利用RNA介导的抗病性获得高度抗马铃薯Y病毒的转基因烟草

 以马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)的RNA为模板,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,扩增出长度为801 bp的非翻译的马铃薯Y病毒外壳蛋白基因。将扩增的片段克隆到pBSK的BamHI和KpnI之间并进行了序列测定。用BamHI和KpnI从重组克隆载体上切下该基因并插入到质粒pROKII内得到植物表达载体pPVYCP。通过根癌农杆菌(LBA4404)介导的方法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选、PCR和Southern blot检测,获得82株转基因植株。Northern blot和Western blot分析表明,转基因植株只在RNA水平上得到了表达。抗病性试验表明转基因植株之间抗性水平存在着差异,其中有7株是对PVY^N高度抗病性的植株。转基因植株抗病特异性试验初步表明,对PVY^N表现高度抗病的植株对PVY^O也具有高度抗病性。     

利用RNA介导的抗病性获得抗2种病毒的转基因烟草

 RNA介导的病毒抗性(RMVR)是近年发展起来的一种新的植物抗病毒基因工程策略,具有抗病性强、抗性持久、生物安全性高等特点。利用该策略培育多抗病毒植株具有广阔的应用前景和重要的实践意义。本研究将非翻译的马铃薯X病毒的衣壳蛋白(PVX-CP)基因和非翻译的马铃薯Y病毒的衣壳蛋白(PVY-CP)基因组成嵌合基因,构建植物表达载体pROKXY,利用农杆菌介导法转化烟草NC89,获得6株对PVX和PVY的混合侵染表现为免疫的转基因植株。分子分析表明,这种抗性为RNA介导的病毒抗性。这一研究结果为利用RMVR进行植物多抗病毒育种提供了重要数据和资料。     

利用RNAi 介导的抗病性获得抗2 种花生病毒的转基因烟草

 分别以花生条纹病毒红安株系(PStV-Hongan)外壳蛋白基因(CP),花生矮化病毒轻型株系(PSV-Mi)和花生黄瓜花叶病毒(CMV-CA)复制酶基因2a为模板,通过PCR 方法分别得到PStV-CP 5′ 端,PSV-Mi 和CMV-CA 2a3′ 端150 bp 的片段,3 种片段混合物为模板经PCR 拼接得到450 bp 的片段,此拼接片段通过Gateway 系统重组至植物表达载体pK7GW1WG2,得到含反向重复拼接片段的植物表达载体pK450。冻融法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101 后,叶盘法转化本生烟(Nicotiana benthamiana),经PCR 检测,获得转基因植株。对T1 代转基因植株分别人工接种3 种病毒,66. 7% 的植株表现对PStV 免疫,9% 的植株表现对CMV-CA 的恢复抗性,全部植株对PSV 感病。siRNA 的Northern blot 结果表明,所有转基因烟草植株都含有病毒特异siRNA,siRNA 含量随接种后时间延长而衰减。     

转基因烟草中PVYN CP基因沉默及其介导的抗病性受温度的调控

 本研究以转不可翻译的马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因(PVY^N CP)烟草的T₃代植株为材料,在获得高度抗病植株并证明转基因植株的抗病性是由RNA沉默介导的基础上,采用Northern杂交及ELISA检测病毒的方法,分析了温度对转基因烟草中RNA沉默以及转基因植株抗病水平的影响。结果表明,低温可以改变转基因植株中已发生的RNA沉默和转基因植株的抗病状态。在15℃低温下生长的转基因植株,转基因产生的RNA沉默被抑制,转基因植株失去了对PVY^N高度抗病的特性,表现感病症状;而在25℃或以上高温(30℃、35℃)下生长的转基因植株,转基因产生的RNA沉默没有发生被抑制的现象,转基因植株对PVY^N病毒的侵染仍保持高度抗病性。     

基于RNA干扰原理抗病毒转基因作物的应用及安全性

基因沉默是广泛存在于各种生物中的一种古老现象,是生物抵抗外来入侵者的保护机制。RNA干扰（RNA interference,RNAi）则是近年来发现的一种重要基因沉默现象。此策略已在植物抗病毒育种等研究中应用,如对水稻、大麦、大豆、玉米、马铃薯、番茄、辣椒、木瓜、南瓜、李、烟草等的抗病毒研究。在转基因抗病毒展现出诱人的前景时,对转基因抗病毒植物释放的安全性问题的关注也越来越多。本文介绍了RNAi的作用机制,在转基因抗病毒育种中的应用,并探讨了以RNAi为基础的转基因抗病毒作物的食用安全性和环境安全性等问题。     

马铃薯Y病毒复制酶基因不同位置cDNA区段介导对PVY的不同抗性

为探究靶序列位置对RNA介导的病毒抗性产生的影响,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)复制酶基因(nuclear inclusion b,NIb)不同位置的cDNA区段,反向插入双元载体pROKII中,构建了发夹RNA(hairpin RNA,hpR-NA)结构的植物表达载体。将构建的植物表达载体采用冻融法转入农杆菌LBA4404,叶盘法转化烟草NC89,获得转基因植株。攻毒试验表明:PVYNIb基因不同位置cDNA区段介导的对PVY的抗性存在显著差异;3′端1/2处和中间位置的序列可介导高水平的病毒抗性,抗性植株的比例在50%以上,而5′端、5′端1/2处和3′端的序列介导的抗性效率较低,抗性植株的比例仅为10%~30%。Northern杂交显示:抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株,抗性与RNA积累量呈负相关;抗病转基因植株中有siRNA存在,表明病毒抗性是由RNA介导的。     

正向和反向重复RNA介导的抗马铃薯Y病毒基因工程比较研究

 RNA介导的病毒抗性与RNA沉默现象密切相关。反向重复cDNA序列(IR)的转录产物往往形成双链RNA结构,而双链RNA是诱发RNA沉默的有效因子。据此,本研究通过体外合成马铃薯Y病毒坏死株系衣壳蛋白基因(PVY^N-CP)5'端反向重复cDNA序列和正向重复cDNA序列(DR),分别构建植物表达载体pROK-IR和pROK-DR,利用农杆菌介导方法转化烟草NC89,比较这2种转基因烟草在RNA介导抗病性方面的差异。抗病性检测表明,转化IR和DR的转基因烟草均可获得抗病程度达到免疫的植株,但转化IR序列可大大提高抗病植株在转基因植株中的比例。分析结果表明所获得的抗病性为RNA介导的抗病性,是RNA沉默的结果。这一研究结果为利用IR策略进行抗病毒遗传育种提供了理论依据,并为讲一步开展RNA介导抗病性的机制研究奠宗了基础。     

马铃薯Y病毒HC-Pro、CI、NIb和CP基因介导的病毒抗性比较研究

 根据已克隆的马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)的基因组序列设计引物,利用PCR扩增HC-Pro、CI、NIb和CP4个基因的3'端400bp cDNA区段,分别反向插入含有査尔酮合成酶基因(Chalcone synthase,CHS)内含子的双元载体pRCHS中,构建了含内含子的发夹结构RNA (intron splicing hpRNA,ihpRNA)表达载体pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP。利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89,获得了多种转基因植株。病毒抗性检测的结果显示:转pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP的烟草中,抗性植株的比例分别为55.34%、73.69%、61.54%和84.21%。大分子RNA和siRNA的Northern blot分析表明,目的片段转录产物的积累量与转基因植株的抗病性呈负相关,转基因植株中可检测到siRNA,说明所获得的抗病性是RNA沉默介导的。     

hpRNA的茎环比例对RNA介导的病毒抗性产生的影响

 以马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因3'端50bp片段为hpRNA的茎,以pUC19不同长度的序列为hpRNA的环,构建了茎环比例分别为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4和1:8的植物表达载体。利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89,获得了多种转基因植株。室内抗病性检测发现:不同茎环比例的hpRNA介导的病毒抗性效率不同;茎环比例为4:1、2:1和1:1时效率较高,抗性植株的比例达60%左右;随着环长度的逐渐增加,抗性植株的比例逐渐降低;当茎环比例为1:8时,抗性植株的比例仅为9.52%。Southern blot分析结果表明:外源基因已整合于烟草的基因组中,且转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性。Northern blot分析结果表明:目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的。     

利用CRISPR/Cas13a编辑技术获得马铃薯抗PVX植株

为探究利用CRISPR/Cas13a系统获得抗马铃薯X病毒（potato virus X,PVX）马铃薯的可行性,通过设计靶向PVX中TGBp1基因的小向导RNA（small guide RNA,sgRNA）,构建CRISPR/Cas13a基因编辑载体,以马铃薯栽培种Désirée为受体材料进行稳定遗传转化,并通过机械摩擦接种法鉴定转基因植株对PVX的抗性。结果显示,成功构建了靶向PVX的PVX-Cas13a载体,并获得了表达Cas13a的转基因马铃薯植株,对其中3个高表达Cas13a的株系进行PVX抗性鉴定,发现在接种PVX 10~20 d后,转基因植株系统叶上无明显发病症状,且PVX积累量均显著低于未接种PVX对照。表明靶向PVX的CRISPR/Cas13a系统能够有效抑制该病毒的积累,这为马铃薯抗PVX育种提供了一条有效策略。     

Molecular breeding for virus resistant potato plants

To engineer resistance against potato virus X (PVX), the viral coat protein (CP) gene has been introduced into two potato cultivars. Stable expression of the gene in transgenic clones throughout the growing season has been obtained and resulted in considerably increased virus resistance. With varying frequencies depending on the original cultivar used, true-to-type PVX resistant transgenic clones have been obtained. Since deviant light sprout characteristics were invariably associated with aberrations in plant phenotype, they can be used in procedures to early screen for deviations. Furthermore, it has been possible to unequivocally discriminate between the original untransformed and independent transgenic cultivars. Although no relation has been found between the presence, if any, of the CP of potato virus Y (PVY) or potato leafroll virus (PLRV) in CP gene transgenic potato, appreciable levels of resistance to these viruses has been obtained. This suggests that the mechanism by which a viral CP gene in the potato genome evokes resistance, differs amongst various viruses.     

转二价核酶基因马铃薯及抗病性研究

 用克隆的特异性切割马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)复制酶基因负链RNA的二价核酶基因,构建植物表达载体pROKⅡ/DR,经土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导叶盘法转化马铃薯外植体,获得再生植株。PCR和Southern-blot检测,证明目的基因已成功地导入马铃薯再生植株,其转化率约为14.5%,并能够在无性繁殖后代植株中稳定存在。RT-PCR检测表明,再生马铃薯植株中的二价核酶基因可以转录表达。经病毒接种的转基因马铃薯株系L5、L7、L8和J-1的无性繁殖后代在继发感染中仍表现出较高的抗病性,为最终获得抗PLRV马铃薯新品系打下了基础。     

马铃薯4种病毒多重PCR检测体系的建立

我国马铃薯病毒主要有马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV),常发生复合侵染。根据GenBank中4种马铃薯病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长设计引物,通过RT-PCR扩增得到4种病毒CP基因全长片段,测序结果显示序列同源性96%以上;针对4种病毒CP基因的保守序列分别设计引物,在一个PCR体系中同步对4种病毒进行扩增,得到421、202、516、330bp的特异性条带,优化建立了能同步检测PVY、PVX、PVS和PLRV的多重RT-PCR检测体系。检测结果证明优化后的多重RT-PCR体系能在田间样品中快速、高效地检测出4种病毒。     

两种人工接种方法鉴定RNA干涉介导的转基因玉米对矮花叶病的抗性

本研究采用两种人工接种方法,以玉米成株期病情指数为指标,鉴定了63个转基因玉米株系的田间抗病性。结果表明,T4代转化株系‘47’和‘13h2-3’的抗病性达R抗级,超过抗病对照‘H9-21’。有82.5%(52/63)的转基因株系抗病性比未转化对照显著提高,表明用反向重复的RNA干涉表达载体转化玉米,可获得转基因抗病毒材料,且干涉片段适度延长可增加获得抗病材料的几率。另外,本文通过两种病毒接种方法的比较,发现采用玻璃纤维刷苗床穿刺接种比常规石英砂摩擦接种具有更小的误差。     

Characteristics of a resistance-breaking isolate of potato virus Y causing potato tuber necrotic ringspot disease

An Austrian isolate of potato virus Y^NTN, the causal agent of potato tuber necrotic ringspot disease (PTNRD), was serologically compared with seven Dutch PVY^N isolates. Using polyclonal and monoclonal antibodies, it was found indistinguishable from PVY^N. Determination of the nucleotide sequence of the coat protein cistron and comparison of the deduced amino acid sequence with coat protein sequences of other potyviruses revealed a high level of homology with PVY^N coat protein sequences. This confirmed the close taxonomic relationship of PVY^NTN with the PVY^N subgroup of potato virus Y. PVY^NTN is able to overcome all resistance genes known so far in commercial potato cultivars. Remarkably, transgenic PVY-protected tobacco plants are also resistant to PVY^NTN infection upon mechanical and aphid-mediated inoculation. These experiments indicate that genetically engineered resistance offers great potential in protection of potato to new aggressive strains of PVY^N.