以omp基因为靶标的3 种检测方法对 柑橘黄龙病菌检测效果比较

为了比较以omp 基因为靶标的常规PCR、LAMP 检测方法（Loop-mediated isothermal amplification）和实 时荧光定量PCR 方法在实际检测中对柑橘黄龙病的检测效果,比较了3 种检测方法对柑橘黄龙病菌omp 基因检测 的灵敏度,并运用3 种检测方法对采自广东省田间11 个本地柑橘品种上疑似感染黄龙病的多个病样进行实际检 测。结果显示院3 种检测方法的灵敏度有所不同,依次为常规PCR相似文献   

林蛙油掺假分子生物学检测方法的研究

研究林蛙油掺假LAMP(loop-mediated isothermal amplification of DNA)检测方法、试剂盒以及微流控基因芯片的制备;通过对比林蛙油的多种检测方法,得出:以分子生物学为基础的LAMP检测方法具有较高的先进性和简便性,微流控芯片多重检测具有低成本、高通量的优越性;为林蛙油分子生物学检测提供新的检测手段。     

采用环介导等温扩增技术快速检测猪丹毒丝菌病原体

[目的]建立猪丹毒丝菌(E.rhusiopathiae)毒力株的快速检测方法.[方法]利用快速灵敏的环介导等温扩增技术( Loop - mediated Isotherml amplification,LAMP)针对丹毒丝菌spa基因较为保守区域设计4条特异性LAMP引物,采用FTA(Flinders technology associates,FTA)滤膜法提取12种血清型丹毒丝菌,8种非丹毒丝菌及受感染小鼠血液的基因组DNA,分析LAMP环引物的特异性;比较LAMP与传统PCR方法的扩增敏感性和产物特异性.[结果]在61℃恒温条件下,LAMP法能够特异性扩增丹毒丝菌特异条带,与常规PCR扩增结果一致;灵敏度实验表明LAMP法检测猪丹毒丝菌的检测下限为2 CFU/mL,较传统PCR的敏感性(大于20 CFU/mL)至少高10倍.LAMP方法与PCR方法都能在小鼠感染模型血样中检测到浓度为200CFU(10-7)/mL以上浓度的丹毒丝菌.[结论]LAMP法与FTA滤膜法相结合在检测丹毒丝菌中具有潜在的应用价值.     

香蕉细菌性枯萎病菌荧光 LAMP 检测体系的建立

【目的】基于香蕉细菌性枯萎病病原(Ralstonia solanacearum)2号生理小种的特异保守引物和LAMP技术建立一种实时荧光定性检测方法,解决常规PCR定性检测特异性低、灵敏度低、耗时长等问题,实现在1 h内能进行准确高效的定性检测,为加强该病害防控检测和检疫工作提供技术支持。【方法】确定被测基因靶序列,利用Primer软件设计两对内外引物。由两对引物、具有链置换特性的DNA聚合酶、模板DNA、甜菜碱、Mg_2SO_4、反应缓冲液、荧光染料等组成LAMP反应体系,采用不必在反应完开管盖检测的实时荧光LAMP方法,针对该方法对于样品DNA定性检测的灵敏度、特异性及可重复性进行试验。【结果】设计的引物能顺利扩增目标基因,实时荧光LAMP检测体系对于香蕉细菌性枯萎病病原生理2号小种有良好的灵敏度、特异性,该方法可重复性强,灵敏度比普通PCR高10倍以上。【结论】香蕉细菌性枯萎病菌荧光LAMP检测体系检测特异性强、灵敏度高、耗时短、不易污染,效果较好。     

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒实时荧光LAMP检测方法的建立及应用

笔者研究构建了一种基于ESE-Quant tube scanner设备的新型实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)IHHNV检测方法,评价其敏感性、特异性、反应速度和实际检测结果。结果表明,IHHNV实时LAMP检测方法在63℃条件下,30 min内检测到106稀释的基因组DNA,可检测到24个质粒拷贝;与27种包括多种水生动物以及对虾常见病原DNA均无交叉反应。通过对152份实际样品的检测,实时荧光LAMP检测方法的检出阳性率为59.87%,与real-time PCR方法相当,高于其他检测方法。本研究建立的IHHNV实时LAMP检测方法对现场诊断具有较大的应用潜力。     

环介导等温扩增终端产物检测及结果判断的研究进展

摘要：环介导等温扩增（LAMP）技术在2000年被日本学者Notomi 等提出,并用琼脂糖凝胶电泳及SYBR GreenⅠ荧光定量的方法对其产物、扩增灵敏度进行了分析。为了使LAMP终产物检测更加简单、直观、省时,国内外科学家进行了大量的研究,先后提出浊度分析法、HNB指示剂、蜡丸染料等简便易操作的LAMP终产物检测及结果判断方法,目前应用较多的是琼脂糖凝胶电泳、浊度分析法、HNB指示剂法与SYBR GreenⅠ指示剂法。本文就近年来LAMP终产物检测及结果判断进行了综述,汇总了近年来LAMP终产物检测方法,以期为未来LAMP终产物检测方法的发展提供新的思路。     

贝类奥尔森派琴虫可视化LAMP检测技术的建立与应用

根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理,针对奥尔森派琴虫(Perkinsus olseni)的5.8 S核糖体RNA与内转录2间隔区序列,设计了6条特异性LAMP扩增引物,分别为两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。通过对反应条件的优化,建立了一种适用于贝类奥尔森派琴虫的可视化LAMP检测技术。该技术只对奥尔森派琴虫发生扩增反应,产生黄绿色荧光扩增产物,对其他对照DNA样品无扩增反应,不产生黄绿色荧光。对F3和B3外引物扩增产物进行测序分析,其序列与Gen-Bank中奥尔森派琴虫序列一致,检测结果具有高度特异性。对奥尔森派琴虫质粒DNA的最低检测量为100 fg。用该项LAMP技术与OIE公布的派琴虫PCR检测技术分别对50份分别来自华东及华南沿海地区的牡蛎样品进行检测,同时对PCR阳性样品进行测序分析。结果 LAMP检测到2份奥尔森派琴虫,PCR方法检测到9份派琴虫。测序分析结果表明,PCR方法检测到的9份派琴虫阳性样品中有2份为奥尔森派琴虫,其结果与LAMP检测结果相符,说明该技术适用于贝类样品奥尔森派琴虫的检测。     

LAMP技术的染料、辅助剂的研究进展

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是广泛应用于病原物检测的核酸扩增技术,主要通过反应前后染料的颜色变化来判断检测结果,具有特异性强、操作简单和高效快捷等优点。LAMP技术所用染料、辅助剂的种类多样,适用条件和用量各不相同,若不合理使用则会抑制酶活性或造成假阳性。本文重点分析了不同染料、辅助剂对LAMP试验结果的影响,并总结了试验过程中假阳性的预防措施。     

环介导等温扩增技术LAMP在植物病毒检测中的研究进展

环介导等温扩增技术（LAMP）具备特异性好、灵敏度高、方便快捷的特点,目前已经广泛用于医学诊断、食品安全检测、植物病虫害检测等基因芯片领域。为植物病毒病的早期预防提供技术支撑,介绍了LAMP技术的原理、特性、在植物病毒检测中的应用以及该技术在植物病害检测中的发展前景。     

微流控芯片技术及其在血液分析中的研究进展

微流控芯片技术是在微机电系统(micro electro-mechanical system,MEMS)基础上发展起来的新型技术平台。随着该技术的日益发展,其微型化与集成化的特点决定了它在生物医学领域中的巨大应用潜力及广阔的发展前景。文章结合微流控芯片技术研究最近涌现出的新技术、新材料及其在血液分析中的最新研究进展,总结了微流控芯片技术研究的新特点、新材料与制作方法、检测技术及其在血液分析中的应用,最后对微流控芯片的发展前景进行了展望,以加快微流控芯片技术向分子、细胞以及全血分析等研究领域的渗透。     

猪细小病毒LAMP检测方法的建立

 【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪细小病毒(PPV)环介导等温扩增(LAMP)方法,为诊断猪细小病毒提供准确可靠工具。【方法】根据GenBank公布的PPV序列,在其保守序列区域设计了多套LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程并筛选最佳引物、反应条件,建立了对PPV病毒DNA进行特异扩增的 LAMP检测方法,并可通过加入SYBR Green I肉眼判断结果。【结果】该方法在63℃恒温下作用45 min,PPV病毒DNA获得了高效率的特异性扩增;其检出限量为0.23 TCID50,敏感性高;在反应结束后加入SYBR Green I肉眼判断结果,与Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。通过对20份临床样品的LAMP检测与免疫荧光鉴定、PCR方法比对,符合率均为20/20。【结论】本研究建立的PPV LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏,操作简单、设备要求低的特点,适合用于临床PPV快速检测。     

环媒恒温核酸扩增技术及其应用

介绍了环媒恒温核酸扩增法的原理及特点,综述了近年来LAMP法在食品微生物检测的应用,对LAMP方法在食品微生物检测及其它领域中的应用前景做了展望。     

LAMP和巢式PCR检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)的比较

白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是克氏原螫虾(Procambarus clarkii)养殖生产中危害最大的病原之一,也是其他一些要经济虾类的主要病害,但是目前没有相应的有效治疗药物.为了减少WSSV对克氏原螯虾的危害,及早发现病原,以便采取相应措施将损失降到最小程度,笔者开展了以环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法检测克氏原螯虾WSSV的研究,并且与灵敏度非常高的巢式PCR检测法进行了比较.结果表明,用LAMP法可以快速、灵敏、特异性地检测克氏原螫虾WSSV,其灵敏度与巢式PCR相比,高出约500倍,且不需要专用的PCR仪,是检测WSSV的一种理想方法.该结果也为其他虾类的WSSV检测提供了重要参考.     

青稞条纹病LAMP检测体系的建立

【目的】建立青稞条纹病的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术检测体系,为青稞种子带菌检测及其条纹病的有效防控提供参考。【方法】根据麦类核腔菌（Pyrenophora graminea）的ITS-rDNA序列区间设计5组引物,从中筛选特异性引物,并通过设置60,61,62,63,64和65 ℃ 6个温度梯度来优化LAMP反应体系的温度,以建立高效检测麦类核腔菌的LAMP技术体系;分别以麦类核腔菌、大麦坚黑粉菌、裸黑粉菌、禾生指葡孢霉、细链格孢和禾谷镰孢菌基因组DNA为模板进行LAMP扩增反应,对该体系的特异性进行检测;以310,31,3.1,0.31,0.031和0.003 1 pg/μL的麦类核腔菌基因组DNA为模板,对该体系的灵敏度进行分析;最后利用该体系对肚里黄、柴青1号、1141、北青9号和昆仑15 等5个青稞主栽品种的种子带菌率进行检测。【结果】青稞条纹病LAMP检测体系的特异性引物为引物组2,最佳反应温度63 ℃,反应时间70 min;该检测体系对麦类核腔菌具有良好的特异性,其最低检测限为0.31 pg/μL;肚里黄、柴青1号、1141、北青9号和昆仑15种子的带菌率分别为68.18%,72.73%,100%,77.27%和68.18%。【结论】建立了青稞条纹病LAMP检测体系,该体系能在63 ℃、70 min内检测出青稞种子是否携带条纹病菌。     

应用PCR法和LAMP法鉴定牛早期胚胎性别的研究

通过设计特异性引物，优化Mg^2＋浓度、退火温度和循环时间等影响PCR的因素，确定了适合现场应用的PCR反应体系；46枚胚胎现场的鉴定率为87％，移植妊娠率为28％，准确率为85％，证明建立的PCR胚胎性别鉴定方法可用于生产。使用LAMP法对126枚常规胚胎和42枚性控胚胎现场鉴定，鉴定率95％，移植妊娠率33％，准确率88％，结果证明该方法可应用于牛早期胚胎性别鉴定。PCR法和LAMP法所鉴定同一样品的结果一致，说明在控制好实验条件的情况下，根据实际情况可选用这两种方法中的任何一种进行性别鉴定应用。     

转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用

 【目的】建立转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法。【方法】以转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV35S）为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）,针对CaMV35S基因的6个区域设计4种特异引物,利用1种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃保温1 h,通过荧光显色即可完成对转基因作物鉴定工作。同时对7种转基因作物进行LAMP检测。【结果】该LAMP方法通过特异性检测含有CaMV35S启动子的转基因作物,其检测结果的特异性与常规PCR方法结果一致,灵敏度是常规PCR的10倍。【结论】转基因作物LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合转基因作物的快速检测,有较好的应用价值。     

牙鲆弹状病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用

建立了牙鲆弹状病毒的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,首先根据牙鲆弹状病毒的糖蛋白的基因保守序列,利用Primer Explorer V3软件设计了6条引物,并对LAMP反应温度和反应时间等条件进行了优化。该方法的检测限为30fgRNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与鲤春血症病毒、传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、海洋双RNA病毒、病毒性出血败血症病毒以及病毒性神经坏死病毒等没有交叉反应。该方法检测时间短,在1h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明40尾石鲽鱼样品中有3尾感染HRV,与病毒分离结果一致,说明LAMP方法比较适合牙鲆弹状病毒的早期及现场诊断。     

可视化LAMP快速检测猪伪狂犬病毒

为快速检测猪伪狂犬病毒(PRV),利用PRV DBP基因上的一段序列设计并合成3对LAMP引物,采用一种新的荧光染料——罗丹明B衍生物作指示剂,该指示剂在反应前加到反应缓冲液里,通过优化反应条件,建立了可视化LAMP快速检测PRV的方法。结果表明,63℃下恒温反应40min可得到肉眼可视结果,颜色变成蓝色判定为阳性,仍然保持紫色判定为阴性,可视化LAMP结果与电泳结果一致。建立的可视化LAMP方法可以快速、直观、准确地检测PRV。     

环介导恒温扩增技术在植物病原物检测中的应用

环介导恒温扩增反应（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是一种新型的核酸扩增方法,具有特异性强、灵敏度高、操作简单且适合于多种检测环境等优点,自开发以来,其作为一种分子生物学检测技术,被广泛应用于许多领域。简要介绍了该技术的原理,综述了其在植物病原物检测方面的应用,讨论了其在应用中出现的问题,并针对这些问题提出了相应的解决办法,最后展望了其应用前景。     

林麝源化脓隐秘杆菌LAMP快速检测方法的建立

根据GenBank已公布的化脓隐秘杆菌溶血素((Pyolysin,PLO)基因设计6条引物,建立一种灵敏的环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)用于化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)的快速检测,并对检测方法的特异性和灵敏度进行验证。对化脓隐秘杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、非O1霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单孢菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌等9株实验菌株进行的特异性试验表明,建立的LAMP方法仅对化脓隐秘杆菌的检测结果为阳性;该方法的检测灵敏度在DNA水平上可达112 fg。采用本研究建立的方法检测20份林麝临床病例样品,共鉴定出10株化脓隐秘杆菌,与API Coryne生化鉴定方法的符合率为100%。