农杆菌介导转Bt基因海岛棉的获得及抗棉铃虫效果分析

本研究采用农杆菌介导法,对海岛棉胚性愈伤组织进行遗传转化。经抗性培养基筛选得到抗性胚性愈伤组织,进而嫁接得到抗性植株。通过对抗性植株进行PCR以及Southern blot检测,确定了Bt基因已经整合至抗性植株的基因组中。通过对这些转基因植株进行室内抗虫性鉴定,调查棉铃虫幼虫的死亡情况、幼虫对转基因植株叶片的取食情况以及幼虫的生长状况为指标来综合评价其抗性程度,结果表明,6棵转基因植株对棉铃虫均具有一定的抗性,5号及6号植株抗性级别达到了抗。     

转Cry1Ab-t基因玉米YA108的获得及其抗虫性鉴定

为了培育优良的抗虫玉米自交系,通过农杆菌介导的方法,将含有自主改造合成的抗虫基因Cry1Ab-t的植物表达载体pCAMBIA3300m导入玉米杂交种HiII基因组中,通过双丙氨磷筛选、PCR检测获得阳性转基因植株,采用RT-PCR、试纸条、ELISA方法检测外源基因的表达情况,并进行抗虫性鉴定.结果表明,用双丙氨磷筛选...     

CryIA(a)-pta双价抗虫基因转化粳稻及二化螟抗性评估

向作物中转多价抗虫基因是增强作物抗虫性、拓宽抗虫谱、延长抗虫时限的有效措施。从粳稻品种吉粳81、吉粳88和通887的成熟胚诱导出愈伤组织,以愈伤组织作为转化的受体,利用农杆菌介导法,转化苏云金杆菌毒蛋白基因CryIA(a)和半夏凝集素(Pinelliaternataagglutinin,PTA)基因。表达双价抗虫基因的载体p3300-bt-pta的bt和pta分别由Ubiquitin启动子和CaMV35S启动子驱动,宿主菌株为EHA105。用除草剂草丁膦(PPT)筛选得到转基因植株25株。以bt基因和pta基因两端序列为引物在一个反应体系同时做2个基因的PCR检测,检测到bt、pta基因的2条带,Bar基因的PCR检测也显阳性。转化株对PPT除草剂抗性鉴定呈抗性,证明外源基因已整合到水稻基因组中。水稻二化螟接虫鉴定结果表明,23株转基因植株抗虫性比对照明显提高,2株表现感虫。     

可去除选择标记的转Bt基因抗虫玉米研究

将组成型表达的玉米泛素启动子与苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt连接，插入根瘤农杆菌双T-DNA质粒，构建一个T-DNA结构域含有抗潮霉素选择标记基因hyg，另一个T-DNA结构域含有抗虫基因的双T-DNA单子叶植物表达载体，用以转化农杆菌菌株，再通过共培养转化玉米胚性愈伤组织。通过潮霉素培养基抗性筛选，用特异PCR扩增和Southern杂交检测，从分化再生的T0代植株中，鉴定出4个转化Bt基因的阳性植株。目前，正结合进行田间分离纯合和DNA分子鉴定，培育去除选择标记基因的转基因抗虫玉米自交系。     

GsZFP1基因植物表达载体构建及对苜蓿的遗传转化

从野生大豆中获得的具有耐旱、耐冷特性的锌指转录因子GsZFP1基因,构建到以CaMV35S为启动子、E12为增强子的植物表达载体pCEOM中,以bar基因为筛选标记基因,通过农杆菌介导法将构建的植物表达载体转化苜蓿品种农菁1号的子叶节,用含0.5mg/L草丁磷的筛选培养基进行筛选,获得了70株抗性植株,用PCR检测得到20株bar基因阳性植株,将获得的转基因植株进行GsZFP1基因的RT-PCR鉴定,获得3株RT-PCR阳性植株。结果表明,GsZFP1基因在苜蓿中得到表达。     

转Cry2A基因抗虫甘蔗植株的培育

Bt基因具有广谱杀虫性,培育转基因抗虫品种为甘蔗病虫害防治提供了新思路。为了检验Cry2A基因对甘蔗螟虫的防治效果,本研究构建了由玉米Ubi启动子驱动的Cry2A基因高效植物表达载体Cry2A-3300,利用农杆菌介导技术,对甘蔗胚性愈伤组织材料进行遗传转化,经过筛选培养及再生培养共得到46株抗性植株。对抗性植株进行PCR扩增检测,15株呈阳性;进一步利用RT-PCR,表明外源基因Cry2A在转录水平上得到有效表达。室内抗虫鉴定的结果表明Cry2A基因可有效抑制害虫的生长,这将有利于后期进行田间防治。     

耐碱GsCHX19基因的克隆及对苜蓿的遗传转化

基于实验室前期野生大豆G07256碱胁迫转录组数据,结合生物信息学方法筛选得到响应碱胁迫的cation/H+逆向转运蛋白基因Gs CHX19,克隆了Gs CHX19基因全长CDS编码序列并将其构建到p CAMBIA330035Su植物超量表达载体中。以肇东紫花苜蓿为受体材料,通过农杆菌介导法将重组的植物表达载体转化其子叶节,用含0.5mg/L草铵膦的筛选培养基进行筛选,获得20株抗性植株。采用PCR方法检测抗性植株中bar基因的表达,获得16株PCR阳性植株。对获得的PCR阳性植株进行RT-PCR及real-time PCR检测,鉴定共获得11株RT-PCR阳性植株,且证明Gs CHX19基因在各转基因植株中均有不同程度的表达。结果表明,Gs CHX19基因成功转化苜蓿,并且得到表达,该转基因植株将为耐盐碱转基因苜蓿新品种的培育提供重要的试验材料。     

豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)抗虫转基因新疆杨的获得

利用根癌农杆菌介导法将广谱抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入新疆杨(Populus a1-ba var．pyramidalis)，经筛选获得了大量转基因植株。对转基因植株经PCR鉴定、PCR-Southern和点杂交分子检测结果证实CpTI基因已整合进杨树基因组中。部分转基因植株的饲虫实验表明，饲喂转基因杨树叶片可明显抑制杨尺蠖幼虫生长发育。     

根癌农杆菌介导的橡胶树花药愈伤组织遗传转化体系的建立

为建立根癌农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系,以花药愈伤组织为受体,研究了农杆菌菌株、共培养温度、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)等因素对遗传转化效率的影响。结果表明,农杆菌菌株、共培养温度和共培养时间对转化效率具有显著影响,AS不影响转化效率。2.2万个花药愈伤组织经EHA105菌株侵染后,转入未添加AS的培养基,22℃共培养6d,通过50mgL-1卡那霉素抗性筛选、叶片GUS染色、uidA和NptII基因PCR特异扩增、PCR产物测序及NptII基因Southern检测,鉴定出11株转基因植株,并通过嫁接和次生体胚发生,获得来自8个转基因株系的681株转基因植株,移栽成活253株。     

提高农杆菌介导法将PinII抗虫基因导入滇型水稻的转化效率

本论文对滇型水稻品种玉优一号、HT-7的愈伤组织诱导、基因转化及植株再生进行了研究。通过实验，将质粒pCAMBI1300上带有的PinⅡ抗虫基因导入水稻愈伤组织细胞中，获得了一批Hyg抗性植株。185株抗性苗经过PCR检测和叶片对潮霉素的抗性试验，证明其中有59株为转基因阳性植株。结果显示，受体、农杆菌状态以及共培养方式等是影响基因转化效率的关键因素；以叶片对潮霉素的抗性作为转基因植株的快速筛选是可行的，大大提高了检测效率。     

转基因棉花抗虫基因的分子辅助选择

为提高棉花新品种选育过程中外源抗虫基因选择的准确性,以常规非转基因抗虫棉花品种、单价转基因抗虫棉品种、双价转基因抗虫棉品种为试验材料,选择能扩增Bt基因通用引物和棉花内源基因SAD1的引物,建立了抗虫基因的PCR检测方法。利用该方法对常规非转基因抗虫棉品系和转基因棉花品系进行了检测。结果表明,该方法可明确区分常规非转基因抗虫棉品系和转基因棉花品系;对高代育种品系进行检测表明40%转基因品系中存在单株不能扩增出预期的特异片段,而在非转基因系冈197中存在8.0%的单株扩增出预期的特异片段。该方法可应用于棉花新品种选育过程中对外源抗虫基因的检测,提高了选择的准确性和目的性。     

转cry1C基因抗虫超级粳稻田间目的基因表达及抗螟虫性

为了研究转基因抗虫超级粳稻田间目的基因表达及抗螟虫性,将10个来自于不同独立抗性愈伤组织的转cry1C*基因抗虫超级粳稻品系种植于田间,利用实时荧光定量PCR方法检测孕穗期叶片、茎鞘和幼穗等器官目的基因mRNA,利用酶联免疫吸附(ELISA)法检测孕穗期叶片、茎鞘和幼穗及收获后糙米的Cry1C蛋白,利用田间目测调查二化螟危害的白穗率。结果及分析显示,转基因超级粳稻不同品系及不同器官cry1C*基因田间表达量明显不同,cry1C*基因mRNA表达量叶片＞茎鞘＞幼穗,蛋白质表达量叶片＞茎鞘＞幼穗＞糙米。转基因超级粳稻田间目的基因表达,在mRNA水平和蛋白质水平,不同器官间存在正相关关系,各器官Cry1C蛋白质含量和糙米Bt蛋白质含量呈正相关。在本研究范围内,不论转基因粳稻植株Cry1C蛋白质含量高或低的品系,田间均表现为高抗二化螟。培育转基因抗虫粳稻品种时,注意对目的基因适量表达的抗虫基因型的选择。     

转双价基因棉花对根际土壤酶活性和养分含量的影响

在田间试验条件下,以3种转双价基因棉和常规棉石远321为研究对象,比较分析转双价基因棉和常规棉石远321根际土壤酶活性及养分的变化。结果表明,转双价Cry1Ac+CpTI基因棉sGK321与石远321根际土壤速效磷和铵态氮含量无显著差异,而硝态氮含量则显著高于石远321;转双价Cry1Ac+Cry2Ab基因棉(双Bt抗虫棉)速效磷和铵态氮含量均显著低于石远321,而硝态氮含量与石远321无显著差异;转双价Cry1Ac+Epsps基因棉(抗虫抗除草剂棉)速效磷和硝态氮含量均显著高于石远321,而铵态氮含量显著低于石远321。sGK321棉与石远321根际土壤脲酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶活性均无显著差异;双Bt抗虫棉土壤脲酶活性显著低于石远321,碱性磷酸酶和过氧化氢酶活性与石远321均无显著差异;抗虫抗除草剂棉与石远321土壤脲酶活性无显著差异,碱性磷酸酶活性显著高于石远321,而过氧化氢酶活性显著低于石远321。表明sGK321棉与石远321根际土壤养分(硝态氮除外)含量和酶活性无显著差异,而双Bt抗虫棉和抗虫抗除草剂棉所呈现的差异是因不同品种所致。     

转sbk和sck基因提高水稻Dular的抗虫能力

将抗病虫基因与广亲和基因聚合在一起可为两系杂交稻更广泛的应用奠定基础。本研究将去选择标记的包含2个抗虫基因(sbk和sck)的质粒载体(pCDMARUBA-Hyg)采用根癌农杆菌介导法转入兼抗水稻条纹叶枯病的广亲和水稻品种Dular中。通过常规PCR检测,获得18份不具有选择标记的转基因阳性植株,Southern杂交分析结果表明其中15份为单拷贝插入,对这15份单拷贝转基因植株进行RT-PCR分析,结果抗虫基因都能正常表达。人工接虫鉴定结果表明,转入抗虫基因显著提高了水稻品种Dular抗螟虫的能力;同时利用Dular本身的广亲和基因(S5n)标记和与抗条纹叶枯病基因(qSTV-11b和qSTV-11c)的连锁标记进行分子检测,其结果表明这15份单拷贝转基因植株都具有广亲和与抗条纹基因的特征带;与不同籼稻和粳稻配组杂种F1的结实率和条纹叶枯病在田间自然发病状况下的调查结果表明,这些单拷贝植株不但具有广亲和与抗水稻条纹叶枯病的能力,而且其抗螟虫能力显著提高。     

转新型抗草甘膦基因棉花的转化效率及相关分子特征分析

培育抗草甘膦除草剂棉花品种对棉花生产具有重要意义。利用农杆菌介导法获得了大量抗除草剂草甘膦棉花的再生植株,对其进行阳性检测。通过确定PCR检测目标条带大小、蛋白杂交条带大小分子特征,对65个独立转化事件在DNA水平、蛋白水平进行分析和筛选。结果表明,经PCR检测再生植株DNA得到的阳性率平均值为81.5%,经过蛋白检测后阳性率确定为55.4%,该类阳性植株即为外源基因正常表达的转基因植株。在此基础上,结合田间抗性检测,对其中9个株系进行了不同世代的选择,经过综合鉴定筛选,发现2个抗性优良的转基因株系具有极高的利用价值,其余还需进一步筛选鉴定。     

GUS基因和NPTⅡ基因表达的相关性及其在转基因棉花检测研究中的应用

利用农杆菌介导转化法,将含有35S启动子驱动NPTII基因和GUS基因以及棉纤维特异表达启动子E6驱动目的基因FB的植物表达载体转入到常规棉花R15中.重点分析了GUS基因和NPTII基因在愈伤诱导阶段、T0代及T1代转基因棉花中的表达情况.综合两个基因的表达来进行转基因棉花的阳性鉴定,可以为转基因棉花后代的纯合选育提供双重保障.7个转基因株系选育到T3代共获得株行51个,卡那霉素检测多数株行阳性率在90%以上,其中21个株行阳性率达100%.     

抗虫基因导入对棉花形态、产量性状及生理特性的影响

 从棉花形态性状、产量性状和生理特性三个方面较系统地研究了抗虫基因导入对棉花生长发育的影响。结果表明,转基因抗虫棉的单株结铃数、成铃率高于其受体品种;单株果枝数、单株果节数、铃重、衣分低于受体品种。还在棉花不同发育时期对其生理、生化特性进行了测定。 结果表明,在7月8日以前,转基因抗虫棉的光合强度和叶绿素含量低于其受体品种,从7月8日以后,转基因抗虫棉的光合强度和叶绿素含量高于其受体品种。研究还表明,转基因抗虫棉抗环境胁迫能力差,容易早衰。全生育期内,转基因抗虫棉MDA 含量均高于其相应的受体品种,SOD、POD 和CAT酶活性均比其受体品种低。     

Evaluation of the Low-Temperature Tolerance of Cotton Varieties in the Huang-Huai Region during Seed Germination

[Objective] To provide a theoretical foundation and germplasm resources for low-temperature-germination cotton breeding, the germination characteristics of 38 cotton varieties novel to or formerly widely planted in the Huang-Huai Region were evaluated under different low temperature stress conditions. [Method] Analysis of variance, the fuzzy membership function method, and cluster analysis were used to comprehensively evaluate the tolerance of these varieties to low temperature stress. [Result] As the temperature was lowered, germination rate, germination index, and vigor index exhibited a decreasing trend in all cotton varieties, but resistance to low temperature was significantly different among varieties. Cluster analysis divided the 38 varieties into three categories: highly resistant, resistant, and non-resistant. [Conclusion] Early-introduced varieties and those bred from early-introduced germplasm resources had weaker resistance to low temperature stress, with Stoneville and Deltapine series showing the lowest tolerance. The new transgenic insect-resistant cotton varieties SCRC 37 and SCRC 36 had the strongest resistance to low temperature stress.     

棉花抗红铃虫性对产量性状的影响研究

以不同抗性类型的陆地棉抗虫品种(系)和常规棉品种(系)作亲本配制杂交组合,将亲本和F1代杂交种共20个材料在网室、田间进行抗红铃虫鉴定和棉花抗红铃虫性对棉花产量的影响研究,试验表明,具有外源抗虫基因的抗虫棉皮棉产量高,稳产性好,尤其是抗虫杂交棉具有明显的杂种优势。相关分析结果,棉花种子虫害率与皮棉产量、子棉产量、单株成铃数和霜前花率呈极显著负相关;与衣分和僵瓣黄花率成极显著正相关;与单铃重相关性较低。结果表明,利用外源抗虫基因转导的棉花新材料作为杂交亲本,可以培育出丰产高抗棉花害虫的棉花新品种,尤其适合培育抗红铃虫的杂交棉品种。