致病性副溶血性弧菌特异性三重PCR检测方法研究

[目的]建立同时检测致病性副溶血性弧菌gyrase、tdh、toxR基因的三重PCR快速检测方法。[方法]用3种基因的特异性引物分别对副溶血性弧菌ATCC33847的模板DNA进行单一扩增,找到各自引物最佳扩增条件;再用3种引物同步对模板DNA进行扩增,通过优化引物浓度、引物间比例以及退火温度,建立最佳扩增体系。[结果]在最佳三重PCR反应条件下,gyrase、tdh和toxR能同时扩增出清晰条带,大小分别为91、269和368 bp。[结论]该研究为致病性副溶血性弧菌的快速检测提供了一种新的技术方法。     

荧光定量PCR技术优化及在草莓上的应用

[目的]为优化荧光定量PCR技术体系并在草莓研究中应用.[方法]以二倍体草莓(Fragaria vesca‘Ruegen’)为试材,草莓当中两个β-肌动蛋白基因家族成员Actin1和Actin2为内参基因,对比分析10 μL和20 μL反应体系条件下荧光定量PCR扩增反应.[结果]内参基因引物组合Actin1的扩增效率等指标优于Actin2;10μL反应体系中的扩增效率等指标优于20 μL反应体系;内参基因Actin1在10 μL反应体系下是草莓最优的荧光定量PCR技术体系.[结论]优化了草莓荧光定量PCR体系并应用该技术体系检测了草莓CrRLK1Ls家族成员的时空表达情况.     

产志贺毒素大肠杆菌stx2基因荧光定量PCR检测方法的建立及应用(英文)

[目的]建立检测产志贺毒素性大肠杆菌(STEC)stx2基因荧光定量PCR方法。[方法]根据GenBank中已发表的STEC stx2基因序列,在保守区域设计PCR引物和探针,构建重组质粒作为阳性模板,优化反应条件,建立荧光定量PCR方法。[结果]利用优化的荧光定量PCR反应体系建立了标准曲线。表明起始模板浓度与Ct值之间线性关系好,相关系数R2均达0.995以上;此方法特异性好,对10种非STEC肠道病菌无特异性扩增;敏感性高,初始模板的检出下限达1.0×102拷贝数/μl;重复性好,批内、指间变异系数均分别小于1%和5%。[结论]该研究成功建立了检测STEC stx2基因的荧光定量PCR方法,为快速检测样品中STEC提供了技术手段。     

实时荧光定量PCR法检测抗虫棉Bt基因拷贝数方法的建立

[目的]建立并完善Taqman实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法。[方法]通过Bt基因序列,利用软件Primer5.0设计引物和探针,然后利用10倍系列稀释含有目的基因的质粒pG4AB,进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线。[结果]抗虫基因拷贝数与Ct值的关系为Ct=-3.549 632X+43.783 512,相关系数R2为0.997 867。[结论]实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法具有特异性好、灵敏度高的特点。     

苔藓植物matK基因PCR反应体系的建立和优化

[目的]建立和优化适合于苔藓植物matK基因的PCR反应体系。[方法]以鳞叶藓为材料,利用改良CTAB法提取了基因组DNA,利用单因素试验分析了DNA模板、引物和2×Taq MasterMix的浓度对苔藓植物matK基因PCR反应的影响,对适合苔藓植物的matK基因PCR反应条件进行了优化。[结果]适合苔藓植物的matK基因PCR反应体系为10.0μl,其中含DNA模板0.5μl,正反引物各0.2μl,2×Taq MasterMix 5.6μl。[结论]为苔藓植物的分子系统学等研究奠定了基础。     

实时荧光定量PCR检测弓形虫GRA6基因方法的建立和应用

[目的]在建立快速且准确检测牛弓形虫病的实时荧光定量PCR方法,以进一步研究该病对奶牛的感染情况,为临床诊断与防控提供依据.[方法]以已发表的牛弓形虫GRA6基因作为检测弓形虫病的目的基因,对上述基因各设计一对引物和一条Taqman探针,该探针5端用荧光基团JOE标记,3端用Eclipse标记,进行单重荧光定量PCR.[结果]经反应条件的优化,建立了能够检测牛弓形虫GRA6基因的荧光定量PCR方法.该方法具有具有较好的特异性和可重复性,对GRA6基因的检测最低限为7×100copies/反应,是普通单重PCR的灵敏度的100倍.[结论]用该方法对58份临床样品进行检测,有12份样品存在弓形虫感染,阳性检出率为20.69;,可用来对弓形虫进行快速、准确的检测.     

环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌的研究

[目的]利用环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌。[方法]以志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因（ipaH）作为靶序列,设计引物,优化Mg2＋浓度、Bst酶浓度等反应条件,建立LAMP反应体系。[结果]确定了环介导等温扩增技术检测志贺氏菌的适宜反应条件;该法检测志贺氏菌的灵敏度为62 cfu/ml。[结论]该研究初步建立了一种利用LAMP快速检测志贺氏菌的方法,为食品中志贺氏菌快速检测构建了一个技术平台。     

实时荧光定量PCR法检测抗虫棉历基因拷贝数方法的建立

[目的]建立并完善Taqman实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法.[方法]通过Bt基因序列,利用软件Primer5.0设计引物和探针.然后利用10倍系列稀释含有目的基因的质粒pG4AB,进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线.[结果j抗虫基因拷贝数与Ct值的关系为Ct=-3.549 632X 43.783 512,相关系数R2为0.997 867.[结论]实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法具有特异性好、灵敏度高的特点.     

环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究

[目的]采用环介导等温扩增技术,快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌。[方法]以单核细胞增生性李斯特氏菌（CMCC54001）的hlyA基因作为靶基因,设计引物,观察检测结果。[结果]确定了环介导等温扩增技术检测单核细胞增生性李斯特氏菌的最适反应条件。采用该方法检测单核细胞增生性李斯特氏菌的灵敏度为4.2CFU/ml。[结论]该研究建立了环介导等温扩增技术单核细胞增生性李斯特氏菌的检测方法。     

放线菌快速检测方法的反应体系及反应条件的优化

[目的]研究放线菌快速检测方法的PCR反应体系及反应条件的优化。[方法]以5种存在于16SrDNA序列中的放线菌特异性的特征序列为引物,通过对PCR反应体系和反应条件的优化,建立最佳扩增体系及反应条件,并对供试菌株进行测定,以验证该方法的可靠性。[结果]所采用的特异性引物能够有效检测出特定类群的放线菌,从而达到快速检测不同类群放线菌的目的。[结论]该方法可用于放线菌的快速检测,为放线菌的分类鉴定研究提供参考。     

TaqMan定量PCR检测水稻中外源基因含量

[目的]采用TaqMan定量PCR技术检测水稻中外源基因含量。[方法]采用TaqMan定量PCR技术以编码磷脂酶D基因PLD为内标准基因,检测转基因水稻中外源TT51-1的含量。利用DNA梯度稀释法分别求内标准基因PLD和TT51-1的C_t值与拷贝数对数值的标准曲线方程,并将得到的C_t值代入标准曲线方程求取样品中外源基因的拷贝数。[结果]内标准基因PLD标准曲线方程为y=-3.403x+39.939,R~2=0.993;TT51-1基因标准曲线方程为y=-3.35x+37.37,R~2=0.991,转基因含量为1.21%,不确定度为0.45。[结论]TaqMan定量PCR技术可以用于确定转基因作物外源基因含量。     

不洁贮藏对葡萄果肉衰老相关基因表达的影响

[目的]研究不洁贮藏对葡萄果肉衰老相关基因表达的影响。[方法]以巨峰葡萄果实为材料,应用实时荧光定量PCR技术对不同处理的相对表达量进行测定。[结果]ACC氧化酶基因、ACC合成酶基因、苯丙氨酸解氨酶基因表达量明显上调;脱落酸调控基因表达量明显下调。[结论]该试验为从基因水平上研究葡萄保鲜机理奠定了基础。     

阪崎克罗诺杆菌中转座子拷贝数实时定量PCR检测方法的建立

[目的]建立检测阪崎克罗诺杆菌中转座子拷贝数的实时定量PCR方法。[方法]以单拷贝持家基因atpD作为内参基因,建立同时含有单拷贝持家基因atpD和EZ-TN5转座子的重组质粒;建立atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测的标准曲线,并利用所建立的标准曲线,对3株阪崎肠杆菌突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子的拷贝数进行检测,并计算其比值。[结果]atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测标准曲线的相关系数分别为0.999和0.998;3株突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子拷贝数比值分别为0.98、1.17与0.91,证明突变株中转座子为单拷贝。[结论]该研究所建立的实时定量PCR方法实用性强,可替代Southern杂交用于不同细菌中EZ-TN5转座子拷贝数的检测。     

梨果精确定量栽培技术应用研究

[目的]探求能满足优质、安全、高效、高产4个方面综合要求的、适用的梨果(Pyrus spp.)精确定量栽培技术。[方法]从植物营养、植物病虫害和花果管理综合调控体系等方面实现梨果栽培的精确定量。[结果]实践证明该技术应用于果树商业化栽培中,生产的果品能够达到国家绿色食品标准,具有节水、节肥、省工等优点。[结论]该技术具有广泛的指导作用和适用价值。     

利用SYBR Green实时定量PCR法检测转基因植物外源基因的拷贝数

[目的]探讨SYBR Green实时定量PCR技术应用于检测转基因植物外源基因拷贝数的可行性。[方法]使用SYBR Green实时定量PCR技术,以转CYCD3;1的拟南芥为材料,通过CYCD3;1基因与单拷贝内参基因以及转基因株系中的CYCD3;1基因与野生型植株的比较来确定外源基因的拷贝数。[结果]该法计算所得外源基因拷贝数与传统高准确性的Southern blot法结果相符。[结论]使用该法检测外源基因拷贝数简单易行,可操作性强。     

不同生育期施用钾肥对烤烟生长·产量·质量的影响

[目的]研究团棵期、现蕾期施用钾肥及叶面补施钾肥对烟草生育期、烟叶产质量的影响。[方法]选择烤烟适宜的生育期施用钾肥,研究对烤烟植株生长和烟叶品质的影响。[结果]结果表明,分别在团棵期和现蕾期各半追施钾肥较为适宜,再加施一定量的叶面肥(磷酸二氢钾)效果较为理想。[结论]在烟草生育中、前期施入钾肥可以提高烟叶单产、品质和经济价值。     

Genefinder和EB在DNA电泳谱带定量分析中的比较

[目的]比较Genefinder和EB对DNA电泳谱带定量分析的影响。[方法]用加入Genefinder或EB的琼脂糖凝胶进行PBR322DNA电泳,并用凝胶成像分析系统进行标准曲线相关性等分析。[结果]用Genefinder作染料,标准曲线相关性、样品含量百分误差、灵敏度等都比EB好。[结论]用Genefinder作染料不仅提高了定量分析的质量,而且安全、无污染,有利于保护环境。     

旱育秧密度对杂交水稻秧苗素质的影响

[目的]研究旱育秧情况下秧苗密度对秧苗素质的定量影响,为制订高产高效栽培技术方案和有关理论研究提供依据。[方法]通过对不同旱育秧密度下的分蘖数、株高、根长、根数和干物质等性状的调查,研究旱育秧秧苗素质的变化。[结果]结果表明,不同秧苗密度下,播种后43d内各指标没有出现显著性差异,43d后一次分蘖、二次分蘖、总分蘖、根数和干物质等指标的变化逐渐出现显著性差异。不同秧苗密度相比较,秧苗密度6．32cm×6．32cm和5．35cm×5．35cm的处理其分蘖和干物质含量都最高,是合理的旱育秧密度。[结论]密度、秧龄和密度×秧龄对各指标的影响都呈极显著差异。     

盐胁迫下小黑麦碳酸酐酶基因表达及其酶活性分析

[目的]探究盐胁迫下小黑麦中碳酸酐酶(CA)基因表达特点及酶活性变化规律.[方法]采用0.15M NaCI对两个六倍体小黑麦品种幼苗进行胁迫处理,通过实时荧光定量PCR对胁迫条件下CA基因表达量的变化进行检测,并利用pH计法对相应材料中的碳酸酐酶活性进行测定.[结果]盐胁迫条件下两个小黑麦品种幼苗中的CA基因表达量及酶活性均较对照有所增强.随胁迫时间的不同,参试的两个小黑麦品种中CA基因表达量及酶活性变化的幅度有一定差异.[结论]盐胁迫对小黑麦中CA基因的表达量和酶活性均具有促进作用.