3种试剂盒对烟丝DNA提取及其微生物群落多样性分析效果的比较

筛选能高效提取烟丝DNA,并能获取其微生物群落多样性较高的试剂盒。选择3种不同的试剂盒提取烟丝DNA,比较DNA的纯度和浓度,并将提取的DNA进行原核生物16S rRNA基因V3～V4区和真菌ITS2区的PCR扩增及高通量扩增子测序,进而比较烟丝样品微生物群落多样性和结构差异。结果表明:(1)DNeasy?PowerPlant?Pro Kit植物基因组提取试剂盒(P)提取的烟丝DNA浓度为(103.67±1.7) ng/μL,显著高于其他试剂盒(P0.01),且3种试剂盒提取的DNA纯度均达到合格水平。(2)3种试剂盒提取的DNA样本均能反映样本中原核生物群落多样性与结构,从门分类水平看,试剂盒P检测到11个门类,E.Z.N.A.TMHP Plant DNA Kit植物基因组提取试剂盒(M)检测到8个门类,DNeasy?PowerSoil?Kit土壤基因组提取试剂盒(S)检测到5个门类;从属分类水平看,试剂盒P检测到83个属,试剂盒S检测到71个属,试剂盒M检测到69个属。(3)3种试剂盒均能检测到Unclassified类群、子囊菌门Ascomycota、接合菌门Zygomycota和Others等4个真菌门类,但试剂盒P检测到的类群比例最高;在属分类水平上,试剂盒P检测出30个属,试剂盒S检测出20个属,试剂盒M检测出11个属。DNeasy?PowerPlant?Pro Kit植物基因组提取试剂盒(P)能有效提取烟丝及其所含微生物的总DNA,并能检测出更高的烟丝微生物群落多样性,推荐该试剂盒用于烟丝样品中微生物群落多样性与结构的分析。     

基于高通量测序的不同轮作方式下烟田土壤细菌群落组成分析

在自然界中,土壤微生物与植物之间存在着密切的联系,土壤微生物依赖植物提供的养分而生存,同时对植物的生长发育起着促进作用。本研究利用Illumina Hi Seq高通量测序技术,提取西双版纳烟田烟草连作、田菁轮作和青蒿轮作3种种植模式下土壤样品的总DNA,通过PCR方法扩增构建16S r RNA基因文库。结合生物信息学方法分析土壤细菌16S r RNA基因V3~V4区的多样性指数、群落结构等,以确定烟田更好的种植模式。所有样本共测序分析获得4 898个细菌分类单元OTU,经琢多样性和茁多样性分析表明3个处理下细菌群落多样性存在显著差异,并且在对照组中的细菌群落丰富度最高,青蒿轮作中的细菌群落丰富度最低。样本中优势门类为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和绿弯菌门(Chloroflexi),其中变形菌门(Proteobacteria)相对丰度33.49%占绝对优势。优势属类为硝化螺旋菌属、Kaistobacter、红游动菌属和黄杆菌属,可促进氮素转化的硝化螺旋菌属在田菁中的相对丰度最高,烟株青枯病致病菌罗尔斯通菌属在青蒿轮作中相对丰度最低;拮抗黑胫病的假单胞杆菌属在青蒿轮作中相对丰度最高。本研究将对烟草轮作方式和轮作作物的选择提供分子层面的支持。     

普洱茶发酵样品细菌和真菌DNA同时提取方法研究

本研究的目的是建立提取普洱茶发酵样品中微生物DNA的方法。首先比较了3种发酵样品中菌体收集方法,其次改进了omega小量植物DNA提取试剂盒的提取方法,以DNA的纯度、提取率和细菌16S rDNA、真菌?-微管蛋白基因PCR扩增为指标,评价提取DNA质量。实验发现茶样（5 g）加Tween-NaCl缓冲液（50 mL）,静置30 min,超声波振荡10 min,离心（10 min,12000 r/min）的菌体收集方法和在omega小量植物DNA提取试剂盒中引入液氮研磨、溶菌酶和破壁酶联合裂解细胞的方法提取的DNA纯度好,可以分别扩增出细菌16SrDNA和真菌?-微管蛋白基因。建立了普洱茶发酵样品细菌和真菌DNA同时提取方法,为开展普洱茶固态发酵过程微生物多样性的分子生物学研究奠定了基础。     

不同强化处理措施对铜污染土壤微生物多样性的影响

通过探究不同强化处理措施对铜污染土壤微生物多样性的影响,以期为解释土壤微生物影响植物吸收累积重金属的机理以及提高植物-微生物联合修复重金属污染效率提供了基础数据和参考。研究采用田间小区试验,基于高通量测序技术对不同强化处理措施下的土壤微生物进行16SrDNA测序,揭示其微生物群落组成和差异。结果表明：5种处理下微生物群落共覆盖42个门,145个纲,359个目,562个科,1060个属,2290个种。在门水平上,不同处理土壤微生物群落组成较为相似,优势物种相同,丰度较大的门类为酸杆菌门、变形菌门、放线菌门、绿弯菌门和厚壁菌门。在OTU水平上,不同处理土壤微生物群落组成具有显著差异,对微生物群落影响排序为：铜胁迫>螯合剂>有机物覆盖;不同处理出现了特异物种,空白对照和其他处理差异性最大,铜胁迫处理和有机物覆盖处理土壤微生物群落组成最为相近。铜胁迫均增加了土壤微生物群落的丰富度;螯合剂处理下土壤微生物群落的多样性和丰富度均最大,且群落多样性和有机物覆盖处理的差异达到了显著水平。     

干旱条件下棉花根际真菌多样性分析

植物根际微生物群落对植物生长和适逆性至关重要,本研究对干旱条件下棉花根际真菌群落进行分析,旨在探明干旱胁迫对棉花根际真菌多样性和群落结构的影响,为利用有益微生物提高棉花水分利用率提供理论依据。以陆地棉Jin 668 (Gossypium hirsutum cv. Jin668)为试验材料,采用盆栽控水方式,对处于开花期的棉花根际土壤(SDP)和未种植棉花土壤(SOPD)进行干旱处理,正常浇水的棉花根际土壤(SPN)和无棉花土壤(SNPN)为对照。从中采集土壤样品,提取DNA,采用IlluminaMiseq对真菌ITS1区域进行高通量测序,研究土壤中真菌多样性。结果共鉴定到970个OTUs,SNPN、SOPD、SPN和SDP样品中真菌OTUs数量分别为481、528、743和752个,其中288个OTUs为所有组共有。对获得OTUs进行门、纲、目、科和属5个分类水平的划分表明,棉花根际真菌群落结构主要由子囊菌门(82.70%)和担子菌门(10.15%)组成;干旱处理使粪壳菌纲(Sordariomycetes)、粪壳菌目(Sordariales)和毛壳菌科(Chaetomiaceae)丰度显著降低,而散囊菌目(Eurotiales)、发菌科(Trichocomaceae)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillum)的丰度显著增加。多样性分析结果显示,与未种棉花的土壤相比,有棉花的土壤中真菌群落的α多样性显著增加;同时, SPN和SDP之间的真菌群落结构更相似,而与SNPN和SOPD间差异较大。研究表明,棉花根际存在丰富的真菌群落,干旱对土壤中真菌的丰度和多样性有显著影响。本研究从微生物的角度为提高棉花耐旱性的研究提供新见解。     

基于高通量测序技术研究栽培苍术根际土壤微生物变化

苍术为多年生草本植物,传统的种植方式是连续多年在同一地块种植,这往往导致其生长发育受阻和土传病害的发生,根际微生物被认为是植物的第二基因组,对植物的生长发育具有重要作用。为分析栽培苍术对根际土壤微生物的影响,探讨苍术病害发生与微生物变化间的关系,以陕西省柞水县下梁镇种植过3年苍术的根际土壤,以及从未种植过苍术地块的土壤为试验材料,利用高通量测序方法对微生物群落进行扩增子测序分析。结果表明,栽培3年后,苍术根际土壤细菌和真菌结构发生变化,细菌群落多样性和丰富度下降,真菌群落多样性下降、丰富度上升,变形菌门、放线菌门和酸杆菌门是细菌中的优势菌群,子囊菌门、被孢霉门、担子菌门是真菌中的优势菌群。栽培3年后,苍术的根际土壤微生物呈有益菌下降、病害菌增加的趋势。     

内蒙古贝加尔针茅草原细菌多样性的PCR-DGGE分析

用Bourrain法、LaMontagne法、Zhou法、BBI.公司的试剂盒4种方法,比较研究了不同方法对内蒙古贝加尔针茅草原土壤基因组DNA的提取效果以及对后续分析的影响。用PCR-DGGE技术对贝加尔针茅草原土壤细菌群落结构进行分析,并对主要条带进行测序。结果表明:试剂盒法提取的DNA效果最好;贝加尔针茅草原土壤细菌主要由6个分支组成:变形菌门(Proteobacteria)中的α、δ、γ三个类群,放线菌门(Actinobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes),芽单胞菌门(Gemmatimonadetes),酸杆菌门(Acidobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。     

不同施肥方式对烤烟土壤群落多样性的影响

通过研究不同施肥处理对云南大理植烟土壤群落的影响,为生物有机肥的合理配施及改善土壤提供依据。采用Illumina Miseq高通量测序技术,对不同有机肥配施(祥云管盛有机肥,弥渡国发有机肥、福建三炬提供的固体微生物菌肥(耕多邦)以及福建三炬提供的液体微生物菌肥(耕多邦))下的大理烟区植烟土壤菌相分析。研究得出,植烟植株土壤中微生物多样性丰富,包括42个门、93个纲、307个目、386个科、804个属;其中子囊菌门、担子菌门、接合菌门、壶菌门、球菌门、罗氏菌门、乳杆菌门是土壤样品中物种丰度较高的7个门类。与常规对照组相比,施加微生物菌肥可明显增加植烟根际土壤微生物群落结构多样性,其中施加液体为生物菌肥土壤样本微生物多样性指数Chao指数最高,Simpson指数最小,表明施用液体微生物菌肥土壤样本微生物群落多样性最高。物种丰度Heatmap表明,与对照相比,施肥处理的土壤微生物组成明显增加,且随着移栽时间的增加施肥处理的群落丰富度也逐渐上升。不同施肥处理间的微生物结构聚类具体表现为施肥处理间的结构聚类较紧密,而对照较为分散,说明施加生物有机肥可以改变土壤微生物结构,且子囊菌门为连作土壤优势...     

甘草附生细菌多样性和群落结构组成

为了解甘草不同部位的细菌多样性和群落结构组成,应用高通量测序技术对其叶际、茎部和根际细菌的16S rDNA进行测序,分析细菌多样性和群落结构组成。结果表明,从特征值分布上看,3个部位共有特征值数量为102个,根际、叶际、茎部独有特征值数量分别为4 801、818、432个。根际的多样性和丰富度明显高于叶际和茎部,茎部和叶际的群落结构相似性更高。在门水平上,变形菌门是各部位的优势细菌门,相对丰度表现为茎部叶际根际。在属水平上,茎部和叶际最丰富的菌属是泛菌属,假单胞菌属次之,根际优势菌属种类多,但多未准确分类。     

3种制备猪肺炎支原体DNA模板方法的探讨

为了筛选出一种快速、高效、廉价提取猪肺炎支原体模板DNA的方法,本研究分别对试剂盒法、双蒸水煮法、酚-氯仿法进行比较,从中选出最佳提取方法。结果显示：这3种方法均适合由菌液中提取基因组DNA;水煮法不能由组织中提取出基因组DNA,试剂盒法可由组织中提取出基因组DNA且得到的目的DNA较纯,但每次提取量少;酚-氯仿法能大批量提取组织基因组DNA,但操作繁琐,易污染且稍有杂带。针对不同的模板,选择合适的DNA制备方法,有利于做出准确检测、提高检测效率,为疾病的早期诊断提供保障。     

间作韭菜模式下番木瓜根区微生物群落变化特征

利用韭菜生境能释放挥发性物质,抑制根区病原真菌作用效果,研究间作韭菜模式下番木瓜根区微生物群落变化特征。在不同的间作时间提取土壤微生物DNA,应用Illumina Miseq高通量测序技术分析根区土壤微生物多样性。结果表明：（1）根区土壤细菌归属于27门64纲146目272科437属,酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、变形菌门(Proteobacteria)为优势菌,分别占比18.15%、22.33%、19.11%和25.53%,占全部细菌组成的85.12%;其中随着间作韭菜时间的推移,变形菌门(Proteobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)的优势表现明显。（2）根区土壤真菌归属于7门24纲64目126科239属,子囊菌门(Ascomycota)、接合菌门(Zygomycota)和担子菌门(Basidiomycota)为优势菌,所占比例分别为93.71%、3.94%和1.18%,占全部细菌组成的98.83%,其中子囊菌门占主导地位。（3）在细菌属水平,间作韭菜30、60、120天...     

鹿茸基因组DNA提取方法的比较研究

本研究旨在建立一种稳定、高效的鹿茸药材DNA提取方法,以满足后续的鹿茸DNA条形码鉴定方法需求。采用2种试剂盒、改良的CTAB法以及SDS法对市场上5个厂家共8批次的鹿茸药材进行基因组DNA的提取,参考2015版《中华人民共和国药典》四部通则9107考察了样品量、水浴温度、水浴时间3个因素。实验结果表明4种方法均可以从鹿茸药材中提取出基因组DNA,其中天根试剂盒提取效果最佳,改良的CTAB法提取效果较差;通过方法学考察得出使用天根试剂盒,提取条件为样品量70 mg、水浴温度56℃,水浴时间6 h时提取效果最佳。本研究优化得到的天根试剂盒提取鹿茸DNA方法操作简便,提取DNA浓度、质量优良,能够用于后续的DNA条形码鉴定中。     

非培养方法解析烟草根部内生细菌的群落结构

为了解烟草根部内生细菌多样性,采用改进的CTAB法提取烟草根部总DNA,利用细菌16 S rDNA基因通用引物对烟草根总DNA进行16 S rDNA扩增,构建烟草根部内生细菌16 S rDNA克隆文库;挑取具有不同酶切谱型的克隆进行测序、比对并构建16 S rDNA基因系统发育树。构建的烟草根部内生细菌16 S rDNA克隆文库中,155个克隆分属于36个不同的分类单元,Blast结果表明,大部分克隆与已知细菌的16 S rDNA序列相似性较高,分别属于变形菌门(Proteobacteria)的Alpha、Gamma、Beta亚群,放线菌门(Actinobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes),厚壁菌门(Fir-micutes)中的肠杆菌属(Enterobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、寡养食单胞菌属(Stenotrophomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylobacillus)、食酸菌属(Acidovorax)、芽孢杆菌属(Bacillus)等16个属,其中13.5%的克隆序列与非可培养细菌(Uncultured bacteria)的相似性在93%～99%之间,假单胞菌属细菌是烟草根部内生细菌的优势种群。这些研究结果说明烟草根部存在较为丰富的内生细菌系统发育多样性,并且潜藏着未知的内生细菌资源。     

棉隆土壤消毒对高山甘蓝根肿病土壤细菌群落结构的影响

本研究旨在科学评价棉隆土壤消毒对高山根肿病土壤细菌群落结构的影响,为土壤消毒防治根肿病提供理论依据。利用细菌16S核糖体基因高通量测序技术,研究棉隆土壤消毒对高山甘蓝根肿病土壤细菌群落的影响。高通量测序共得到9445细菌分类单元(operational taxonomic units,OTUs),其中2327细菌OTUs(24.64%)为3个处理共有。棉隆处理土壤细菌群落结构在门和属水平与对照较为类似,但部分分类单元的丰度发生较大改变。棉隆处理土壤4种细菌α多样性指数均与对照无显著性差异(P>0.05)。β多样性指数分析显示,棉隆与氟啶胺处理的距离较为接近,而与对照较远。Metastats分析显示,同对照比较,棉隆处理有1个门和24个属的细菌的丰度发生显著性改变,其中土壤有益菌的丰度显著增加,而氟啶胺处理有4个门和16个属的细菌丰度检测到显著性改变。以上结果说明,棉隆处理对高山土壤细菌多样性无显著影响,对细菌群落结构的影响小于氟啶胺处理,且有利于土壤细菌群落结构的恢复和重建。     

健康与根结线虫病烟田根际土壤微生物群落对比分析

为了研究烟草根结线虫病与根际土壤微生物群落的关系,通过高通量测序研究了健康烟田和根结线虫病发病烟田根际土壤的微生物多样性、组成结构和功能变化。结果表明：健康烟田根际土壤微生物群落的Alpha多样性与发病烟田差异不显著,Beta多样性分析表明健康烟田样本与发病烟田样本分布基本一致。健康烟田与根结线虫发病烟田根际土壤细菌与真菌微生物群落在门水平上组成相似,但物种丰度存在差异,酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、担子菌门(Basidiomycota)和壶菌门(Chytridiomycota)在健康烟田中占优势,而变形菌门(Proteobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、子囊菌门(Ascomycoda)、球囊菌门(Mortierellomycota)在发病烟田中占优势。在属水平上,根际土壤细菌与真菌微生物群落组成也基本一致,但健康烟田与根结线虫发病烟田微生物物种丰度存在显著差异,Cylidrocapon、镰刀菌属(Fusarium)等致病菌在发病烟田中占显著优势。种水平上,健康烟田中的Actinoallomurus spadix和分枝节杆菌(Arhrobacter ramosus)与发病烟田组存在显著差异。通过根际土壤微生物功能预测分析发现,发病和健康烟田土壤真菌、细菌功能组成相似,但发病烟田样本功能丰度大于健康烟田。因此,烟草根结线虫病的发生与根际土壤微生物群落的组成和多样性无直接关系,而是可能与物种丰度及样本功能丰度密切相关。研究结果可为通过调控根际微生物群落结构来防治烟草根结线虫病提供理论依据。     

草木灰对烤烟根际土壤微生物群落结构及代谢功能多样性的影响

施用草木灰旨在改善土壤微生物群落结构，减少由土壤自身衰退而引发的土传病害，更好的维持土壤生态系统的平衡。通过田间小区试验，采用平板培养法和BIOLOG技术研究施用草木灰对烤烟根际土壤微生物数量和功能多样性的影响。研究结果表明：施用草木灰显著增加了烤烟根际细菌、放线菌和微生物总量(P＜0.05)，真菌数量虽略有降低但差异并不明显；移栽后35、55、75天的3个时间段均有一致规律。同时，上述3个时间段烤烟根际微生物群落碳源利用率(AWCD)和对6类碳源的利用程度也以施用草木灰处理显著高于对照。施用草木灰后，烟株各时期根际土壤微生物群落Shannon 指数(H)、Simpson指数(D)、均匀度指数(E)、丰富度指数(S)(P＜0.05)均有所提高，其中移栽后35天时差异显著。根际微生物群落的PCA分析表明，增施草木灰处理和对照在主成分坐标体系中差异十分明显，草木灰处理集中在第1主成分正方向，而未施用的对照则集中在第1主成分负方向，表明土壤微生物功能多样性差异显著。上述说明增施草木灰在改善烟株根际土壤微生物群落结构及功能多样性方面有明显效果。     

石油污染土壤总DNA的提取

寻找一种可获得高浓度、大片段的石油污染土壤微生物总DNA的提取方法。分别采用SDS的细胞裂解法、溶菌酶和SDS裂解法、实验室改进法、试剂盒法提取石油污染土壤总DNA。研究结果表明4种方法都可获得石油污染土壤微生物总DNA,但每种方法在提取量和纯度上有一定差异;实验室改进法提取的DNA产率是最高的,试剂盒法提取DNA纯度最高。实验室改进法获得的微生物总DNA,稀释20倍可直接用于PCR扩增。土壤样品经过一定的预处理后提取的DNA片段大小在23100 bp,实验室改进法提取土壤微生物总DNA产率、纯度较好,不经过纯化可直接用于PCR扩增及其他分子生物学实验的操作。     

基于PCR-DGGE四川中江丹参轮作期间土壤真菌遗传多样性变化特征研究

研究四川中江丹参轮作期间土壤真菌遗传多样性变化特征。采用分离提取土壤微生物DNA,PCR特异扩增,以DGGE分离扩增片段,并测序,在GENBANK中查得菌种。中江丹参轮作期间,土壤真菌群落包括：Termitaria sp. YAKU2,Agaricus bisporus,cercozoan,Cordyceps,Geomyces destructans,Geomyces sp. P7,Cordyceps brongniartii,Penicillium sp. KCTC6774,Uncultured Iodophanus clone S-54。聚类分析表明,休地1年与正茬丹参的土壤真菌群落结构相似,而与休地3、4年的土壤真群落有明显差异;休地2年是属于过度状态。中江丹参轮作期间,土壤真菌群落遗传多样性结构逐渐恢复;而且休地的第2年是土壤真菌群落结构恢复的关键时期,与我们前期报告结论一致。