番茄褐色皱果病毒SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用

根据番茄褐色皱果病毒（tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV）外壳蛋白（coat protein,CP）的保守基因序列设计1对特异性引物,建立了基于SYBR Green I的ToBRFV实时荧光RT-PCR检测方法,并对其进行了特异性、灵敏度检测,对自然感染ToBRFV的番茄、辣椒种子进行了检测验证。结果表明,构建的实时荧光RT-PCR检测ToBRFV阳性的番茄种子总RNA和重组质粒标准品的检测低限分别为0.2 ng/μL和50.0拷贝/μL,均为普通RT-PCR检测灵敏度的100倍;对番茄花叶病毒（tomato mosaic virus,ToMV）、番茄环斑病毒（tomato ringspot virus,ToRSV）、番茄黑环病毒（tomato black ring virus,TBRV）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus,TSWV）、辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）和烟草环斑病毒（tobacco ri...     

TaqMan探针法实时荧光定量RT-PCR检测番茄斑驳花叶病毒

番茄斑驳花叶病毒（tomato mottle mosaic virus,ToMMV）为近年来发现的一种烟草花叶病毒属新成员,是茄科作物上危害严重的主要病毒之一,近几年EPPO全球数据库报道多个国家从进境辣椒和番茄种子中截获该病毒。为防止番茄斑驳花叶病毒通过种子种苗进行传播扩散,本文根据该病毒GenBank中不同分离株外壳蛋白（coat protein,CP）基因保守序列设计特异性引物和探针,建立了TaqMan探针法实时荧光定量RT-PCR检测ToMMV的方法。结果表明,本检测方法特异性强,对烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）、番茄花叶病毒（tomato mosaic virus,ToMV）、番茄褐色皱果病毒（tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV）、黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）、辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）、番茄环斑病毒（tomato ringspot virus,TomRSV）6种病毒均无交叉反...     

番茄褐色皱果病毒胶体金免疫试纸条的研制

 番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus, ToBRFV)是一种新发病毒,严重威胁番茄的安全生产。为了快速、简便地检测该病毒,我们制备了ToBRFV胶体金免疫试纸条。本研究以ToBRFV粒子为免疫原,通过杂交瘤技术制备了17个抗ToBRFV的单克隆抗体。将不同单抗两两组合分别作为胶体金标记抗体和硝酸纤维素膜检测线上的捕获抗体,共获得272个配对组合的胶体金试纸条。通过特异性测定筛选到一组配对抗体制备的试纸条能够在5 min内特异识别ToBRFV,而与番茄斑驳花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、辣椒轻斑驳病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、番茄褪绿病毒、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒等无交叉反应。灵敏度分析表明,该试纸条可从稀释12 800倍的番茄叶片病汁液中检测到ToBRFV,也可检测到50 ng ToBRFV粒子。本研究制备的胶体金试纸条使用方便,灵敏度高,特异性强,适合田间大批量样品检测,可用于ToBRFV的精准监测及早期预警。     

警惕新发病毒番茄褐色皱果病毒Tomato brown rugose fruit virus对我国番茄产业的危害

番茄褐色皱果病毒Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV)于2014年首次在以色列发现, 随后传播到欧洲、美洲以及亚洲等地。ToBRFV在番茄叶片上引起花叶, 更重要的是在番茄果实上引起褐色皱缩斑, 导致番茄完全失去商品价值, 是番茄安全生产的重大威胁。为遏制ToBRFV的传播, 多个国家已经将该病毒列入检疫对象。2019年, 我们在山东番茄上检测到该病毒。本文综述了ToBRFV发生与危害、寄主范围和症状、传播方式、基因组结构、检测方法, 并提出了防治建议, 希望有助于防范该病毒在我国的扩散。     

菠萝凋萎相关病毒-1实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用

菠萝凋萎相关病毒-1( Pineapple mealybug wilt associated virus-1, PMWaV-1)是田间检出率最高的菠萝凋萎病毒。本研究根据PMWaV-1 CP基因保守序列设计特异性TaqMan探针和引物, 建立并优化了PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR检测方法。优化后的反应体系制备的标准曲线为 y=-3.307×logx+38.18, 相关系数 r2为0.998。试验结果表明, 该方法能特异性地检测PMWaV-1, 对PMWaV-2、3和阴性对照均无反应; 最低检测限达到40拷贝。重复性试验表明批内和批间变异系数均小于1.98%, 是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性较好的PMWaV-1定量检测方法。样品检测结果表明PMWaV-1在菠萝植株老叶、嫩叶和吸芽中的病毒含量呈递减趋势。     

一种高效的苹果褪绿叶斑病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法

为建立一种检测苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR方法,根据ACLSV外壳蛋白基因(coat protein,cp)保守序列设计了特异性引物和Taq Man探针,以构建的ACLSV-cp重组质粒为阳性标准品绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。结果显示,以ACLSV-cp重组质粒为标准品建立的标准曲线相关系数达0.999,扩增效率为103.7%;建立的Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR方法特异性好,与苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)、苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)均无交叉反应;灵敏度为100拷贝/μL,比常规RT-PCR高100倍;批内和批间变异系数均小于0.84%。表明Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR方法具有特异性强、灵敏性高、重复性好的优点,适用于实际样品中ACLSV的快速准确检测。     

进境番茄种子中番茄褐色皱纹果病毒的检测鉴定

番茄褐色皱纹果病毒(tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV)是烟草花叶病毒属新成员,番茄和辣椒是其主要寄主,被中国、欧盟、美国、澳大利亚、土耳其、新西兰、智利、阿根廷、俄罗斯、哈萨克斯坦、泰国等国家或地区纳入需检疫的有害生物.我们利用电镜观察、RT-PCR和SYBR Green实时...     

薄壳山核桃疮痂病菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

疮痂病是薄壳山核桃上最具毁灭性的病害,带菌植物材料是传播疮痂病的重要来源。准确、灵敏、快速的检测方法可为该病害流行规律调查和防控提供有力的依据。本文通过比较薄壳山核桃疮痂病菌Venturia effusa及其近似种之间的ITS序列差异,设计了特异性引物和TaqMan探针,建立了薄壳山核桃疮痂病菌的荧光定量PCR检测方法。特异性检测结果表明,该方法可以检测不同地区的薄壳山核桃疮痂病菌菌株,而对其近似种以及薄壳山核桃上的其他真菌均没有信号。本研究建立的检测方法对薄壳山核桃疮痂病菌DNA的最低检测限可达0.5 pg/μL。该方法用于田间样品检测时,检测时间仅需1 h,远快于常规的分离培养法。本研究建立的基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测方法为薄壳山核桃疮痂病菌的快速检测和监测提供了有力工具。     

应用常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测柑桔衰退病毒

 根据柑桔衰退病毒(CTV)P20基因序列设计cquctv9/cquctv10特异引物对,以柑桔RNApolymeraseⅡ基因作为内参照,建立了柑桔衰退病的常规RT-PCR快速检测体系;依据柑桔衰退病毒P20基因序列设计cquctv1/cquctv2特异引物对和TaqMan探针cquctvp1,建立了柑桔衰退病荧光定量RT-PCR快速检测体系。常规RT-PCR检测下限是含有CTV的50pg总RNA,荧光定量RT-PCR法的检测下限是2fg纯CTV片段。荧光定量RT-PCR的灵敏度相对比常规RT-PCR高100倍。利用常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR体系对从2005年3月到2006年7月采自田间的样品进行检测,结果表明,2种检测体系都有很好的特异性和准确性;对183个田间柑桔苗木样品带毒率检测结果表明,荧光定量RT-PCR检出率为(82.5%),比常规RT-PCR检出率(73.2%)高。     

枣疯病植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据枣疯病植原体16S rDNA基因保守区域设计、合成特异性引物和TaqMan探针, 以构建的重组质粒作为阳性标准品, 建立并优化了对枣疯病植原体的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。对优化后的方法进行灵敏度、特异性及稳定性评价, 制作了标准曲线。结果显示, 制作的标准曲线有极好的线性关系, 相关系数( r 2 )达到0.998, 建立的实时荧光定量PCR检测方法能够特异性地检测枣疯病植原体, 能检测到60拷贝的质粒DNA。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法灵敏度、特异性、重复性好, 不仅能够实现对枣疯病植原体的快速检测, 而且为实现从病原定量水平上对枣疯病病情分级奠定了基础。     

基于TaqMan MGB探针的可可花瘿病菌快速检测方法

可可花瘿病菌是一种我国进境植物检疫性真菌?本文根据可可花瘿病菌EF1α基因的保守序列, 设计并合成1对特异性的实时荧光PCR引物和1条TaqMan MGB探针, 建立了可可花瘿病菌的实时荧光PCR检测方法?特异性试验结果表明, 该检测方法能够特异性检出可可花瘿病菌; 实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.2 μmol/L, 探针终浓度0.6 μmol/L; 灵敏度试验结果表明, 20 μL反应体系中可可花瘿病菌DNA含量最低检测限为10 pg; 重复性试验结果表明, 该检测方法的重复性和稳定性良好; 接种试验样品检测结果表明, 该方法可用于疑似携带可可花瘿病菌样品的检测与初筛?本文建立的方法具有良好的灵敏性?特异性和应用性, 为可可花瘿病菌早期快速检测提供了一种有效手段?     

TaqMan探针双重实时荧光定量PCR法同步检测兰花中的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒

为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标序列及对应的最优特异性引物探针组合,建立了基于TaqMan探针的双重实时荧光定量PCR方法。该方法最低检出限为1拷贝或6.2×10-3fg,最低稳定检出限为10拷贝或6.2×10-2 fg,是RT-PCR的10~100倍;构建的标准曲线线性关系良好,扩增效率分别为97.7%和100.2%,相关系数R2分别为1.000和0.999;对其他5种常见病毒均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数≤0.60%,重复性和稳定性好。利用该方法和基因芯片法分别对4个种属的66个兰花样品进行方法验证,该方法相较于基因芯片法检出率提高了53.85%(CymMV)和162.5%(ORSV)。综上所述,本方法可同时高通量检测CymMV和ORSV 2种病毒靶基因,结果可靠,应用前景广阔,可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑。     

实时荧光RT-PCR检测香蕉苞片花叶病毒方法的建立

香蕉苞片花叶病毒(Banana bract mosaic virus, BBrMV)是我国对外检疫性有害生物。为防止该有害生物传入我国,根据BBrMV不同分离株外壳蛋白基因(coat protein, CP)的保守序列,设计特异性引物与TaqMan荧光探针,建立了BBrMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,该方法检测BBrMV的2个不同来源毒株,均能够得到典型扩增曲线,Ct值分别为26.65和27.52;而马铃薯Y病毒、李属坏死环斑病毒以及桃丛簇花叶病毒等其它毒株则没有典型扩增曲线,也无Ct值。灵敏度比较发现,该方法比普通RT-PCR检测方法的灵敏度提高1000倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合对BBrMV的检测。     

实时荧光RT-PCR一步法检测苹果茎沟病毒

 根据苹果茎沟病毒(ASGV)各分离物外壳蛋白(CP)基因的保守序列,设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan-MGB探针,建屯了对ASGV的实时荧光RT-PCR检测方法。TaqMan-MGB探针3'端具有小沟结合分子(Minor groove binder,MGB),提高了探针的Tm值,缩短了探针长度,解决了病毒各分离物之间基因组变异较大、难以找到较长一致的序列来设计探针的困难。该方法的检测灵敏度比常规RT-PCR电泳检测高约10倍,对于ASGV等在果树体内含量较低的病毒尤为适用。此方法快速、灵敏,整个检测过程完全闭管,无需PCR后处理。