酸(SA)处理,说明TaABCF基因参与小麦的抗叶锈反应,且对ABA和MeJA的响应要早于SA。     

小麦逆境胁迫基因TaSKIP的克隆、定位及初步表达分析

非生物逆境是小麦生长、发育及产量形成的主要限制因子之一。为揭示小麦抗逆胁迫响应机制,并为培育转基因抗逆种质奠定基础,本研究利用同源克隆的方法从普通六倍体小麦中国春中克隆出TaSKIP基因并进行序列分析及基因定位,同时对TaSKIP基因在PEG6000胁迫下的表达模式进行分析。结果表明,共克隆得到3个TaSKIP基因,其中2个基因被定位于6A和6D染色体上。序列分析表明,TaSKIP-6A编码区长为1 827bp,编码608个氨基酸,TaSKIP-B和TaSKIP-6D编码区长均为1 824bp,编码607个氨基酸。氨基酸序列比对分析表明,小麦TaSKIP蛋白与水稻、玉米和大麦等禾本科植物SKIP蛋白的同源性均大于88%,而且含有相同的SKIP/SNW结构域。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRTPCR)检测结果表明,TaSKIP在模拟干旱胁迫条件下表达量上调,暗示该基因在小麦非生物逆境胁迫响应中起重要作用。     

玉米Opaque-2基因在毕赤酵母中的表达

从玉米自交系辽2345授粉后18 d的胚乳中提取总RNA,经反转录后得到第一链cDNA,利用Opaque-2基因的特异引物克隆出该基因的全编码区,将该编码区的全序列以正确的阅读框架利用Infusion同源重组的方法亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9的α因子下游,并置于AOXⅠ启动子控制下,利用pPIC9表达载体上的特异引物进行PCR鉴定,鉴定后的重组质粒用Bgl Ⅱ酶切线性化后,电转化导入甲醇型毕赤酵母菌株GS₁15中,利用MM、MD和菌落PCR的方法筛选出Mut⁺表型,得到的重组子以甲醇诱导表达蛋白。经SDS-PAGE结果显示,Opaque-2蛋白得到表达,其相对分子质量（Mr）约为47 KD。     

小麦木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21的克隆及赤霉病菌诱导下的表达分析

木瓜类半胱氨酸蛋白酶（PLCPs）作为一类重要的蛋白水解酶,在植物生长发育以及胁迫应答过程中都发挥着重要作用。本研究从抗、感赤霉病小麦品种差异表达基因谱中获得1个注释为RD21 Cysteine proteases的EST（表达序列标签）,以此序列检索小麦最新基因组数据库并设计引物,从小麦中克隆到3个基因,分别命名为TaRD21-2A、TaRD21-2B和TaRD21-2D,属于PLCPs RD21家族。序列分析表明,3个基因的开放阅读框长度分别为1 410、1 428和1 419 bp,分别编码469、475和472个氨基酸。序列比对发现,3个基因的序列相似性为89.3％,所编码蛋白的氨基酸序列相似性为95.6％。系统进化分析表明,TaRD21-2A、TaRD21-2B和TaRD21-2D蛋白的同源性较高,且与乌拉尔图小麦TuRD21A蛋白聚为一类。qRT-PCR分析表明,3个TaRD21基因均受水杨酸(SA)、乙烯利(ETH)以及赤霉病菌诱导表达;感病品种中,TaRD21-2A对SA和赤霉病菌的响应更迅速,且表达量较高;抗病品种中,TaRD21-2B和TaRD21-2D基因对ETH的响应更迅速。     

高粱EPSPS基因的克隆、修饰及在玉米中的功能验证

针对草甘膦结合位点,对高粱5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）基因进行4种定点修饰,将修饰后的基因分别导入到玉米中。通过对转化体的抗性鉴定,确定将高粱EPSPS基因106位的脯氨酸变为丝氨酸（P106S）能够赋予转基因玉米草甘膦抗性。在喷施4倍的草甘膦时抗性事件CL38-1不产生药害。Southern杂交结果表明,目标基因在该转化事件中稳定遗传,转化其余3种EPSPS基因的植株对草甘膦没有足够的抗性。     

小麦品种东农冬麦2号根中TaEXPA7部分同源基因的克隆及表达特性分析

膨胀素(expansin)是植物生长发育过程中诱导细胞壁松弛和伸展的蛋白,包括EXPA、EXPB、EXLA、EXLB四个基因家族,对植物根系的形成及快速发育具有重要作用。本试验以寒地冬小麦品种东农冬麦2号两叶一心期的根为材料,克隆了TaEXPA7基因的3个CDS全长,其氨基酸序列同源性较高,仅信号肽处有两个氨基酸不同,其核酸序列长度均为777bp,编码258个氨基酸,分别命名为TaEXPA7-A、TaEXPA7-B、TaEXPA7-D,且分别定位于2AL、2BL、2DL染色体。蛋白均含有DPBB-1和Pollen-allerg-1两个保守结构域,分子量为27 670.74Da,等电点为8.09,均为疏水性蛋白;与节节麦、二穗短柄草的相似性分别为99%和92%。采用两叶一心期的根进行qRT-PCR分析发现,TaEXPA7-A/B/D三个基因在根尖中的表达量均较高,伸长区和成熟区次之;对冬小麦根进行低温、干旱和激素处理后,这三个基因均下调表达,并且TaEXPA7-B基因的相对表达量较高,TaEXPA7-D的相对表达量较低。由此可见,多倍体小麦不同染色体上的基因在应对不同环境胁迫时,表达以及应答模式存在差异,并且在不同的环境胁迫下,发挥主导作用的染色体也存在差异;此外,该基因在根中的表达可能与低温、干旱以及外源激素的胁迫有一定的关系,可能是促进根系生长的重要基因。     

玉米纹枯病菌的分子检测

近年来随着气候的变化和玉米种植密度的加大,玉米纹枯病发生日益严重,该病株残体残留在田土表面土层较浅的区域进行越冬。为准确诊断玉米纹枯病,根据玉米主要病害玉米大斑病、玉米弯孢菌叶斑病、玉米灰斑病rDNA的ITS区间序列差别,设计合成1对特异性扩增引物（LZ-F+LZ-R）用于玉米纹枯病检测。该引物能从玉米纹枯病菌扩增到特异性的分子片段,说明设计的特异性引物可以用来检测玉米纹枯病菌。采集田间玉米纹枯病、玉米大斑病、玉米弯孢菌叶斑病、玉米灰斑病病株样本进行病原菌分离,同时提取其病原菌和土壤总DNA,利用上述引物进行扩增。结果表明,只有以R.solani基因组DNA为模板通过反应体系在PCR仪中进行扩增最终能扩增出1条460 bp左右清晰的特异性条带,其他菌株均无特异性条带。利用该特异性引物只能从受到该病害侵染的发病组织DNA中扩增出特异性条带,对照及健康玉米植株均无扩增条带。接种该病原菌的土壤DNA也扩增出相应的特异性条带,表明特异性引物LZ-F/LZ-R可用于玉米纹枯病菌的分子检测和早期诊断。     

东北地区玉米纹枯病菌菌丝融合群鉴定及其致病力研究

从东北地区20个市(县)玉米主产区采集玉米纹枯病标样,分离纯化得到茄丝核菌173株,对其进行菌丝融合群鉴定,共鉴定出AG1-IA、AG-5、AG4-HGⅡ等融合群以及双核菌。AG1-IA为东北地区的优势融合群,占分离菌株总数的75.57%;其次是AG-5融合群,占分离总数的18.86%;AG4-HGⅡ和双核菌株分别占1.14%和2.29%。随机选取不同地区的玉米纹枯病菌菌株64株(AG1-IA、AG5、AG4-HGⅡ、双核菌株),采用菌饼作为接种体,通过温室苗期接种鉴定,结果表明,同一融合群的菌株致病力存在明显分化现象。属于AG1-IA的菌株对3个玉米品种的平均致病力为21.88～80.21;AG-5的菌株也存在致病力分化现象,菌株对3个玉米品种的平均致病力为17.71～48.96。     

玉米脂肪酸α-双加氧酶cDNA克隆与表达分析

以玉米自交系丹340为实验材料,同源克隆到玉米脂肪酸α-双加氧酶基因(ZmDOX)cDNA序列,并利用半定量与定量RT-PCR分析其在不同组织和PEG胁迫下的表达特征。序列分析结果表明,该cDNA序列包含1 857 bp完整的开放阅读框,编码619个氨基酸残基的蛋白产物。玉米、水稻、小麦中DOX氨基酸序列高度同源,聚集在同一进化枝,而双子叶植物存在两类DOX蛋白。组织表达特征分析发现,ZmDOX在根、茎、叶中均有表达,其中在根中表达量最高。PEG胁迫条件下,根中ZmDOX对胁迫的响应较快且增加幅度较大,而在叶中表达量有降低的趋势。     

乌拉尔图小麦WOX基因的克隆与表达分析

WOX基因家族是一类植物特有的转录因子基因家族,在植物的生长发育过程发挥重要作用。本研究通过同源克隆的方法,得到乌拉尔图小麦(Triticum urartu)WOX基因家族的6个成员: TuWOX1、 TuWOX2、 TuWOX3、 TuWOX4、 TuWOX5和 TuWOX3a。生物信息学分析表明, TuWOX2、 TuWOX3和 TuWOX3a属于WUS支/进化支, TuWOX4属于古老支, TuWOX5属于中间支。除这三个分支外, TuWOX1自成一支,说明在乌拉尔图小麦中可能出现了不同功能的WOX家族基因。利用qRT-PCR技术对得到的WOX基因在乌拉尔图小麦不同组织的表达模式以及幼苗在不同非生物胁迫处理下的表达情况进行了分析,结果表明,WOX基因在乌拉尔图小麦各组织中均有表达,但在不同组织中的表达量差异较大,说明WOX基因在不同的组织中发挥作用;非生物胁迫条件下WOX基因表达水平发生了变化,表明其可以响应外界的胁迫。     

小麦纹枯病菌对氟酰胺的敏感性

为了解新型杀菌剂氟酰胺对小麦纹枯病的防治效果,采用菌丝生长速率法测定江苏省不同地区的90个小麦纹枯病菌（R.cerealis）菌株对氟酰胺的敏感性,并测定对氟酰胺敏感性不同的10个菌株对戊唑醇、咯菌腈、氟环唑、烯唑醇、丙环唑、甲基立枯磷、氟酰胺、井冈霉素A、多菌灵、氯啶菌酯和申嗪霉素等不同杀菌剂的敏感性。结果表明,小麦纹枯病菌菌株间对氟酰胺的敏感性差异较小,EC₅₀值在0.211 3～0.669 0 μg·mL^-1之间,平均为0.406 3±0.100 5 μg·mL^-1;氟酰胺对R. cerealis的抑菌效果优于多菌灵、氯啶菌酯和申嗪霉素,与井冈霉素相近;其抑菌效果明显低于三唑类杀菌剂和咯菌腈、甲基立枯磷。EC₅₀值相关性分析结果表明,小麦纹枯病菌对氟酰胺与上述杀菌剂之间不存在交互抗性。     

玉米大斑病菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆和表达分析

利用RT-PCR技术克隆玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)的GAPDH基因StGAPDH。该基因c DNA全长1 014 bp,编码337个氨基酸;蛋白质分子量36 505.44,理论pI值6.72,属弱酸、亲水、稳定蛋白,无跨膜结构域和信号肽。亚细胞定位于细胞质、线粒体和细胞核的概率分别为43.5%、30.4%和21.7%;氨基酸序列高度保守,在亲缘关系上与玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)和水稻胡麻斑病菌(Bipolaris oryzae)最近。荧光定量PCR分析表明,在病菌接种抗病玉米自交系3 d时,StGAPDH基因表达量显著高于接种5～10 d(P<0.05);接种感病玉米自交系时,接种10 d的StGAPDH基因表达量显著高于接种3～7 d(P<0.05)。     

玉米ZmFAR1基因的克隆与表达分析

FARs为脂酰辅酶A还原酶,在植物生长发育和抵御非生物胁迫过程中起着重要作用。为进一步研究FARs在玉米中行使的生物学功能,在玉米中克隆1个脂酰辅酶A还原酶1基因(ZmFAR1),该基因全长1 883 bp,开放阅读框长1 491 bp,编码496个氨基酸,分子量为55.983 k Da。生物信息学分析表明,ZmFAR1蛋白的分子式为C₂₅₂₂H₄₀₁₀N₆₉₀O₇₀₁S₂₄,为稳定的碱性亲水蛋白,存在59个磷酸化位点,未发现信号肽,存在跨膜结构域,最大可能定位于细胞质。氨基酸残基组成中主要以α螺旋和无规则卷曲为主。系统进化树分析表明,ZmFAR1蛋白与南荻和高粱的FAR蛋白相似度最高。利用实时荧光定量PCR技术对ZmFAR1在模拟盐、干旱两种非生物胁迫条件下对根、茎、叶3种组织的表达模式进行研究,结果表明,ZmFAR1呈现组织特异性表达,在叶中的表达量最高。盐和干旱处理下,ZmFAR1的表达量出现明显变化,推测ZmFAR1可能在不同程度参与了玉米对非生物胁迫的应答。