麻疯树AP2/ERF基因家族孤儿基因Soloist的克隆与原核表达分析

【目的】含有AP2结构域的AP2/ERF蛋白是与植物抗逆性密切相关的转录因子家族,Soloist是AP2/ERF家族中的孤儿基因,大部分植物只有1个。克隆麻疯树该基因编码框的全长c DNA序列,并对其理化性质、基因结构、启动子区域调控元件、表达特性及蛋白原核表达进行分析,为深入开展麻疯树Soloist基因的功能鉴定及其在麻疯树遗传改良中的应用提供依据。【方法】利用AP2结构域的隐马尔可夫模型结合拟南芥与水稻的Soloist蛋白序列对麻疯树蛋白质数据库进行相似性检索,经过Pfam与CDD在线工具的验证获得麻疯树AP2/ERF基因家族成员。利用不同的工具对Soloist基因进行生物信息学对比分析。通过实时荧光定量PCR检测该基因在麻疯树不同器官及低温处理下的相对表达量。通过双酶切构建该基因的原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行IPTG诱导表达,分别收集不同诱导时间段的菌液,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况。【结果】共鉴定到119个麻疯树AP2/ERF家族基因,其中包含1个Soloist基因,命名为Jc Soloist。序列分析显示,麻疯树Jc Soloist基因编码框长度为699 bp,编码232个氨基酸,预测分子量为26.3 k Da,理论等电点为9.65,包含6个外显子与5个内含子。在其基因启动子序列中鉴定到TATA框、CAAT框,以及赤霉素、水杨酸及干旱等应答元件。表达分析显示,麻疯树Jc Soloist基因在麻疯树各器官中都有表达,但表达水平具有器官特异性,在根中表达量较高,而在叶片中表达量相对较低,同时,在叶片与根中都属于低温诱导表达基因,分别在低温胁迫3 h与24 h达到最大表达量,较对照提高34.38倍与3.83倍。构建了p ET-32a-Jc Soloist重组载体,且在原核细胞中稳定表达,SDS-PAGE结果显示融合蛋白分子量为46.0 k Da,与预期大小一致。【结论】麻疯树AP2/ERF基因家族鉴定到1个Soloist基因,包含由3条反平行β-折叠与1条α-螺旋组成的AP2结构域,与其他物种的报道一致。基因启动子区域鉴定到赤霉素、水杨酸等顺式作用元件,暗示该基因在麻疯树激素信号转导中发挥重要作用。Jc Soloist基因在麻疯树叶片与根中受低温诱导表达显著,说明该基因参与麻疯树低温响应过程以及低温信号转导途径,也成为麻疯树抗冷新品种选育的候选基因。     

麻疯树花的形态和解剖结构

对麻疯树花序、雌花及雄花连续石蜡切片进行观察,结果表明:同一花序不同分枝上花的发育下部枝早于上部枝。同一花序分枝上位于二歧聚伞花序的中央的花发育早期早于两边的花。雌花在发育上经过两性时期,但雄蕊后来停止发育,形成功能上的单性花;雄花的发育则不经过两性时期,即在结构和功能上均为单性花。胚珠原基在发育过程中生长方向发生约90°改变,最终形成倒生胚珠。     

四川麻疯树花序结构和雌雄花动态研究

本文研究了四川麻疯树雌雄花序结构和雌雄花动态,初步描述了麻疯树的花序结构和生殖物候,分析了雌雄花数目和比例的影响因素.麻疯树为单性花同株,腋生或顶生聚伞花序,雌花一般着生于有限花序的顶端,雄花由无限花序的顶端产生.由于资源限制,麻疯树花蕾期雌花和雄花并不能全部发育至开放阶段,中途出现萎蔫、脱落.生殖物候存在很大的样地间差异,也存在样地内麻疯树着生微环境异质性的差异.麻疯树雌花比例和数目存在较大的样地间差异,可能受水分条件的影响.开花时间也会影响到雌花比例和数目,头茬花高于二茬花,早花高于晚花.结果枝的大小会影响到雌花数目和比例,结果枝越大,雌花数目和比例越大.综合分析,麻疯树单枝雌花数目、雌雄花比例可能受单枝头年的将来投资和样地非生物环境的影响.     

遮荫对单性花同株植物麻疯树性比与构件大小的影响

光照环境对营养生长存在明显影响已经是不争的事实,但光照影响器官的效应必然会引起生殖性状的反应,尤其是雌性适合度表达。本文利用麻疯树林分乔木林遮光与否的对比,研究遮光对麻疯树构件水平上营养器官与生殖器官的影响,探究光照对雌花数量与性比影响的本质问题。结果如下:(1)倮果桥林下麻疯树雌花数量频度分布偏左,平均为2.716 0/支±3.3052/支,而林外频度分布偏右,平均为5.0417/支±4.4106/支,二者差异极为明显;(2)倮果桥林下性比频度分布偏左,平均为0.0278/支±0.0215/支,而林外麻疯树性比频度分布偏右,平均为0.0378/支±0.0738/支,二者存在显著差异;(3)林下构件直径频度分布偏左,平均为0.8112 cm±0.1973 cm,而林外构件直径为0.9125 cm±0.2809 cm,频度分布偏右,林外与林外构件直径差异极为显著;(4)林下构件长度为8.3255 cm±10.057 cm,频度分布偏左,而林外构件长度为18.548 cm±19.3817 cm,构件枝长在林下与林外存在极显著差异。乔木林遮光使得麻疯树雌花分化数量与性比偏低,频度分布偏左,表明光照降低了麻疯树的雌花分化能力。进一步分析表明,雌花分化能力降低与构件大小减小有关,表明光资源限制通过降低营养器官生长量进而实现对雌花分化的影响与调节。     

‘无籽瓯柑’CsRAD51基因的克隆及在花粉发育过程中的表达分析

‘无籽瓯柑’的雄性不育主要表现为花粉败育,起始于小孢子母细胞减数分裂时期。本研究克隆了‘无籽瓯柑’减数分裂相关基因Cs RAD51,并采用荧光定量PCR检测其在瓯柑及‘无籽瓯柑’中的表达差异。结果显示,Cs RAD51基因的c DNA全长1210 bp,含有一个1029 bp的ORF区;其编码的蛋白质属于疏水性蛋白,分子量45740.1D,氨基酸数388,原子总数6 555,等电点10.20。同源性比对发现,‘无籽瓯柑’Cs RAD51的氨基酸序列与甜橙、麻疯树、油棕、黄瓜、黑杨等的RAD51蛋白高度同源,分别达99%,98%,98%,98%,98%。RT-PCR结果显示‘无籽瓯柑’Cs RAD51在小孢子母细胞、四分体以及单核花粉粒时期的相对表达量显著高于瓯柑。Cs RAD51的过量表达可能影响了DSBs的同源重组修复,致使‘无籽瓯柑’小孢子母细胞时期减数分裂异常。     

攀枝花市麻疯树生殖构件特征与雌雄花配置研究

生殖构件是研究单性花同株植物性别分化影响因素的基础。本文描述了攀枝花市几个麻疯树林分的生殖构件数量特征和雌雄花配置问题,分析了影响生殖构件的可能因素,为认识麻疯树生殖特性提供了基础资料。麻疯树生殖构件的枝条长度主要以0．3cm～15cm、直径以0．5cm～1．0cm之间的枝条为主体,该区段生殖构件分布的频度较高。同时,麻疯树的雌花数量、雄花数量和花总数的数量结构都可以看出,分布图为偏左分布,表明这些生殖参数以低数量为主体。在样地水平上,不同调查样地麻疯树生殖构件的大小明显不同,可能受到土壤厚度的影响。麻疯树枝条大小（体积）是花数量的决定性因素,表明了枝条营养对生殖构件影响的有效性。麻疯树雌雄花配置存在明显的线性相关,暗示了麻疯树雌花比例或性比可能存在一定程度的遗传稳定性。雌花比例或性比与雄花数量、花总数无关,表明了雌花比例或性比决定受到环境因素影响。总之,攀枝花市麻疯树生殖构件偏小,性比较低,可能受到林分密度和土壤厚度等因素的影响。     

苹果属无融合生殖SERK1基因的克隆与生物信息学分析

[目的]为探讨苹果属植物无融合生殖分子机制。[方法]以苹果属平邑甜茶及杂种后代33#为试材,以苹果基因组CDS序列设计引物,通过PCR扩增技术克隆出SERK同源基因的cDNA全长序列,命名为MhSERK1和MhdSERK1(GenBank登录号JQ231273和JQ231272),利用实时定量RTqPCR的方法检测了这两个基因在平邑甜茶和杂种后代各组织和器官中的表达模式。[结果]序列分析显示MhSERK1和MhdSERK1编码区序列全长为1 899 bp和1 881 bp,分别编码632和626个氨基酸,其氨基酸序列与其他植物的SERK1同源基因所编码的氨基酸同源性都在80%以上,特别是与葡萄科龙眼品种同源性最高,高达92.56%,与模式植物拟南芥、烟草等植物的SERK同源基因都具有很高的同源性。实时定量PCR结果表明,在平邑甜茶和杂种后代不同组织、花器官中SERK1基因的表达量存在差异,其中在子房中的表达量最高,在营养生长的组织中表达量很低,在平邑甜茶花蕾期的子房中表达量最高。[结论]推测该基因在平邑甜茶和杂种后代的生殖发育过程中可能发挥重要作用。     

麻疯树新基因JcPIP的分子克隆与功能研究

从大戟科耐旱植物麻疯树cDNA中克隆得到了一个麻疯树质膜内膜蛋白(PIP)新基因(JcPIP).其cRNA在非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)中异源表达后发现细胞膨胀率扩大了10倍.聚类分析表明,麻疯树PIP蛋白与蓖麻、葡萄和菠菜PIP蛋白在进化上有最近的亲缘关系.半定量RT-PCR研究表明该基因在植株的整个生长发育期都有表达.但干旱胁迫下JcPIP基因表达量没有显著变化.     

白桦雌雄花发育周期的时序特征

以20～30年生白桦的雌雄花序为材料,研究东北地区白桦花发育的生殖周期和发育时序特征.结果表明:雌花序出现于4月中下旬,5～10 d后开始受粉,持续1周左右; 大孢子母细胞于5月中旬开始减数分裂,3～4 d后形成大孢子,功能大孢子继续发育,成熟胚囊在5月底产生,并进行受精,6月初开始胚胎发育,8月中下旬种子成熟.雄花序出现于5月底,比雌花序晚1个月左右; 小孢子母细胞于7月中旬开始减数分裂,8月中旬结束,历时近1个月; 白桦的雄配子体发育很特殊,在当年不形成成熟的雄配子体,以单核小孢子状态宿存于雄花序中越冬,直到第2年4月中下旬才发育成熟,形成具有2核或3核的成熟花粉,随即散粉.雌花受粉时的花粉来源于前1年出现、宿存越冬、第2年4月底开始散粉的雄花.通过比较,建立东北地区白桦雌雄花生殖周期时序特征表,并对白桦雌雄花发育的时序特点进行讨论.     

11条白桦BpSPL家族基因的生物信息学和表达分析

[目的]研究白桦中SPL转录因子的基因序列特征及其在不同时期不同组织中的表达规律。[方法]依据白桦45个转录组测序结果,共获得12条全长SPL基因,依次命名为白桦BpSPL1-BpSPL12,对其中11条BpSPL进行了生物信息学及基因表达特征分析。[结果]生物信息学分析发现,11条BpSPL均含有1个高度保守的SBP结构域,且基因长度差异较大,含有2 10个不等数目的外显子,系统进化分析发现11条白桦SPL分属于六大类SPL蛋白;qRT-PCR分析结果显示,白桦BpSPL基因在不同时期的叶、顶芽、茎、雄花序中表达变化显著,多数SPL基因在顶芽中7月5日和8月20日至9月20日时期表达较高,除BpSPL1基因外在雄花序从6月份到9月份的生长阶段中,SPL的表达水平呈现逐渐升高的总体趋势。[结论]BpSPL基因可能参与到了白桦顶芽和雄花序的生长发育过程。     

中间锦鸡儿CiDR1的克隆及干旱胁迫下的表达分析

[目的]研究并了解中间锦鸡儿CiDR1基因功能及其对干旱胁迫的响应,为抗性育种提供候选基因。[方法]通过RACE技术从中间锦鸡儿中克隆CiDR1基因的c DNA全长,利用生物信息学分析软件对其基因结构及功能进行分析和预测。再通过qRT-PCR技术对干旱胁迫后的幼苗中的CiDR1表达模式进行研究。[结果]从中间锦鸡儿中克隆到CiDR1基因的c DNA全长共计4 297 bp,Gen Bank登录号为KP277100。生物信息学分析表明,预测的CiDR1蛋白序列中含有1 243个氨基酸残基,具有抗病基因特征结构域TIR、NB-ARC、LRR等,其等电点为6.35,不稳定指数为42.91,不具备信号肽,为非分泌蛋白,定位于细胞质中。定量PCR检测发现,CiDR1基因在幼年期的茎中表达量较低,在成年期的叶片中表达量较高;在干旱胁迫处理后的幼苗中,CiDR1表达水平有明显下降,表明该基因的表达受干旱抑制,可能与中间锦鸡儿适应干旱相关。[结论]中间锦鸡儿在干旱胁迫后其根、茎和叶中CiDR1的表达均明显下降,表明CiDR1的表达受干旱抑制,可能与中间锦鸡儿适应干旱相关,进一步研究发现CiDR1在根、茎、叶中的表达水平可能受发育阶段调控。     

松材线虫Bxpel2基因的克隆及RNA干扰载体构建

[目的]为了构建松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)果胶酶Bxpel2基因干扰载体.[方法]通过Trizol 法提取松材线虫总RNA,反转录合成cDNA,设计带T₇启动子的果胶酶Bxpel2基因引物,以cDNA为模板扩增出果胶酶Bxpel2基因片段,连接到RNA干扰载体,再以干扰载体为模板,PCR扩增出目的片段后进行测序鉴定,合成果胶酶Bxpel2基因双链RNA(dsRNA),采用RT-PCR检测松材线虫Bxpel2基因干扰后的表达情况.[结果]表明:1)提取的松材线虫总RNA完整性好,无降解;2)成功克隆出松材线虫果胶酶Bxpel2基因片段(790 bp)并将其连接至pMD19-T载体;3)以RNA干扰载体为模板合成dsRNA,浓度分别为1.313 mg·mL^-1和1.152 mg·mL^-1;4)RT-PCR结果显示,松材线虫经过dsRNA干扰后,Bxpel2基因表达基本受到抑制.[结论]成功构建松材线虫果胶酶Bxpel2基因干扰载体,为进一步研究Bxpel2基因在松材线虫致病过程中的作用和功能奠定了良好的基础.     

白蜡虫ws基因RNAi载体构建及原核表达dsRNA

[目的]构建白蜡虫(Ericerus pela)蜡酯合酶(wax synthase,WS)基因干扰载体并建立其体外dsRNA(doublestranded RNA,dsRNA)原核表达体系,低成本大量制备白蜡虫ws基因的dsRNA。[方法]克隆白蜡虫蜡酯合酶基因ws片段,连入L4440载体,将重组质粒转入大肠杆菌HT115感受态细胞,经IPTG诱导获得与目的片段相对应的dsRNA。[结果]白蜡虫ws基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体成功构建,重组质粒转入HT115感受态细胞经IPTG诱导后菌体成功表达dsRNA,dsRNA的平均获得量1 705 ng·m L~(-1)。[结论]该研究通过原核表达白蜡虫ws基因的dsRNA,为后续利用RNAi实验研究白蜡虫ws基因功能及作用机理奠定基础。     

山鸡椒LcGPPS表达模式及其与LcGGPPS蛋白互作分析

[目的]鉴定与山鸡椒精油合成关键酶香叶基二磷酸合酶(LcGPPS)的互作蛋白,为揭示山鸡椒精油主要成分单萜物质的合成机理奠定基础。[方法]通过本地Blast搜索山鸡椒果实转录组数据库,采用RT-PCR克隆山鸡椒GPPS基因(编码异质GPPS小亚基的LcGPPS.SSU1)和山鸡椒GGPPS基因(LcGGPPS1和LcGGPPS3);利用qRTPCR分析其组织特异性表达模式,通过蛋白互作预测和酵母双杂实验验证LcGPPS.SSU1分别与LcGGPPS1和LcGGPPS3的互作关系。[结果]克隆得到LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3 3条基因序列,基因表达模式分析表明,LcGPPS.SSU1特异性地在花和果实中高水平表达;蛋白结构互作预测结果显示,LcGPPS.SSU1可以分别与LcGGPPS1和LcGGPPS3互作形成异质二聚体;经过酵母双杂交实验验证发现,仅LcGGPPS3能与LcGPPS.SSU1发生互作。[结论]LcGPPS.SSU1通过与LcGGPPS3蛋白发生互作从而在山鸡椒萜类合成途径中发挥作用,为深入研究山鸡椒萜类合成机制提供参考。     

杨树PIF基因家族成员表达模式研究

[目的]为探究光敏色素相互作用因子(PIF)基因在杨树生长发育中的功能。[方法]利用生物信息学方法预测了杨树基因组中的PIF基因家族成员并对各成员的基因结构、保守基序进行了系统分析;在此基础上,采用实时荧光定量PCR技术检测了PIF成员在不同组织及低温、干旱和Na Cl胁迫下的表达模式。[结果]表明:杨树基因组中至少含有10个Pt PIF成员,这些成员在进化上相对保守,均具有典型的b HLH结构域。基因表达分析显示:Pt PIF基因在杨树不同组织及不同非生物胁迫条件下存在明显的表达差异。[结论]杨树Pt PIF基因家族包含10个成员参与不同的生物学过程,研究结果将为深入解析杨树Pt PIF基因的功能奠定了基础。     

白蜡虫雄虫真蛹转录组分析

[目的]蛹期对于白蜡虫雄虫发育和交配具有重要意义,但目前缺乏对于白蜡虫真蛹基因转录情况的分析,本研究旨在获得白蜡虫真蛹转录组数据,了解其转录组特征。[方法]采用Illumina Hi Seq 2000进行高通量测序,并进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测3个热激蛋白基因(hsp)在不同虫态中的表达动态。[结果]共获得63 957条unigene、63 272个开放阅读框(ORF)、9 561个SSR分子标记,unigene平均长度674 bp,共有14 327条unigene获得了注释,Gene Ontology(GO)注释和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)注释分析表明,很多基因参与的功能与白蜡虫蛹期的生理特征吻合。[结论]该转录组数据为白蜡虫基因功能鉴定和蛋白组学分析研究奠定了数据基础。     

麻竹笋转录组测序及苦涩味物质合成基因差异表达分析

[目的]研究避光处理对麻竹笋苦涩味物质合成相关基因表达的影响。[方法]利用Illumina HiSeq~(TM)2500平台对自然生长(CK)和覆土处理(EP)2种类型的麻竹笋进行转录组测序,并对差异表达基因进行分析。[结果]转录组测序共获得36.45 Gb原始数据,经组装去冗余处理得到53 388个Unigene,将所得Unigene比对到Nr、Pfam、COG、Swissprot、GO和KEGG数据库中进行功能注释,发现共有31 462条Unigene与其它物种的基因具有同源性。对CK和EP处理所测得的Unigene进行表达量的比较分析,筛选出1 846个差异基因,其中,在EP处理中上调表达基因998个,下调表达基因848个。由KEGG代谢通路分析发现,差异基因显著地富集在32个代谢途径中,其中,包含与苦涩味物质合成相关的糖酵解途径、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成途径等。进一步研究发现,参与麻竹笋芳香族氨基酸、单宁合成的PFK、ENO、PPY-AT/HPP-AT、LAR等酶基因在EP处理中表达量下降,荧光定量PCR验证结果与测序结果基本一致。[结论]避光处理抑制了苯丙氨酸、酪氨酸、单宁生物合成关键酶基因的表达,可能最终影响麻竹笋苦涩味物质的合成。     

两种兰科植物CaM及CML基因家族全基因组分析

[目的]探讨Ca M和CML基因家族在兰科植物不同组织和与菌根真菌建立共生关系过程中的潜在功能。[方法]依据已发表的拟南芥Ca M和CML基因家族蛋白序列,利用生物信息学方法对小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛全基因组进行搜索,通过多种生物软件或在线工具对Ca M和CML基因家族蛋白序列进行筛选及确定、蛋白结构分析、系统进化分析及结构域预测;利用转录组数据绘制heatmap图,对小兰屿蝴蝶兰不同组织(花、叶、茎、根)及石斛种子与美胞胶膜菌共生条件下Ca M和CML基因家族的表达情况进行分析。[结果]在小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛全基因组中均预测到4个Ca M蛋白和54个CML蛋白;小兰屿蝴蝶兰Ca M及CML家族基因中39个基因没有内含子,19个基因具有内含子;铁皮石斛Ca M及CML基因家族中有41个基因没有内含子,17个基因具有内含子;系统进化分析将小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛Ca M和CML蛋白家族各分为10个亚家族;小兰屿蝴蝶兰中9个基因在叶中的表达相对于花、茎、根为上调表达,2个基因在叶中的表达相对于花、茎、根却为下调表达; 3个基因在花中的表达相对于叶、茎、根为上调表达; 3个基因在花和叶中的表达相对于茎和根为上调表达;铁皮石斛中4个基因在与美胞胶膜菌共生萌发文库中的表达相对于非共生文库为上调表达; 4个基因在共生萌发文库中的表达相对于非共生文库为下调表达。[结论]Ca M及CML家族基因在兰科植物不同组织具有重要作用,且参与铁皮石斛种子与美孢胶膜菌共生萌发的生物学调控过程。     

平榛ChWRKY28基因克隆及表达模式分析

[目的]研究平榛ChWRKY28基因序列特征及其在不同非生物胁迫下的表达规律.[方法]以平榛为试材,采用RACE-PCR方法进行基因克隆;利用实时荧光定量PCR方法检测基因在不同组织及不同非生物胁迫下的表达模式.[结果]表明:克隆得到的WRKY基因,全长1 342 bp,基因内部包含1个长963 bp的完整开放阅读框,编码320个氨基酸残基,命名为ChWRKY28.构建的系统发育树表明:该序列与拟南芥AtWRKY28及杨树PtrWRKY93的关系最近,相似性分别为49%和60%.基因表达分析表明:ChWRKY28在雄花序、雌花芽及茎中均有表达,但在茎部(皮)中的表达量高于雄花序和雌花芽中的表达量,具有组织表达特异性;低温、干旱及盐胁迫均能诱导ChWRKY28基因的表达,但受诱导程度存在差异.亚细胞定位分析结果表明:ChWRKY28蛋白分布在细胞核内,是一个核蛋白.[结论]推测ChWRKY28基因可能参与植物响应非生物胁迫的信号转导过程.     

巨桉EXP基因家族的生物信息学分析

[目的]本研究有助于了解EXP基因家族的基本特征,为深入研究其功能搭建平台。[方法]本研究对从巨桉(Eucalyptus grandis Hill)中筛选出35个EXP基因家族成员(Egr EXP1 Egr EXP35),利用生物信息学方法对其基因特征与表达模式进行综合分析。[结果]巨桉EXP基因分布在8条染色体之上,EXP蛋白均定位在细胞质膜上发挥作用,大多数的家族成员具有信号肽。巨桉EXP编码的蛋白质由α-螺旋、延伸链、无规卷曲、β-转角组成。进化分析结果表明,巨桉EXP蛋白与毛果杨(Populus trichocarpa) EXP蛋白的进化关系接近。35个巨桉EXP基因在巨桉未成熟木质部、成熟叶片、韧皮部、茎尖、木质部以及幼叶组织中表达模式存在显著差异。[结论]EXP基因家族各成员的表达模式不同,Egr EXP17、Egr EXP18可能在巨桉木材形成过程中起重要作用。