禾谷丝核菌环介导等温扩增检测技术体系的建立

为建立简便、快速和灵敏的小麦纹枯病菌——禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis的分子检测技术体系,基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)为靶标序列,设计并筛选特异性引物,建立禾谷丝核菌的LAMP检测方法,并对其特异性、灵敏度和应用效果进行测定。结果表明,基于筛选获得的4条禾谷丝核菌特异性引物建立的LAMP方法能够从15种植物病原菌中特异性地检出禾谷丝核菌,近缘种立枯丝核菌Rhizoctonia solani和引致早期症状易混淆病害的病原菌禾顶囊壳菌Gaeumannomyces graminis、麦根腐平脐蠕孢菌Bipolaris sorokiniana和禾谷镰孢菌Fusarium graminearum均未检出;该LAMP方法在日光下的灵敏度为10^-1 ng/μL,在蓝光下的灵敏度为10^-3 ng/μL;对发病组织的检测显示该LAMP方法能从人工接种的小麦发病组织中...     

橡胶树白粉病菌分子检测技术的建立

根据橡胶树白粉菌(Oidium heveae Steinm.)基因组中的特有保守序列OHS,设计两对特异性引物OHF1/OHR1和OHF2/OHR2。以不同地区收集的6份O.heveae(OH1~OH6)和橡胶树胶孢炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)等5种非靶标病原菌及健康橡胶树叶片基因组DNA为模板,建立了橡胶树白粉菌PCR及nested-PCR分子检测技术,并验证了检测体系的特异性和灵敏度。结果表明,引物OHF1/OHR1和OHF2/OHR2对橡胶树白粉菌均具有较高的特异性和灵敏度。其中引物OHF2/OHR2能检测到10pg/μL的橡胶树白粉菌DNA,而以OHF1/OHR1和OHF2/OHR2组合进行nested-PCR,其最低DNA检测浓度达到0.01fg/μL。人工接种试验中,当孢子接种量为2×10~3个/叶时,PCR和nested-PCR检测体系可分别在接种4d和24h后检测到目的条带。表明nested-PCR对在叶片组织中处于潜育期的橡胶树白粉菌的检测更有效,可为橡胶树白粉菌的检测提供一种简便而准确的检测方法。     

环介导等温扩增技术快速检测麦根腐平脐蠕孢

 为建立麦根腐平脐蠕孢简单快速的分子检测方法,基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术,以核糖体DNA的ITS为靶标序列,设计和筛选出一组麦根腐平脐蠕孢的特异性引物,成功开发可快速准确检测麦根腐平脐蠕孢的LAMP方法。甜菜碱作用测试显示LAMP体系中是否添加甜菜碱对扩增结果无明显影响;特异性测试显示该LAMP方法能够从14种植物病原菌中特异地检测出麦根腐平脐蠕孢;灵敏度测试显示该LAMP方法的检测极限为10^-3 ng·μL^-1,是常规PCR检测方法灵敏度的100倍;通用性测试显示该LAMP方法能够准确检测洛阳、安阳、开封和邯郸等不同地理来源的麦根腐平脐蠕孢菌株;发病组织检测显示该LAMP方法能够准确地从人工接种的小麦发病组织中检测出麦根腐平脐蠕孢,检出时间为侵染12 h及以上。这些研究结果表明所建立的麦根腐平脐蠕孢LAMP检测方法特异性好、灵敏度高、适用性强,可用于小麦根腐病的早期快速诊断。     

柑橘溃疡病菌的普通LAMP及快速LAMP检测方法的建立

建立柑橘溃疡病菌的普通LAMP和快速LAMP检测方法,使其能应用于基层检验检疫部门对病害的快速检测.利用柑橘溃疡病菌基因组特有的保守区域设计LAMP引物,通过优化反应条件,建立柑橘溃疡病菌的普通LAMP检测体系;在普通LAMP引物的基础上设计一对环引物,建立柑橘溃疡病菌的快速LAMP检测体系,并以多种参比菌DNA以及健康柑橘叶片基因组DNA为模板对普通LAMP和快速LAMP检测体系的特异性进行了验证,利用柑橘溃疡病菌菌液和DNA溶液梯度稀释液对普通LAMP和快速LAMP检测体系的灵敏度进行了验证.普通LAMP检测体系菌体和DNA检测灵敏度分别达到了2.25×104 cfu和2.03×10-1 ng,快速LAMP检测体系菌体和DNA检测灵敏度分别达到了2.25 cfu和2.03×10-5ng.在特异性测试中,普通LAMP检测体系与快速LAMP检测体系均仅对柑橘溃疡病菌进行扩增,对非靶标菌和柑橘叶片基因组DNA不产生扩增,普通LAMP与快速LAMP检测体系特异性测试结果一致.快速LAMP检测体系在0.5h内就可以达到普通LAMP检测体系的扩增量,是普通LAMP检测体系反应时间的一半,大大提高了检测的效率;快速LAMP检测体系菌悬液和DNA检测灵敏度均比普通LAMP检测体系提高了10 000倍.成功地建立了柑橘溃疡病菌的普通LAMP及快速LAMP检测方法,为柑橘溃疡病菌的检测提供了一种新的简便、快速的检测手段.     

基于环介导等温扩增技术检测由强雄腐霉引起的玉米茎腐病

为建立强雄腐霉Pythium arrhenomanes的快速分子检测技术,基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)以β-tubulin基因为靶标序列,设计强雄腐霉的特异性引物,建立了一种准确快速的LAMP检测方法,并对该检测方法的特异性、灵敏度和实际应用效果进行评估。25μL LAMP最终反应体系为:10×ThermoPol Buffer 2.5μL、10 mmol/L dNTPs 3.5μL、6 mmol/L MgSO_4 2μL、5 mol/L甜菜碱4μL、40μmol/L FIP-1/BIP-1各1μL、5μmol/L F3-1和B3-1各1μL、40μmol/L LB-1 1μL、Bst DNA polymerase 1μL、2.5 mmol/L HNB 1.9μL、模板DNA 2μL、灭菌水3.1μL。LAMP体系在等温64℃条件下反应60 min,HNB显色反应显示天蓝色即为阳性反应;扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证为梯形条带,也可判定为阳性反应。特异性检测结果显示,LAMP体系能特异性地检测出强雄腐霉,而其它卵菌近缘种和常见植物病原真菌均未检测出。灵敏度检测结果显示,LAMP体系的最低检测灵敏度为10 pg/μL,是普通PCR反应灵敏度的1 000倍。在实际应用中,LAMP体系能够快速检测出人工接种和实际发病玉米组织中的病原菌。表明本研究建立的快速、准确、可视化的LAMP检测方法能在60 min内检测出强雄腐霉。     

水稻种子携带稻瘟病菌LAMP检测方法的建立与应用

稻瘟病菌Magnaporthe oryzae可通过种子带菌实现远距离传播,导致病害发生并造成严重经济损失。建立灵敏高效且便于操作的水稻种子携带稻瘟病菌的检测方法,是确保种子健康和控制病害发生的先决条件。本研究选取稻瘟病菌的3-磷酸甘油酰基转移酶基因MoSPC3设计合成3对特异性引物,并对反应体系进行优化,建立了环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)方法。该方法可特异性地检测稻瘟病菌,对稻瘟病菌DNA样品的检测灵敏度可达到0.24拷贝/μL,远高于普通PCR的检测灵敏度。将该方法用于从中国和马来西亚不同水稻种植区收集的92份水稻种子样品携带稻瘟病菌的检测,结果显示,LAMP方法共检测到89份阳性样品,而普通PCR仅显示有2份样品为阳性。综上,本研究建立了一种适用于水稻种子携带稻瘟病菌的LAMP检测方法,具有简便快捷、灵敏度高等特点,丰富了稻瘟病菌的检测体系,可用于大批量水稻种子样品的健康检测。     

环介导等温扩增实时荧光检测玉米内州萎蔫病菌

选择玉米内州萎蔫病菌基因组DNA高度特异保守区域设计环介导等温扩增技术(LAMP)引物,通过对其反应条件优化,建立玉米内州萎蔫病菌的LAMP检测体系。实验得出内引物与外引物最佳比例为6∶1,反应最佳温度为64℃。运用玉米内州萎蔫病菌克隆质粒梯度稀释液对LAMP检测体系的灵敏度进行了验证。LAMP检测体系的检测限达到100 fg,与常规PCR相比,该方法的检测限提高了100倍。以多种参比菌DNA为模板对LAMP检测体系的特异性进行了验证,结果表明LAMP检测体系仅对玉米内州萎蔫病菌有扩增,对非靶标菌没有扩增。为玉米内州萎蔫病菌快速高效检测提供了一种新型的检测方法。     

利用环介导等温扩增方法快速检测瓜类细菌性果斑病菌和番茄细菌性溃疡病菌

为建立简单、快速和灵敏地检测瓜类细菌性果斑病菌Acidovorax avenae subsp. citrulli(Aac)和番茄细菌性溃疡病菌Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis(Cmm)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,以Aac的ugpB基因和Cmm的micA基因为靶标,分别设计、合成和筛选特异性引物,摸索和优化各项反应条件和反应体系,成功建立了以钙黄绿素颜色为指示且只需要金属浴恒温反应30～60 min的LAMP扩增体系。特异性分析表明该LAMP方法可以快速检出5株不同的Aac菌株和2株不同的Cmm菌株,其它对照菌株如燕麦嗜酸菌燕麦亚种A. avenae subsp. avenae、丁香假单胞菌Pseudomonas syringae、水稻黄单胞菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv. oryzae和茄科雷尔氏菌Ralstonia solanacearum则呈现阴性反应;引物比目前报道的LAMP引物有更高的DNA样品检测灵敏度,Aac和Cmm的灵敏度分别为1.72×10~2fg/μL和1.26×10~2fg/μL。研究结果表明,所设计的Aac和Cmm引物特异性好、灵敏度高,更有利于从源头上控制这2种检疫性细菌病害的流行和传播。     

环介导等温扩增技术检测大丽轮枝菌

 本研究基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),通过比对分析大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)与其相近种不同靶标序列间的差异,选取Gpd(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因作为靶标基因,设计并筛选了四条特异性强、灵敏度高的LAMP引物和两条环引物,建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的大丽轮枝菌的检测方法,并进行了特异性、灵敏度实验及田间发病组织的检测。该方法在62 ℃等温条件下进行核酸扩增反应70 min,扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),反应后根据染料颜色变化判定扩增结果。特异性试验中,仅含有大丽轮枝菌菌株DNA的反应管扩增后呈天蓝色的阳性反应,而其他供试菌株均呈紫色的阴性反应。该方法的最低检测限为100 pg·μL^-1,在土壤中检测的灵敏度为10个孢子/0.25g土壤。该技术能够检测出棉花发病组织中的目标菌,对采自江苏和山东的24份疑似病害样本进行检测,11份为阳性。该方法的建立为大丽轮枝菌的检测及其所致病害的诊断提供了新的技术。     

基于环介导等温扩增技术检测瓜类细菌性果斑病菌

本文利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)基因组中Aave_4063和Aave_4064序列设计了2对特异引物Ac-F3/Ac-B3和Ac-FIP/Ac-BIP,建立了西瓜嗜酸菌的LAMP检测体系。利用该体系在65℃保温1h,通过荧光显色即可完成检测。设计的引物特异性强,其检测灵敏度为2.0×101 cfu/mL。该方法为西瓜嗜酸菌的检疫及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。     

美国出境旅游市场特征及旅华美国市场拓展对策研究

美国是世界出游大国,同时也是我国第一大远程客源国和第四大入境旅游客源国,在我国入境旅游市场中占据着举足轻重的地位。文中运用2001-2010年美国出境旅游市场统计数据,采用季节变动指数、地理集中指数和首位度、位序-规模分布等理论,通过对美国出境旅游市场规模变化、季节分布、全球流向分布及在中国和亚洲其他国家之间分配特征的研究,提出拓展旅华美国市场的对策。研究发现美国出境旅游市场具有以下特征:1)出境旅游市场规模大且持续增长,但是受国内和国际危机事件影响显著;出境旅游旺季在3月、6月、7月和12月,最主要的出境旅游目的地是墨西哥、加拿大和欧洲,亚洲虽非美国人的主要旅游目的地,但其占美国出境市场的份额逐年上升;2)美国人在亚洲旅游的主要目的地包括日本、中国大陆、印度、中国香港、韩国、中国台湾等6个国家和地区;3)中国大陆对美国出境市场的旅游吸引力持续上升,日本对美国市场的垄断地位开始动摇,但仍是中国大陆最大的竞争对手。最后,根据研究结论提出旅华美国市场的拓展对策。     

大叶芥菜对眼子菜化感作用潜力的初步评价

以眼子菜为受体,研究大叶芥菜水浸提液对眼子菜的化感作用。结果显示,浓度分别为0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.085 0、0.062 5、0.050 0、0.033 5、0.008 5 g/m L的大叶芥菜水浸提液对眼子菜种子的萌发抑制效应以0.500 0 g/m L最高,平均抑制率为100.00%;低浓度(0.008 5 g/m L)处理对眼子菜种子萌发的抑制率为13.89%。此外研究发现,大叶芥菜水浸提液对眼子菜叶片数量及鲜质量积累有明显的抑制作用,对鲜质量积累的平均抑制率分别为100.00%、74.68%、65.19%、55.70%、47.79%、46.20%、35.13%和8.23%;对眼子菜种子萌发和鲜质量的化感综合效应(SE)分别为100.00%、74.84%、57.59%、47.29%、43.34%、36.99%、34.23%和11.06%。结果表明,大叶芥菜对眼子菜有很强的化感潜力,能为眼子菜的绿色防控提供理论依据。     

球型芽孢杆菌2362和苏云金杆菌H-14灭蚊实验

观察球型芽孢杆菌2362和苏云金杆菌H -14杀灭蚊虫幼虫效果。方法 :小型孳生地现场试验。结果 :现场实验结果显示 ,Bs.2362按10mL/m2 施药 ,第3d、7d校正密度下降率分别为84.44%和92.86% ;水沟中按20mL/m2施药 ,第3d、7d校正密度下降率分别为99.68%和100%。Bt.H -14按10mL/m2施药 ,第3d、7d校正密度下降率分别为83.33%和61.55% ;水池中按20mL/m2 施药 ,第3d、7d校正密度下降率均为100%。     

Similarity between Copper Resistance Genes from Pseudomonas syringae pv. actinidiae and P. syringae pv. tomato

Twenty-eight strains of Pseudomonas syringae pv. actinidiae isolated in 1984, 1987 and 1988 from kiwifruit orchards in Japan were tested for their resistance to copper sulfate. All strains isolated in 1984 were copper sensitive with a minimum inhibitory concentration (MIC) of cupric sulfate of 0.75 mM. However, some strains isolated in 1987 and 1988 were resistant, with the MIC ranging from 2.25 to 3.0 mM. All copper-resistant strains contained at least one of two plasmids, pPaCul (about 70.5 kb) or pPaCu2 (about 280 kb), or both. In a copper-resistant strain Pa429, the location of the copper-resistance gene(s) was examined by insertional inactivation with Tn5. The MIC of copper sulfate in the copper-sensitive mutant obtained by Tn5 tagging decreased from 2.75 to 0.75 mM. The 14.5 kb BamHI fragment, designated pPaCuB14, containing the same locus mutagenized with Tn5 was cloned from pPaCu1. However, pPaCuB14 did not confer copper resistance in the transformant of copper-sensitive strain Pa21R, suggesting that this clone did not contain a full set of copper-resistance gene(s). Then a cosmid library of pPaCu1 was constructed and six cosmid clones hybridized with pPaCuB14 were selected. One of the six cosmids, designated pPaCuC1, conferred a near wild-type level of copper resistance in the transformant of the copper-sensitive strain. pPaCuC1 had a homologous region that hybridized with all of the PCR-amplifled fragments of copA, copB, copR, and copS genes of P. syringae pv. tomato. DNA sequence analysis of the homologous region revealed the existence of four open reading frames (ORF A, B, R and S) oriented in the same direction. The predicted amino acid sequences of ORF A, B, R and S had 80, 70, 97 and 95% identity with CopA, B, R and S of P. syringae pv. tomato, respectively. Received 5 July 2001/ Accepted in revised form 27 September 2001     

Isolation of Pathogenicity Mutants of Fusarium oxysporum f. sp. melonis by Insertional Mutagenesis

Restriction enzyme-mediated integration (REMI) mutagenesis was used to isolate mutants of Fusarium oxysporum f. sp. melonis impaired in pathogenicity. The race 2 strain Mel02010 was transformed with linearized pSH75, conferring resistance to hygromycin B, with or without the enzyme used to linearize the plasmid. Addition of restriction enzymes did not affect the transformation frequency. A total of 2929 REMI transformants were tested for pathogenicity to three melon cultivars, Amus, Ogon 9 and Ohi. The race 2 strains are pathogenic to Amus and Ogon 9, but not to Ohi. Of 43 transformants with reduced pathogenicity on susceptible melon cultivars, 12 mutants were examined in detail for pathogenicity, vegetative growth and integrative mode of pSH75. The levels of pathogenicity varied among these mutants. Two mutants (B48 and B137) almost completely lost pathogenicity to both susceptible cultivars, and the others had reduced pathogenicity. Mutants B48, B241, B886 and X36 were also impaired in vegetative growth. Mutant B809 was a biotin auxotroph. By DNA gel blot analysis, nine mutants were found to contain a single copy of the transformation vector. These mutants may thus be useful in isolating genes involved in pathogenicity. Received 22 December 2000/ Accepted in revised form 16 April 2001     

菜豆种子普通细菌性疫病菌检测

 由Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli和Xanthomonas fuscans subsp. fuscans引起的菜豆普通细菌性疫病是严重影响菜豆生产的限制因子之一,可造成严重的产量和品种损失。染菌种子是病原菌传播的主要途径。本研究对5个菜豆主要产区的60份菜豆种子样品进行普通细菌性疫病菌检测。在MT选择性培养基上有36份种子样品浸提液检测到目标病原菌, 种子样品带菌量为2.49×10²~5.20×10⁷ CFU/粒。选择36个分离物接种感病品种“英国红”植株,所有分离物均引起接种植株发病。特异PCR检测结果表明,有20个分离物为X. fuscans subsp. fuscans,16个分离物为X. axonopodis pv. phaseoli。试验结果表明,我国一些菜豆主产区商业种植和研究用种子多数污染普通细菌性疫病菌,建议建立无菌种子生产区和加强种子管理,以有效控制病害发生。     

香蕉枯萎病菌生理分化研究

本研究对香蕉枯萎病菌菌株FOCAAA9（来自香蕉）和FOCABB1（来自粉蕉）进行培养试验和接种试验；在含粉蕉和香蕉组织漫提液的培养基上2个菌株的培养性状、菌丝生长速度、孢子形态、大小型孢子比率和产孢量显示出差异；接种结果FOCAAA9能侵染香蕉（Musa AAA）品种巴西蕉、红香蕉和台蕉引起枯萎病，而FOCABB1对3个香蕉品种无致病性。研究结果表明侵染香蕉和粉蕉的古巴尖镰孢[Fusarium oxysporum f．sp．cubeilse（E．F．Smith）Snyder]存在生理分化现象。     

历史时期(着重近4kaB.P.以来)南疆地区气候环境与人地关系演化的初步研究

南疆地区近四千年来气候与环境演化的研究表明 ,本地区气候环境的干旱状况持续未变 ,但期间仍有若干次相对凉湿与暖干旱时期的波动 ,且揭示出 3 .0 ka B.P.、2 .0 ka B.P.、1.5 ka B.P.、1.0 ka B.P.、0 .2 ka B.P.五个气候突变转干时间界线。本研究揭示了近四千年来本地区持续干旱化的特征 ,并有后期加剧的趋势 ,并指出历史时期南疆地区若干人文事件的发生如近两千年以来丝绸之路的兴衰、南疆古城镇的废弃等与气候环境演化之间存在着良好的准对应关系 ,表明气候环境的自然演化是影响人地关系类型与内容的重要因素之一。     

Occurrence of Fusarium oxysporum f. sp. melonis Race 1 in Japan

In 1994, Fusarium wilt of melon cultivars which are resistant to races 0 and 2 of Fusarium oxysporum f. sp. melonis was observed in southern area of the Lake Biwa region, Shiga prefecture. In commercial fields, mature plants of cv. Amus which were grafted onto cv. Enken Daigi 2, and of cv. FR Amus showed yellowing, wilting and finally death before harvesting of fruits. Diseased plants had vascular and root discolorations, and their stem sections yielded typical colonies of F. oxysporum. When the Shiga strains were tested for their pathogenicity to 12 species of cucurbits, they caused wilts only on melon. Using race differential cultivars of melon, the Shiga strains were classified as race 1 of F. oxysporum f. sp. melonis, which has not been reported in Japan. To further characterize their pathogenicity, the strains were used to inoculate 46 additional cultivars of melon, oriental melon and oriental pickling melon. All the race 1 strains were pathogenic to the cultivars tested, and their host range was apparently different from those of strains belonging to other races (races 0, 2 and 1,2y). DNA fingerprinting with a repetitive DNA sequence, FOLR3, differentiated race 1 strains from strains of races 0 and 2, but not from race 1,2y strains. Received 2 July 1999/ Accepted in revised form 30 September 1999     

2009年我国部分麦区小麦白粉病菌群体对温度的敏感性研究

 用小麦离体叶段法,设置22、23、24、25和26℃共5个温度处理,对2009年采自四川、北京、甘肃、河南、河北、陕西和湖北七省（市）的小麦白粉菌标样分离获得的129个单孢堆菌株对温度的敏感性进行了测定。结果表明,供试的129个菌株平均ET₅₀为22.49℃,其中ET₅₀最高为24.48℃,最低为19.88℃,供试菌株中40.52%的ET₅₀介于23℃和24℃之间,占参试菌株的近一半,7.63%的供试菌株ET₅₀≥24℃。不同省（市）的病菌群体对温度的敏感性存在一定差异,且病菌群体对温度的敏感性差异与经纬度存在显著或极显著的负相关关系。研究结果获得了温度对此病害的终止阈值平均为26.65℃,且对温度相对不敏感菌株在较高温度下的潜育期较短、病害的严重度较高。不同敏感性菌株的频率分布结果表明,自然环境中病菌群体已受到温度的选择压力。