大菱鲆内脏结节病病原的分离与鉴定

2017年8月,天津市滨海新区某养殖场大菱鲆(Scophthalmus maximus)发生病害,累计死亡率约为25%,患病鱼体表无明显症状。通过肉眼和病理组织切片观察发现,患病鱼肾脏、脾脏、肝脏和肠道存在大量圆形结节,肾脏、肝脏和脾脏组织病变明显,肾小管坏死,肝细胞脂肪变性,脾脏中存在大量的坏死细胞。此外,在脾脏和肾脏组织中发现大量的抗酸杆菌。利用传统病原菌分离方法,从具有典型症状的濒死大菱鲆肾脏组织分离到优势菌株myco-10,利用该菌株注射攻毒能导致健康大菱鲆66.7%的死亡率,且表现出与自然发病鱼相同的症状。采用16S rDNA、Hsp65、ropB基因序列分析,构建系统发育树并结合细菌形态特征、生理生化测试对菌株myco-10进行鉴定,结果显示,菌株myco-10的16SrDNA、Hsp65、ropB基因序列与分枝杆菌属细菌(Mycobacteriumspp.)相似度最高,且在系统发育树中与海分枝杆菌(Mycobacteriummarinum)和溃疡分枝杆菌(Mycobacteriumulcerans)聚为一簇,生理生化反应与海分枝杆菌一致。综合生理生化特征和基因序列分析结果,将菌株myco-10鉴定为海分枝杆菌。这是中国首例分枝杆菌引起大菱鲆病害的报道,可为大菱鲆内脏结节病的防治提供参考资料。     

养殖大菱鲆肠道中大菱鲆弧菌的分离鉴定及药敏试验

2014年11月,大连地区某大菱鲆养殖场发生病害并伴有死亡,主要症状为吻部下颌明显出血,腹腔积水,肝脏充血,肠道出血有白便。从患病大菱鲆肠道中分离出1株可在硫代硫酸盐—柠檬酸盐—胆盐—蔗糖琼脂培养基上生长的菌株HZ-C1,人工回接感染试验证明其对健康大菱鲆具有较强致病性。通过形态学观察、16SrDNA序列同源性分析及生理生化试验确定菌株HZ-C1为大菱鲆弧菌。药敏检测结果显示,大菱鲆弧菌HZ-C1对氯霉素、丁胺卡那及头孢曲松等11种抗生素敏感,但对青霉素、四环素及诺氟沙星等15种抗生素耐药。本研究为大连地区养殖大菱鲆细菌性病害防治提供了一定病原学依据。     

养殖大菱鲆出血病病原菌的分子生物学鉴定

对青岛某养殖场发病大菱鲆分离的5株病原菌进行鉴定。使用法国生物梅里埃公司的全自动微生物鉴定仪VITEK2Compact的革兰氏阴性菌鉴定卡(GNtest kit),结合生物梅里埃公司的API细菌鉴定系统API 20E进行生理生化反应测试。为了进一步确定5株菌的分类学地位,测定了16SrDNA基因序列,与相关细菌序列进行比对,构建了系统进化树。生化反应和16S rDNA基因序列表明其中4株菌与溶藻弧菌亲缘关系最近,人工感染试验表明溶藻弧菌对养殖大菱鲆的致病力是相当强的。     

养殖大菱鲆腹水症病原菌SR1的分离及鉴定

从患腹水症的养殖大菱鲆（Scophthalmus maximus）腹水分离到1株优势细菌SR1，人工感染实验证实其具有致病性。经API ID32E系统鉴定为溶藻弧菌（Viibrio alginolyticus），并测定了其16S rRNA基因序列和热激蛋白HSP60（Heat shock protein，HSP）基因序列。基于16S rRNA基因序列构建的系统树结果表明，菌株SR1与溶藻弧菌（AY967727）亲缘关系最近，然而置信度较低，仅有27％，不能有效地鉴定到种。HSP60基因序列分析表明，该菌株与溶藻弧菌（AF230931）同源性最高，为99．2％。系统发育树表明SR1确与溶藻弧菌（AF230931）聚为一个分支，且置信度较高，为84％。综合上述结果，菌株SR1可鉴定为溶藻弧菌。[中国水产科学，2006，13（4）：603—609]     

大菱鲆红嘴病的病原分离鉴定与系统发育分析

从患"红嘴病"的大菱鲆(Scophthalmusmaximus)肝脏和眼睛内分离到20080602DW1和20080602DY1两株优势菌.人工感染实验证实这两株菌对大菱鲆幼鱼有较强的治病性,将0080602DW1和20080602DY1按0.1 mL/尾的剂量腹腔和肌肉注射,皆可引起感染鱼100％的死亡,症状与自然发...     

养殖大菱鲆病原菌迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其疫苗研制

2006年9月山东胶南某养殖场大菱鲆(Scophthalmus maximus)发生病害,从患病大菱鲆脾脏分离出优势菌株WY28,人工感染试验证实WY28菌株对大菱鲆和斑马鱼(Danio rerio)有较强的致病性,其对大菱鲆和斑马鱼的半数致死剂量(LD50)分别为39cfu/g(Bw)(3.3×102cfu/ind)和2.1×104cfu/g(Bw)(6.4×103cfu/ind).综合该菌在形态与生理生化特征及16S rDNA同源性等方面的实验结果,确定WY28菌株为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda).该菌对先锋霉素V、庆大霉素、氟哌酸、痢特灵等抗生素敏感.WY28菌株经福尔马林灭活制成灭活疫苗,对大菱鲆进行腹腔注射免疫,免疫后第4周测得免疫鱼血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体效价平均为1:1 280.免疫后第6周.免疫鱼血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体效价达到更高水平(平均值为1:3 289.6).攻毒试验表明,受免鱼的相对存活率明显高于对照组.由此可见,利用从病鱼体内分离的迟缓爱德华氏菌菌株制备的灭活疫苗能使大菱鲆较有效抵御迟缓爱德华氏菌强毒株的攻击.     

大菱鲆鱼苗腹水病病原菌药敏试验

2005年10～11月,利用发病的大菱鲆鱼苗,用TCBS培养基进行细菌培养,细菌菌落为黄绿色,可判定其病原菌为弧菌属的一种。取优势种继续纯化培养,再用纸药片进行药敏试验。药敏试验结果表明,氯霉素、先锋霉素、头孢唑啉、庆大霉素、利福平、强力霉素、万古霉素7种抗生素对该病原菌有明显的抑制作用。     

大菱鲆纤毛虫病的防治方法

我们通过近两年对大菱鲆纤毛虫病100多例的研究与治疗发现纤毛虫病并不可怕，主要是解决好纤毛虫病的发病机理、预防方法和治疗方法。一般的纤毛虫病可以有效地治疗，发病初期一般可以控制。     

养殖大菱鲆中牙鲆肠弧菌的分离鉴定及组织病理学

2007年1月,山东省胶南某养殖场人工养殖的大菱鲆（Scophthalmus maximus）发生严重病害并大批死亡。病鱼的主要症状是体表溃疡,腹腔积液,肠道肿胀,肝脏萎缩,胆囊暗绿色等。从病鱼胆囊中分离纯化得到优势菌株,命名为da3。人工感染试验证实,该菌株对大菱鲆有较强的致病性。对体重为25 g的大菱鲆的半数致死量为每尾鱼2×106 cfu。通过细菌16S rDNA序列测定及形态学和生理生化特征研究确定,该病原菌为牙鲆肠弧菌（Vibrio ichthyoenteri）。组织病理学观察表明,病鱼的肝脏、肾脏、脾脏、肠道和脑的微观结构发生了明显的病理变化,由此引起的器官功能衰竭可能是病鱼死亡的主要原因。本文结果对大菱鲆细菌性病害的控制具有参考价值。     

几种大菱鲆疾病的防治

1.滑走细菌病 症状:各鳍糜烂缺损,游泳缓慢,食欲下降,在每年的5～8月,仔鱼易染此病。治疗方法:（1）加大换水量。（2）用尼富酸钠10g/m3水体 土霉素10g/m3水体。     

副溶血弧菌对养殖大菱鲆致病性研究

从患出血症的大菱鲆体内分离到5株菌,编号为L-0603314、L-0603442、L-0603431、L-0603121、L-0603241。采用肌肉注射的方法进行人工感染,每尾注射0.05 ml,菌浓度为108cfu/ml和109cfu/ml;采用K-B法用青霉素、环丙沙星、四环素、呋喃妥因、红霉素、庆大霉素、链霉素7种药敏纸片对确定病原性的菌株进行抗生素敏感试验,同时进行生理生化特性研究。结果显示,L-0603121菌株为3.0×108cell/ml时只引起个别试验个体轻微症状,1.0×109cell/ml可造成100%感染率,40%死亡率,可确定L-0603121菌株为引起大菱鲆出血症的致病菌株。药敏试验表明,L-0603121株菌对庆大霉素、红霉素、链霉素、呋喃妥因敏感。根据形态观察、生理生化特征等试验结果,确定L-0603121株菌为副溶血弧菌。     

养殖大菱鲆烂鳍病的流行调查及人工感染试验

通过现场调查和记录备案送检大菱鲆病鱼样品的方法,对我国大菱鲆主要养殖区烂鳍病进行了21个月流行情况调查,共采集到烂鳍病发病样品20个。调查结果发现,烂鳍病是大菱鲆养殖比较常见的细菌性疾病之一,自然高发期集中于5~8月水温较高的时期,苗期的大菱鲆最易感染,发病鱼一般都是急性死亡。组织病理学的研究显示,病鱼多个组织器官均发生不同程度的病变。用该病致病菌对苗期大菱鲆进行的人工感染试验结果表明,高浓度的病原菌对大菱鲆的致病力是相当强的。根据感染试验死亡曲线推算出该致病菌对大菱鲆半致死量为5.9×103cfu/m l。     

养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)腹水病的病原多样性及其耐药性分析

为了解引起养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)腹水病的病原多样性及其耐药性情况,针对2002-2010年由不同地区病样分离的27株细菌性病原进行了16S rDNA鉴定,并采用K-B法测定了27株细菌对22种抗生素的耐药性,分析了病原菌的耐药谱及耐药率变化.结果显示,大菱鲆腹水病病原菌主要有大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas espejiana).山东青岛地区以大菱鲆弧菌为主,威海地区以迟钝爱德华氏菌为主,烟台地区菌株种类分布平均.5类细菌对青霉素类、头孢菌素类、大环内酯类、复方新诺明耐药率高于50％.只有1株迟钝爱德华氏菌对氟苯尼考产生了耐药,其余菌株对其均没有耐药性,且在长期使用中不易产生耐药性,证实氟苯尼考为当前防治腹水病的一种良好抗菌药物.27株病原菌的耐药谱数量为27个,每个菌株具备自己独特的耐药谱,74.1％的菌株对10种以上的抗菌药物产生了耐药性,均有多重耐药性.     

大菱鲆的摄食量与排空速率的初步研究

以常规实验生态方法,研究商品鱼养殖中大菱鲆的摄食量与排空率,得出个体体重约(420±65)g,在(18 6±0 5)℃日投喂1次的条件下,摄食量为15～30g/尾,平均摄饵量为(41 03±1 71)g/(kg·d),空胃率约11%,在同样条件下的排空周期约20h,初始排粪出现在投食后6h,排泄速率高峰出现于12～14h,排粪量为0 77～1 35g/(kg·h)。建议在适温期中,以鲜杂鱼为饵料的该鱼养成期的合理日投饵1次,投喂量以体重的4%为宜。     

应用高通量测序技术分析大菱鲆幼鱼肠道及其养殖环境的微生物群落结构

采用基于Illumina测序平台的高通量测序技术,对大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼鱼肠道及其养殖水体、生物饵料中细菌种类及丰度进行研究。测序结果显示,养殖水体、生物饵料和大菱鲆幼鱼肠道等19个样品共获得有效序列547621条,可聚类于3771个可分类操作单元(OTUs),归属于养殖水体、生物饵料、健康幼鱼和发病幼鱼的操作分类单元(OTU)个数分别为3038、1090、87和777,其中,健康幼鱼与生物饵料、健康幼鱼与养殖水体特有的OTU个数分别为57和0,发病幼鱼与生物饵料、发病幼鱼与养殖水体特有的OTU个数分别为481和31。表明幼鱼肠道微生物多样性与生物饵料密切相关。根据细菌注释结果,拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)在大菱鲆幼鱼肠道中占优势地位,其中,健康幼鱼肠道微生物共聚类为8个门,发病幼鱼的肠道微生物可聚类为19个门。与健康幼鱼相比,发病幼鱼肠道门水平上的3种主要优势菌群落结构出现失衡。此外,对各样品中丰度最高的100位OTU分析显示,幼鱼肠道优势菌种类与生物饵料中的优势菌种类密切相关,而每个发病幼鱼肠道优势菌种类具有一定的独立性。本研究旨在为大菱鲆健康养殖和微生态调控提供实验依据。     

氨氮急性胁迫对大菱鲆幼鱼的毒性效应

本研究采用96 h半静态毒性实验方法,研究了氨氮对大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼鱼的急性毒性效应和血浆生理指标的影响。结果显示,在水温为(19.0±0.5)℃、pH为7.85、盐度为29.5和溶解氧为(7.8±0.2) mg/L的环境条件下,平均体重为(163.90±15.31) g的大菱鲆幼鱼,总氨(TAN)和非离子氨(NH3-N)96 h的半致死浓度(LC50)分别为39.73和0.64 mg/L。氨氮浓度、暴露时间及二者交互作用对血浆肾上腺素(EPI)、皮质醇(Cortisol)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、碱性磷酸酶(AKP)和血糖(GLU)含量/活性都存在显著影响;血浆EPI、SOD、GSH、AKP和GLU随氨氮浓度升高响应时间提前,EPI、皮质醇、AKP和GLU随暴露时间延长总体呈现先升后降的趋势;致死高浓度胁迫(TAN浓度70.96和84.11 mg/L)下,血浆SOD和GSH在胁迫期(12 h)内快速升高,GLU快速升高(4 h)后急剧降低(12 h),暗示氨氮急性致死的原因与氧化应激损伤、生理代谢紊乱和呼吸功能受损有关。本结果可为大菱鲆大规格幼鱼的养殖管理和行为数值模拟提供基础资料。     

磁珠富集法随机筛选大菱鲆基因组SNP标记

利用磁珠富集法随机筛选了大菱鲆（Scophthalmus maximus）基因组7820bp的序列,获得了35个SNP标记,SNP标记的含量约为0.448%。超过68%的SNP标记由碱基转换造成,不足29%的SNP标记由碱基的颠换造成。使用磁珠富集法对目的基因KC70的检测发现,725bp的片段上发现7个SNP标记。此结果证实,该方法不仅能够随机筛选基因组SNP标记,还能筛选目的基因的SNP标记。     

红鱼粉饲料中添加海洋红酵母对大菱鲆生长性能的影响

为研究用红鱼粉替代白鱼粉,并在替代饲料中添加两个不同梯度海洋红酵母对大菱鲆生长性能、体成分以及形体指标的影响。试验用白鱼粉、红鱼粉、海洋红酵母1 g／kg＋红鱼粉、海洋红酵母2 g／kg＋红鱼粉4种等氮等能的试验饲料分别饲喂初始体质量（213．48±0．23） g的大菱鲆,480尾试验鱼随机分为4组,每组设3个重复,每个重复40尾,试验期为6周。试验结果表明,与红鱼粉组相比,海洋红酵母1 g／kg＋红鱼粉组可显著提高大菱鲆的摄食率、相对质量增加率、特定生长率及蛋白质效率（P＜0．05）,效果与白鱼粉组相当,高于海洋红酵母2 g／kg＋红鱼粉组,但差异不显著（P＞0．05）。各试验组大菱鲆的体成分和形体指标差异不显著（ P＞0．05）。据此,添加海洋红酵母1 g／kg即能显著提高大菱鲆对红鱼粉替代白鱼粉饲料的摄食率、蛋白效率和生长性能,使得红鱼粉替代组的饲料性能达到了白鱼粉组的生长水平。