PCR方法检测美人蕉黄斑驳病毒

美人蕉黄斑驳病毒病是危害美人蕉的重要病害之一,我国目前尚无该病发生的报道.本文以健康和感病植株为材料,进行总DNA的提取和PCR扩增,从感病植株中扩增出与目的片段大小相符的产物,而健康植株中则未扩增出.PCR扩增产物经克隆、测序后证实,与已报道的美人蕉黄斑驳病毒(Cannayellow mottle virus,CaYMV)序列同源性高达97%～99%.经优化反应条件,建立了稳定的美人蕉黄斑驳病毒PCR检测方法.     

半巢式RT-PCR检测进口大豆中菜豆荚斑驳病毒的研究

 菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)在美国东部和南部的大豆产区广泛分布。该病毒能够造成3%~52%的产量损失并使大豆品质降低,目前我国未见其分布。针对进口大豆种子的植物病毒检测,本文建立了半巢式RT-PCR技术检测BPMV的方法。该方法采用Trizol快速提取大豆种子病毒总RNA,并根据BPMV的外壳蛋白编码基因设计特异性引物,经第一轮RT-PCR和第二轮半巢式PCR扩增,分别得到275 bp和196 bp大小的特异性基因片段。半巢式RT-PCR扩增产物的测序表明,该产物序列与BPMV的外壳蛋白编码基因存在91%~95%的高度同源性。检测灵敏度比较研究显示,DAS-ELISA与RT-PCR的检测灵敏度相近,半巢式RT-PCR的检测灵敏度比这2种方法高出103倍以上。     

进口大豆上菜豆荚斑驳病毒的免疫捕获巢式RT-PCR检测

利用DAS-ELISA对进口大豆上BPMV进行检测发现,从美国进口的部分大豆样品对BPMV的多抗血清呈阳性反应;利用免疫吸附电镜观察发现,ELISA检测阳性的大豆种皮病汁液中存在直径约30nm的球状病毒粒子.根据BPMV外壳蛋白（CP）基因的保守序列设计了2对嵌合引物,建立了BPMV的高灵敏的免疫捕获巢式RT-PCR（IC-nested RT-PCR）检测方法.该方法经免疫捕获、反转录和2轮PCR扩增,能从带毒大豆种子中扩增到预期大小的DNA条带.序列测定与分析表明此条带的序列为BPMV部分CP基因,在系统关系树上与BPMV的其它分离物形成一簇亲缘关系很近.实验表明从进境大豆上检测到了BPMV.     

烟粉虱中甘薯双生病毒(sweepoviruses)半巢式PCR快速检测技术的建立与应用

甘薯双生病毒(sweepoviruses)是侵染甘薯的一类重要病毒,通过烟粉虱以持久方式传播,我国甘薯上至少存在8种甘薯双生病毒.本研究根据我国已报道的8种甘薯双生病毒基因组保守区设计了一组引物,建立了单头烟粉虱中甘薯双生病毒的半巢式PCR快速检测方法.特异性和灵敏性分析结果表明,半巢式PCR具有较高的特异性和灵敏性,...     

利用实时荧光定量PCR技术检测樱桃叶斑驳病毒

樱桃叶斑驳病毒(Cherry mottle leaf virus,CMLV)是南美洲樱桃上重要的病害之一。本研究针对Genbank上公布的该病毒的核酸序列,人工合成了CMLV(AF170028.1)6741～7322 nt的核酸序列并连接载体,构建了阳性标准质粒,进行实时荧光定量PCR(Fluorescence quantitative,FQ-PCR)检测。实验结果表明,本研究设计的利用FQ-PCR检测CMLV的引物及探针特异性良好,经灵敏度检测,最低检测浓度为23 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度高100倍。该FQ-PCR检测方法为樱桃叶斑驳病毒的防控提供了重要的技术支持。     

半巢式RT-Realtime PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系

马铃薯Y病毒脉坏死株系(Potato virus Y,PVYn)是马铃薯中一个非常重要的病毒病害.本文根据PVYn基因组中RNA依赖的RNA聚合酶基因序列保守区域,设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针,建立了半巢式RT-Realtime PCR检测PVYn的新方法.该方法采用E.Z.N.ATM陕速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术.第二步半巢式RT-Realtime PCR既是对第一步信号的进一步放大,也是对第一步PCR产物的确认,因此,检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、Real time PCR等方法高.实验结果表明,该方法检测灵敏度可达4fg/μL植物总RNA.     

猕猴桃植株中柑橘叶斑驳病毒实时荧光定量PCR检测技术的建立及应用

 柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus, CLBV)在陕西省栽培猕猴桃中发生普遍。为监测CLBV发生情况,本研究建立了CLBV的实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测方法。该方法特异性强,可准确检测目的病毒,标准曲线斜率为-3.378,决定系数R²=0.997 9,扩增效率为97.7%,比普通RT-PCR灵敏度高100倍,可用于猕猴桃植株CLBV的批量检测或低丰度病毒样本(如猕猴桃休眠枝条)的检测。为苗木携带CLBV病毒的早期诊断、果园病毒病预测预报和防控奠定了基础。     

半巢式RT-Reahime PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系

马铃薯Y病毒脉坏死株系（Potato virus Y,PVY^n）是马铃薯中一个非常重要的病毒病害。本文根据PVY^n基因组中RNA依赖的RNA聚合酶基因序列保守区域,设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针,建立了半巢式RT—RealtimePCR检测PVY^n的新方法。该方法采用E．Z．N．A^TM．陕速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术。第二步半巢式RT-Realtime PCR既是对第一步信号的进一步放大,也是对第一步PCR产物的确认,因此,检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、Realtime PCR等方法高。实验结果表明,该方法检测灵敏度可达4fg／μL植物总RNA。     

柑橘黄化脉明病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

为探索柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)引起的柑橘新病害—柑橘黄脉病的早期快速检测技术,针对CYVCV核酸结合蛋白基因的保守序列设计2对特异性引物,通过优化退火温度,建立了CYVCV巢式RT-PCR检测方法,并对采自不同柑橘品种的54个CYVCV疑似样品进行了检测。结果表明,CYVCV巢式RT-PCR检测中,以55℃和60℃分别作为第1轮和第2轮扩增的退火温度时检测效果最佳;该方法检测样品中病毒总核酸的最低浓度为2.40μg/L,灵敏度较RT-PCR提高100倍。在CYVCV疑似样品检测中,巢式RT-PCR和RT-PCR的阳性检出率分别为59.26%和57.41%,前者更适用于检测不同来源的CYVCV。当尤力克柠檬、锦橙北碚-447、天草和台湾椪柑嫁接接种CYVCV后,巢式RT-PCR比RT-PCR提前10~30 d检测出病毒。表明所建立的CYVCV巢式RT-PCR检测方法适用于田间病树的早期诊断。     

单管实时荧光RT PCR方法同时检测大豆种子中的菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒

 本研究建立了大豆种子中菜豆荚斑驳病毒（BPMV）和烟草环斑病毒（TRSV）单管双重实时荧光PCR检测方法。将含有相同浓度的分别带有BPMV和TRSV CP基因的质粒溶液作为阳性对照,以受两种病毒侵染的大豆种子作为待测样品进行实时荧光PCR检测,结果表明能从同一管中同时检测出这两种病毒而不发生交叉反应。尽管在阳性对照中,二者的检测限相当,均可达到35 pg/mL,但在实际应用中,两种病毒由于在大豆种子中的浓度不一致而存在一定的差别。该方法快速、灵敏、简便,同时特异性更强,在出入境检验检疫中具有广泛的应用前景。     

甘蔗白叶病植原体巢式PCR检测方法的建立及初步应用

甘蔗白叶病(sugarcane white leaf,SCWL)是由植原体引起的重要甘蔗病害[1],广泛分布在印度、泰国等许多国家[1,2].我国甘蔗产区的栽培品种也有SCWL的发生[3].甘蔗是无性繁殖作物,植原体可通过繁殖种苗进行传播,台湾斑纹叶蝉(Matsumuratetlix hiroglyhious)通过咬食感染甘蔗植株的韧皮部可引起该病害[4].     

Wind-mediated spread of Rice yellow mottle virus (RYMV) in irrigated rice crops

A study was carried out to demonstrate that Rice yellow mottle virus (RYMV), a virus known to be transmitted by beetles, can spread between rice plants by direct leaf contact caused by wind. Almost all healthy plants surrounding an infected plant became infected when exposed to a fan blowing for 15 min at a distance of 50 cm. Spread of RYMV by plant contact, mediated by wind, was also demonstrated in field experiments, the extent of spread depending on plant density. Infection was almost 10 times higher in plots with a density of 33 plants m⁻² than in plots with 16 plants m⁻². Less spread was observed in plots protected by 1·5 m high windscreens. It is suggested that wind-mediated spread of RYMV may result from abrasive contact between leaves of plants.     

甜瓜黄斑病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法

为建立检测甜瓜黄斑病毒(melon yellow spot virus, MYSV)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qPCR)方法。基于MYSV核衣壳蛋白基因保守序列设计qPCR特异性引物对,针对引物退火温度、引物浓度、特异性和敏感性进行系列优化。结果显示,优化后的qPCR方法最适退火温度为61.3℃,最适引物浓度为0.65μmol·L^-1,特异性强,灵敏度高,比PCR高100倍。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的qPCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.999 7。实验样品验证表明建立的qPCR方法可用于MYSV的定量检测。     

应用巢式RT-PCR检测水仙退化病毒1

水仙退化病毒（Narcissus degeneration virus,NDV）是水仙上发生较为严重的病毒之一。本文根据 NDV 已报道的外壳蛋白基因序列,设计特异性引物,以感病水仙的总 RNA 为模板,建立了快速检测 NDV 的巢式 RT-PCR 方法。结果表明,巢式 RT-PCR 具有良好的特异性和灵敏度,能够从感染 NDV 的水仙样品上扩增出与预期大小相符的特异性目的条带,同时与其他病毒无交叉反应;灵敏度测定结果表示,巢式 RT-PCR 灵敏度较高,是普通 RT-PCR 的104倍,当 RNA 稀释到109倍时仍能被检测到。本文建立的巢式 RT-PCR 为水仙上 NDV 的快速检测提供了技术参考依据。     

利用转录增强技术检测草莓斑驳病毒

为了提高检测草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMoV)的灵敏度和稳定性,探索转录增强技术检测SMoV。在SMoV基因组3′端非编码区的保守区域设计引物,利用带有T7启动子序列的引物进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),再利用T7RNA聚合酶对PCR产物进行体外转录,最后直接通过电泳检测转录产物。结果表明,利用转录增强技术可稳定检测SMoV,灵敏度高于常规RT-PCR;T7启动子序列加在正义引物或反义引物上都可以有效检测。