马铃薯青枯病病原的鉴定

利用湖北省四个地点的马铃薯青枯病样本,对其病原物的菌落形态、碳水化合物利用、显微形态、鞭毛引物序列、演化型以及致病力等方面进行了分析。结果显示,在2,3,5-氯化三苯基四氮唑培养基上检测得到16个病原物菌落符合青枯菌菌落形态特征,包括菌落圆形,隆起,中间红色,乳白色分泌物,并伴有褐色物质;显微观察16个病原物中仅有6个病原物具有短杆状、两端钝圆的特点;而其中能够通过PCR扩增得到鞭毛序列的病原物仅有源自武汉的HZ4-14和HZ5-1,序列比对发现两者序列一致且与GMI1000等已测序青枯菌株同源性达到99%;演化型测定结果显示HZ4-14和HZ5-1均能得到144 bp的目标条带,为演化II型;利用四种不同马铃薯材料试管苗伤根接种鉴定结果显示两个菌株均具有一定致病力。结果表明,引起湖北省武汉市青枯病的病原物为雷尔氏青枯菌Ralstonia solanacearum,生理小种2号,演化II型(美洲组)。     

广州地区番茄青枯病菌的系统发育分析及致病力评价

2012~2013年,于广州地区采集番茄青枯病病样并进行病原分离工作,经分子鉴定后获得9个菌株。通过PCR扩增获得了其中9个菌株的egl基因序列,采用国际新兴的青枯菌演化型分类框架进行系统发育分析,以NCBI数据库中分离自不同寄主的青枯菌菌株egl基因序列为参考序列进行系统发育树构建。结果表明:9个菌株属于青枯菌演化型I型即亚洲分支菌株的4个序列变种,分别为序列变种13、14、34、44。以高抗青枯病番茄材料‘兴农021’和敏感材料‘金冠3号’为试材,评价了其中5个菌株的致病力,结果表明3-1和18-6致病力较高。     

花生青枯菌致病性的研究

从我国六个省的花生青枯病发生地区采集的36个花生青枯菌分离株,通过对六个不同抗病性的鉴别品种进行人工接种表明,所有菌株对鉴别品种均具有不同程度的致病力,菌株致病性分化十分明显。根据致病性的不同反应,可以划分为7个致病型,其中的V型和Ⅱ型出现率最高达36.1%和25%。且分布地区相当广泛,为我国花生青枯菌占优势的致病型。试验证明,我国南方病区菌株的致病力普遍比北方强;同一地区可以有不同致病型菌株混合存在;同一母株在不同的地理环境影响下,致病力会发生变化。通过7个省13处自然病圃的品种抗病性鉴定表现,所获结果与人工接种结果基本相同。只是在自然环境条件影响下,菌系的致病性分化更为复杂,出现的致病型更多。本试验为青枯菌系的研究,深入开展花生抗青枯病鉴定,发掘新抗源,加快抗病育种工作进程以及设计综合防治技术措施提供了依据。     

青枯菌对花生发芽率及芽长的影响

花生青枯病严重影响花生的产量和品质,了解青枯菌对花生发芽和生长的影响是研究青枯病作用机制以及信号转导途径的前提.为检测强致病力青枯菌对“日花1号”种子发芽的影响,采用发芽试验对种子发芽(露白)率以及芽长进行检测,并用荧光定量PCR方法检测了植物抗病相关基因非病程相关基因表达子1(NPR1)在青枯菌胁迫条件下的表达变化规律.结果表明,经过青枯菌浸泡的种子,发芽受到明显抑制,芽长较对照组亦明显变短.在胁迫条件下NPR1的表达量在第12h达到最高,随后缓慢降低,第48h的表达量仍未恢复到初始水平,是初始水平的1.7倍.     

烟草青枯病菌巢式PCR检测方法的建立及应用

利用细菌16S-23S r DNA内源转录间隔区通用引物L1/L2扩增烟草青枯病菌基因组DNA,并对其扩增产物进行克隆测序,经与近缘种序列多重比对分析后,设计1对特异性引物Rs F/Rs R,用于包括烟草青枯病菌在内的15种不同细菌、5种真菌、3种卵菌基因组DNA的PCR扩增。结果表明:在优化的反应体系与程序条件下,该对引物只能从烟草青枯病菌中扩增出241 bp的特异片段,并通过序列测定验证了其准确性;将引物Rs F/Rs R与细菌通用引物L1/L2进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达0.4 fg/μL,较常规PCR提高1 000倍,表明该对引物能有效地用于烟草组织及土壤中青枯病菌的检测。此结果对烟草青枯病的早期诊断、快速检测及病害流行学研究具有重要意义。     

引起广西桑树“褐枯”的病原菌及致病机制研究

对广西地区的桑树发病初期叶片褐枯情况进行调查，通过收集桑树病株并进行分离。结果表明，得到优势菌株42株，各菌株形态基本一致。对分离到的菌株进行16S rDNA序列鉴定，比对后发现所有菌株序列均与劳尔氏青枯菌Ralstonia solanacearum（RS）相似度达99％，生化型分析结果显示主要为生化Ⅰ型。随机选择10个菌株进行致病力实验，结果表明，各菌株均具有致病性，部分菌株致病率达90％以上。其后利用扫描电镜观察青枯菌侵染桑苗过程，发现侵染后期桑根木质部导管内聚集大量菌体，堵塞整个导管。上述结果表明：广西地区桑树“褐枯”症状病害属于桑树青枯病，病原菌为劳尔氏青枯菌RS，其致病机制是通过在桑根木质部导管内大量定殖，堵塞导管阻止水分运输，最终导致植株枯萎死亡。     

香蕉枯萎病菌fga1基因的克隆与序列分析

为了解fga1基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间的致病力差异的关系,采用PCR和RT-PCR方法扩增了2个生理小种的fga1基因,并对扩增产物进行了测序及相似序列搜索和比对,还对基因编码的蛋白进行了氨基酸序列比对和功能分析.研究结果表明2个生理小种fga1基因开放阅读框均为1 062 bp,编码353个氨基酸,基因同源性为99.5%,氨基酸序列相同.推测fga1基因可能与香蕉枯萎病菌自身繁殖和附着胞的形成有关.从fga1基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列看,2个生理小种致病力的差异与fga1基因并无明显对应关系,这为进一步研究fga1基因功能奠定了基础.     

花生矮化病毒株系致病力分化及区域分布

从河南、北京、山东、河北的花生、刺槐、菜豆、紫穗槐上获得的２９个ＰＳＶ分离物，根据它们引起花生症状的严重程度划分成强、中、弱致病力三种类型。不同致病力类型的ＰＳＶ分离物在叶片中病毒相对含量及对花生产量影响有明显差异。河南开封和郑州ＰＳＶ分离物以弱致病力类型为主，河北迁安和滦县ＰＳＶ分离物以强致病力类型为主，而北京、山东两地ＰＳＶ分离物３种类型均有     

我国斯里兰卡木薯花叶病毒的分子特征及致病性分析

为进一步探究我国斯里兰卡木薯花叶病毒（Sri Lankan cassava mosaic virus, SLCMV）的分子特征及致病性。以感染SLCMV的木薯叶片基因组DNA为模板,PCR扩增获得DNA-A和DNA-B基因组全长,通过生物信息软件分析比较其核酸及氨基酸序列特征;构建了强、弱致病力分离物（SLCMV-Colombo和SLCMV-DG1922）的侵染性克隆,分别将2种致病力分离物的DNA-A和DNA-B组分进行重组,接种烟草（Nicotianatabacum）,比较2种分离物的致病性差异。结果显示：我国SLCMV为“旧世界”双组份菜豆花叶病毒,编码包括AV2基因在内的8个开放阅读框（ORFs）;具有双生病毒典型的共同序列（CR）、重复序列、TATABox和TAATATT↓AC茎环结构,Rep蛋白羧基末端有7个氨基酸缺失;我国SLCMV的基因组、编码和非编码区与柬埔寨、泰国和越南分离物的相似性在97.0%～100.0%之间,与印度和斯里兰卡早期的分离物相似性为86.5%～98.6%,DNA-B组份与印度木薯花叶病毒株系（ICMV）编码区序列相似性为95.0%～97.6%,与其...     

花生青枯病抗性鉴定及抗源分析

利用分离的致病力强的花生青枯菌菌株，对花生新品种(系)进行了抗性鉴定，筛选出高抗新品种(系)粤油200、粤油256、粤油79、粤油114、粤油9号、粤油202—35等共8个，中抗品种(系)粤油193、粤油7号等5个。抗源分别是Ahl722、印度花皮和台山三粒内。     

野茼蒿变叶病病原物的分子鉴定

利用植原体16S rDNA通用引物R16mF2/R16mR1对海南表现变叶症状的野茼蒿样品总DNA进行PCR扩增,获得约1.4 kb的特异片段,并对扩增产物进行核苷酸序列测定。通过BLAST程序比较、系统进化树构建及iPhy Classifier分析表明,海南发生的野茼蒿变叶植原体在分类上属于花生丛枝植原体组中的A亚组,即16Sr II-A亚组。这是我国首次在野茼蒿上发现植原体病害。     

花生DNA分子标记的研究ⅡRGA标记

采用4对RGA引物、9份花生材料进行PCR扩增．只有引物NLRR inv1／inv2扩增出产物。采用该对引物扩增．18份材料中只有10份获得产物。总共获得58条迁移率不同的带．其中多态性带56条。根据条带共享程度计算出的带型相似指数为0．188～0．986。10份材料可以按条带数目多寡分成两大类。     

Molecular characterization,vector identification and partial host range determination of phytoplasmas associated with faba bean phyllody in Iran

During surveys of phytoplasma diseases, faba bean phyllody (FBP) was observed in several locations in Fars and Bushehr provinces (southern Iran). Samples of affected plants from Borazjan (Bushehr province) and Fasa (Fars province) were used to transmit the phyllody agent to faba bean, mung bean, pea, alfalfa and periwinkle by grafting, dodder and/or vector insect. Orosius albicinctus (Distant) was identified as the vector of Borazjan (BFBP) and Fasa (FFBP) faba bean phyllody. Naturally affected faba bean plants and all inoculated plants were positive for phytoplasma by direct PCR using the P1/P7 primer pair and nested PCR using P1/P7 and R16F2n/R16R2 primer pairs. Sequencing of PCR products identified the associated phytoplasmas as members of 16SrII phytoplasma group. Phylogenetic analysis using full length 16S rRNA gene sequences also confirmed similarity of the BFBP and FFBP phytoplasmas to the 16SrII group phytoplasmas. In this analysis the FFBP phytoplasma was grouped with ’Candidatus Phytoplasma australasia’, representative of 16SrII-D subgroup, while the BFBP phytoplasma formed a discrete group close to the 16SrII-C subgroup. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) confirmed that BFBP and FFBP phytoplasmas belong to 16SrII group. Virtual RFLP confirmed that as members of peanut witches’ broom (16SrII) phytoplasma group, BFBP and FFBP phytoplasmas belonged to 16SrII-C and16SrII-D subgroups, respectively. Phytoplasmas associated with BFBP and FFBP were shown to be serologically related to the Fars alfalfa witches’broom phytoplasma, a member of 16SrII-C subgroup. It seems that witches’broom affected alfalfa fields are natural reservoirs of the FBP phytoplasma in southern Iran.     

新型花生内源特异参照基因的开发与应用研究

一个物种的内源特异参照基因是该物种区别其它物种的特异性标志之一。本研究通过对GeneBank中花生基因信息的检索分析,筛选出花生几丁质酶基因chi2.2作为该物种内源特异参照基因的候选基因。通过对该基因的特定区域设计引物,建立了花生产品特异性定性PCR检测方法。利用该方法分别对16个花生品种的DNA进行PCR扩增,均能扩增出81bp的片段。利用相同引物分别对其他油料作物、粮食作物和蔬菜等（油菜,大豆,芝麻,向日葵,油棕,棉花,水稻,玉米,长豆角,豌豆,土豆,萝卜,辣椒,茄子,拟南芥,烟草）的DNA进行PCR扩增,均未发现特异性扩增产物。 结果表明,本研究建立的花生产品检测方法具有很好的物种特异性,且其灵敏度达到0.05ng基因组DNA。该方法可用于花生源成分鉴定,如确定食品中是否含有花生源成分,本研究为识别掺假使杂和保障食品安全提供有效手段。     

茶园土壤细菌丰度及其影响因子研究

采用Griffiths法直接提取土壤微生物基因组DNA,并通过实时荧光定量PCR技术分析土壤微生物16 SrRNA基因数量,对茶园及其附近森林和菜园土壤的细菌丰度及其影响因素进行了研究。结果表明,茶园土壤细菌丰度在0.01×108~20.32×10816 S rRNA基因拷贝数/g之间,平均为3.70×10816 S rRNA基因拷贝数/g,与酸性森林土壤大致相当,但明显低于中性菜园土壤。土壤细菌丰度与pH和微生物量C呈极显著正相关(P<0.001),但与施N量和茶树种植年限呈极显著负相关(P<0.01),与土壤有机C和全N含量的相关性不明显。多元回归分析表明,影响土壤细菌丰度最重要的因子是土壤pH,其他依次为树龄和施氮量。可见,提高茶园土壤细菌数量和微生物多样性的有效办法是适当提高土壤pH值,同时避免过量施用氮肥;对于改植换种的老茶园,改良土壤也是必不可少的。     

海南槟榔黄化病病原物的分子鉴定

槟榔黄化病是槟榔上的一种重要病害,如何快速检测该病原菌是防治该病的重要基础。利用植原体16SrDNA通用引物对海南感染黄化病的槟榔花苞总DNA进行巢式PCR扩增,获得约1.2kb的特异片段,并对扩增产物进行核苷酸序列测定。通过BLAST程序比较、系统进化树构建及iPhyClassifier分析表明,引起海南槟榔黄化病病原植原体属于翠菊黄化植原体组(16SrⅠ组),且为该组中一个新的亚组,即G亚组,现将其暂命名槟榔黄化植原体(Arecanut yellow leaf phytoplasma,AYL)。     

花生AhFAD2-1基因与油酸/亚油酸比值的关系

花生AhFAD2-1由位于不同基因组上的两个非等位基因AhFAD2-1A和AhFAD2-1B共同编码,这两个基因的突变引起酶结构、酶活性或表达调控的变化,共同导致高油酸性状的产生。本研究通过对13个不同花生品种(系)的AhFAD2-1基因进行测序和比对分析,查找点突变或插入位点,寻找与高油酸性状关联的基因位点。结果表明:E11、花育30、鲁花12、豫花15、河北高油的基因型是OL_1OL_1OL_2OL_2,其相应的O/L值为1.01~1.40;鲁花14、花育17、花育19、花育23、E12S的基因型是ol_1ol_1OL_2OL_2,其中E12S较特殊O/L值为9.05,其他品种O/L值为1.54~1.97;E16、E18和花育32号的基因型是ol_1ol_1ol_2ol_2,其相应O/L值为12.3~41.85。本研究结果对于高油酸性状的分子鉴定以及高油酸花生新品种的培育具有一定的参考价值。     

拟南芥AtTTG1基因的克隆及用于转化花生的MAR调控表达载体构建

黄曲霉毒素污染对花生产业危害巨大,通过基因工程改变花生果种皮结构以提高花生抗黄曲霉能力。根据GenBank中拟南芥AtTTG1基因的cDNA编码区设计引物,通过RT-PCR克隆AtTTG1基因,结果显示,克隆获得的片段长1026bp,与基因库中数据比对相同,该片段编码341个氨基酸,预测其蛋白分子量为86.96KDa,等电点为4.85。结合实验室已获得的花生果种皮特异启动子S19和MAR序列调控的植物表达载体pLMAR,构建了植物高效表达载体pLMAR-S19-TTG1,并将其导入根癌农杆菌EHA105。为进一步对花生进行遗传转化,获得转基因高抗黄曲霉花生奠定基础。     

Bacterial DNA Detection in the Blood of Healthy Subjects

Background:The presence of microbiome in the blood samples of healthy individuals has been addressed. However, no information can be found on the healthy human blood microbiome of Iranian subjects. The current study is thus aimed to investigate the existence of bacteria or bacterial DNA in healthy individuals. Methods: Blood samples of healthy subjects were incubated in BHI broth at 37 °C for 72 h. The 16S rRNA PCR and sequencing were performed to analyze bacterial isolates. The 16S rRNA PCR was directly carried out on DNA samples extracted from the blood of healthy individuals. NGS was conducted on blood samples with culture-positive results.Results:Fifty blood samples were tested, and six samples were positive by culture as confirmed by Gram staining and microscopy. The obtained 16S rRNA sequences of cultured bacterial isolates revealed the presence of Bacilli and Staphylococcus species by clustering in the GeneBank database (≥97% identity). The 16S rRNA gene sequencing results of one non-cultured blood specimen showed the presence of Burkholderia. NGS results illustrated the presence of Romboutsia, Lactobacillus, Streptococcus, Bacteroides, and Staphylococcus in the blood samples of positive cultures.Conclusion: The dormant blood microbiome of healthy individuals may give the idea that the steady transfer of bacteria into the blood does not necessarily lead to sepsis. However, the origins and identities of blood-associated bacterial rDNA sequences need more evaluation in the healthy population.Key Words: Bacteria, Blood, Microbiome, Sequencing, 16S rRNA     

转基因花生对根瘤菌的影响和外源基因向根瘤菌逃逸风险性研究

用含花生条纹病毒壳蛋白基因的转基因花生品系TP-1、TP-7为材料,通过水培生长试验表明在花生不同生长时期,转基因花生对单株花生根瘤菌结瘤数量和结瘤重量无明显影响.对从转基因花生品系TP-1、TP-7上分离的100个根瘤菌样品PCR检测结果,花生根瘤菌中无花生条纹病毒壳蛋白基因特异性片断.结果初步说明导入花生的花生条纹病毒壳蛋白基因不会对根瘤菌结瘤生长特性产生影响,外源基因从花生向根瘤菌逃逸的机率很小.