H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗的免疫效力

利用表达H5亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒疫苗免疫SPF鸡和无母源抗体的商品鸡，通过比较免疫后血凝抑制(HI)抗体应答水平、攻毒后发病率和死亡率等指标评价其免疫保护作用。免疫后21d，重组鸡痘病毒免疫组仅有13％～20％鸡的HI抗体检测呈阳性。在同亚型禽流感病毒攻击后，重组鸡痘病毒疫苗免疫组产生了100％的保护率，而未免疫组全部死亡。结果表明：重组鸡痘病毒疫苗不能激发高滴度HI抗体应答，但可抵御同亚型禽流感病毒致死性攻击，保护效果达到或优于目前应用的灭活苗，显示出良好的应用前景。     

表达H5亚型禽流感病毒HA基因的DNA疫苗免疫保护效力研究

 表达高致病力禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1) [GD/1/96(H5N1)]HA基因的DNA疫苗质粒pCIHA5具有良好的免疫保护性,为了将其开发并应用于实际,对其免疫保护效力进行了进一步的研究。结果表明,用10、40、70、100和150g pCIHA5和油苗1次免疫后,其免疫保护率分别为12.5%(1/8)、58.3%(7/12)、72.7%(8/11)、50.0%(6/12)、66.7%(8/12)和100%(12/12),其中70和100g剂量组的病毒分离结果     

共表达禽流感病毒HA和NA基因的重组禽痘病毒在SPF鸡的免疫效力试验

 将禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)毒株的HA和NA2个基因同源重组到禽痘病毒基因组中,获得了能同时高效表达这2种蛋白的重组禽痘病毒(rFPV-HA-NA)。将rFPV-HA-NA经翅膀刺种途径接种8周龄SPF鸡,免疫后4周分别用10LD50的高致病力禽流感病毒(HPAIV)A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)和A/FPV/Rostock/34(H7N1)毒株进行攻击。结果重组禽痘病毒免疫鸡群诱导产生了高水平的抗体,能够完全抵抗H5N1和H7N1亚型病毒的     

共表达禽流感病毒HA和NA基因的重组禽痘病毒在SPE鸡的免疫效力试验

将禽流感病毒A/GooSe/Guangdong/3/96(H5N1)毒株的HA和NA2个基因同源重组到禽痘病毒基因组中,获得了能同时高效表达这2种蛋白的重组禽痘病毒(rFPV-HA-NA).将rFPV-HA-NA经翅膀刺种途径接种8周龄SPF鸡,免疫后4周分别用1 0 LD.的高致病力禽流感病毒(HPAIV)A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)和A/FPV/Rostock/34(H7N1)毒株进行攻击.结果重组禽痘病毒免疫鸡群诱导产生了高水平的抗体,能够完全抵抗H5N1和H7N1亚型病毒的致死性攻击;并可有效阻止病毒在泄殖腔的排出.而禽痘病毒免疫组和非免疫对照组在攻毒后全部发病并死亡.     

表达禽流感病毒凝素基因的重组禽痘病毒的构建

为构建表达禽流感病毒（ＡＩＶ）血凝素（ＨＡ）基因的重组禽痘病毒,将禽痘病毒启动子ＬＰ２ＥＰ２驱动的Ｈ７亚型ＡＩＶ ＨＡ基因ｃＤＮＡ和大肠杆菌ＬａｃＺ基因插入禽痘病毒疫苗株Ｆ－０１７的复制非必需区。经蓝班筛选后,对重组病毒又进行了３次蚀斑克隆。以不同代次重组禽痘病毒核酸为模板,利用Ｈ７亚型ＡＩＶ ＨＡ基因特异的引物进行聚合酶链式反应,均扩增出１条特异的１．７ｋｂ ＤＮＡ条带。收集不同代次的重组禽痘病毒细胞培养物进行免疫斑点试验,均检测到ＨＡ蛋白,表明Ｈ７ ＨＩＶ ＨＡ在重组禽痘病毒中获得了成功表达。该重组禽痘病毒的构建为ＡＩＶ病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。     

不同类型H5亚型禽流感疫苗的免疫保护效力比较研究

为比较以我国首个H5亚型禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/1996(H5N1)\[GS/GD/96\]为基础构建的新型重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,Re\|1株）、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（H5亚型）、禽流感、新城疫重组二联活疫苗（rLH5\|1株）以及禽流感DNA疫苗（H5亚型,pH5\|GD）的免疫保护效力。分别将四种禽流感疫苗以2.8 μg HA/0.3 mL（肌肉注射）、103PFU/100 μL（刺种）、106EID50/100 μL（滴鼻、点眼）、15 μg/200 μL（肌肉注射）等不同剂量和方式免疫3周龄SPF鸡,首次免疫3周后再加强免疫一次,加强免疫2周后用106EID50的高致病力禽流感病毒（HPAIV） GS/GD/96鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况。分别于攻毒后第3 d、第5 d、第7 d采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫及攻毒后血清HI抗体的动态变化。所有疫苗均可对免疫鸡形成100%完全保护（不发病、不致死、不排毒）;在病毒攻击前,灭活疫苗（H5N1亚型,Re\|1株）、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（H5亚型）、禽流感、新城疫重组二联活疫苗（rLH5\|1株）以及禽流感DNA疫苗（H5亚型,pH5\|GD）所诱导的HI抗体平均水平分别为875log2、6.5log2、5.13log2和7.88log2。新型的基因工程疫苗具有良好的免疫保护性,已经或将在H5亚型HPAIV的防治实践中起到有益的补充作用。     

鸡痘病毒载体多价基因工程疫苗及禽流感等亚单位疫苗研制

一、项目简介及技术创新该项目主要是应用我国动物疫病及免疫预防中的问题,迫切需要用更新、更好、效率更高的疫苗来完善疫病防制体系,最终达到净化的目的而确定的。为了研制与现有常规疫苗免疫保护效果更加安全的鸡痘病毒活载体疫苗及其相配套的鉴别诊断技术,我们主要选择有代     

表达禽流感病毒血凝素基因的重组禽痘病毒的构建

 为构建表达禽流感病毒 ( AIV)血凝素 ( HA)基因的重组禽痘病毒 ,将禽痘病毒启动子LP2 EP2驱动的 H7亚型 AIV HA基因 c DNA和大肠杆菌 Lac Z基因插入禽痘病毒疫苗株 F- 0 1 7的复制非必需区。经蓝斑筛选后 ,对重组病毒又进行了 3次蚀斑克隆。以不同代次重组禽痘病毒核酸为模板 ,利用 H7亚型 AIV HA基因特异的引物进行聚合酶链式反应 ,均扩增出 1条特异的1 .7kb DNA条带。收集不同代次的重组禽痘病毒细胞培养物进行免疫斑点试验 ,均检测到 HA蛋白 ,表明 H7AIV HA在重组禽痘病毒中获得了成功表达。该重组禽痘病毒的构建为 AIV病毒活载体疫苗的研制奠定了基础     

H9亚型禽流感病毒血凝素基因重组禽痘病毒的构建

【目的】获得表达H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组禽痘病毒。【方法】将含禽痘病毒启动子LP2EP2驱动的HA基因,插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组转移载体pSY681/HA。用脂质体将其转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达HA的重组禽痘病毒rFPV-HA。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选后,对重组病毒进行多次蚀斑克隆,并用间接免疫荧光法对感染重组病毒鸡胚成纤维细胞中HA的表达产物进行鉴定。【结果】以重组禽痘病毒DNA为模板,利用HA基因特异引物进行PCR,扩增出1条约1.7 kb左右的带。以间接免疫荧光法证实重组禽痘病毒能表达HA。【结论】成功构建了表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组禽痘病毒,且构建的重组禽痘病毒能表达具有生物学活性的HA。     

两株H9亚型禽流感病毒HA基因序列分析

采用Pharmacia的TimesavecDNAsynthesisKit结合RT-PCR方法，测定从鸡中的分离的2株H9亚型禽流感病毒(AIV)的HA全基因cDNA序列。结果表明这2株AIV和从香港地区鸡、鹌鹑中分离的3株H9N2亚型的AIV的亲源关系很近，HA的氨基酸同源性全部高于95％，可能是来源于同一毒株；而与2株从火鸡中分离的H9N2亚型的AIV的来源不同。     

禽流感病毒H9N2亚型HA基因的序列分析

试验对1株H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因进行扩增、克隆,然后对毒株的HA基因进行阳性克隆鉴定。测序结果表明:所扩增的HA基因全长1 683 bp,编码560个氨基酸;该毒株的裂解位点的氨基酸序列为R-S-S-R,属于低致病力毒株,该毒株有7个潜在糖基化位点,受体结合位点的氨基酸分别为YWT-NVLY,左侧壁氨基酸为NGQQG,右侧壁为GTSKA。将该毒株与国内一些参考毒株的HA基因序列进行比较分析,结果表明,核苷酸与氨基酸同源率较高,核苷酸同源率为93.0%~97.3%,氨基酸同源率为95.4%~96.6%,亲源关系比较近;与韩国毒株核苷酸和氨基酸同源率分别为83.3%和87.3%,亲源关系比较远。     

AIV F株HA和NA全基因的扩增及序列比较

根据禽流感病毒（AIV）各基因片段两端保守区序列设计锚引物,应用cDNA末端快速扩增法获得了AIV分离株A/Chichen/Shanghai/F/98(N9N2)的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）全长基因。15个毒株的HA和NA序列比较结果表明：F株与Chicken/Beijing/1/94、Duck/HongKong/Y280/97同源率较高,为94.4%～97.4%,但与香港人流感病毒HongKong/1073/99、HongKong/1074/99及Quail/HongKong/G1/97同源率较低,为90.3%～91.9%。F株与Duck/HongKong/Y280/97的NA基因不但同源率高达97.4%,而且均在205位核苷酸之后缺失9个核苷酸。另外,30个毒株的HA基因cDNA比较结果显示,最后46个氨基酸的编码序列高度保守。     

荧光蛋白标记表达H6亚型禽流感病毒血凝素基因

研究构建了H6N2亚型AIV的核酸疫苗表达载体,以绿色荧光蛋白基因作为报告基因,构建了HA与报告基因的融合基因,并克隆于pAVX1表达载体,再经脂质体转染BHK细胞进行体外表达试验.构建的表达载体pAVX1-H6A-GFP酶切鉴定已克隆上融合基因;体外表达试验中,脂质体转染24 h后出现微弱荧光,48 h后见较强的荧光表达,从而成功实现了用荧光蛋白标记表达了H6亚型禽流感病毒血凝素基因.     

实验性鸡大肠杆菌病的免疫组化检测

用致病性大肠杆菌 O1 8分离株和 /或低致病性禽流感病毒 (Mildly pathogenic avian influenza virus,MPAIV)接种 1 0～ 1 2日龄 SPF鸡 ,细菌接种后 1～ 96h对试验鸡的气管、肺、气囊、胸腺、法氏囊、脾脏、肝脏和肾脏的石蜡切片进行间接酶标抗体染色 ,发现大肠杆菌接种组、混合接种组的气管、肺在接种后 1 h可检测到细菌抗原 ,混合接种组检测到的细菌更多 ,存在时间更长。结果表明 :气管、肺和气囊是鸡大肠杆菌定居的场所 ;MPAIV可延长细菌在气管、肺和气囊中定居的时间 ,使鸡大肠杆菌病进一步加重     

禽流感病毒H5,H7,H9亚型多重RT-PCR检测方法的建立

依据GenBank中亚洲流行株禽流感病毒(AIV)H5,H7,H9亚型血凝素基因及M基因序列保守区域设计特异性引物,利用多重反转录聚合酶链式反应技术建立了AIV及H5,H7,H9亚型的检测方法.该方法能一次性检测出AIV保守区域M基因的同时,直接区分H5,H7,H9亚型.对新城疲病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒等特异性检测均为阴性.样品经100倍稀释后仍能检出.     

H5N1亚型禽流感病HA1基因的克隆测序与表达

提取禽流感病毒液中RNA,根据GenBank中收录的禽流感病毒(AIV)H5N1亚型的血凝素(HA)基因序列设计并合成了1对引物。RT-PCR扩增出HA全基因,并克隆到pMD18-T载体,对重组质粒进行酶切鉴定及序列测定。与GenBank收录的其他AIV H5N1亚型的HA基因进行序列比较分析,同源性达96%~99%。从HA基因序列中截取HA1基因,亚克隆到表达质粒pET-28a中构建HA1基因原核表达质粒,转化E.coliBL21(DE3)细胞,在IPTG诱导下表达出HA1蛋白,所表达的蛋白质分子质量约为37~40ku。该研究为进一步开发用于禽流感抗体检测的抗原蛋白打下了基础。     

一步法复合RT-PCR鉴别ND强毒与AI病毒的研究

根据新城疫病毒（NDV）融合蛋白和禽流感病毒（AIV）核蛋白的核酸序列设计2对引物,对NDV和AIV的特异扩增片段分别为156bp和219bp,建立了同时检测强毒力NDV和AIV核酸的一步法复合RT—PCR。试验中未能检出弱毒力NDV,IBV,IBDV,REV,REOV及SPF鸡肌肉组织的RNA,从不同年代分离的16个NDV强毒株全为阳性而NDV弱毒株全为阴性。经验证,复合引物与单一引物的扩增效率一致,能够检出NDV和H;亚型AIV的最低病毒量分别为10^3.7EID。和10^3.9EID50。试验结果表明,此次建立的一步法复合RT—PCR特异、敏感,适用于强毒力NDV和AIV．感染的快速鉴别。