不同凝固酶基因型牛源金黄色葡萄球菌主要致病因子的检测及分析

采用PCR的方法对不同凝固酶基因型的30株奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的主要致病因子进行检测，包括α溶血素（α-hemolysin）、β溶血素（β-hemolysin）、白细胞毒素F（LukF）、白细胞毒素S（LukS），结果显示：在28株分离株中检测到LukF和LukS；在8株和3株分离株中检测到β、和α溶血素，其分别占分离株的93％、26．7％和10％。这些致病因子在各基因型菌株间的分布并不表现出相关性，而是广泛的分布在各个基因型菌株间。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌毒力因子及荚膜基因的PCR检测

为研究金黄色葡萄球菌(S.aureus)的因型特征,本实验利用聚合酶链式反(PCR)方法,对S.aureus的3个标准株和30个临床分离株的凝集因子A、凝固酶、溶血素等33种致病因子进行了检测.结果表明各分离株在毒力因子方面存在一定差异.这些差异的检测将为进一步研究S.aureus的致病性和有效防治提供参考.     

猪源金黄色葡萄球菌分离鉴定及16srRNA基因遗传进化分析

从湖南省养猪场采集猪拭子和肺脏300份进行金黄色葡萄球菌(S.aureus)分离.用生化试验和PCR进行鉴定;选择5株分离菌进行遗传进化分析.结果显示,所有分离株触酶试验、糖发酵试验、VP试验、溶血试验和耐热核酸酶试验均为阳性.92.3%的分离株血浆凝固酶试验为阳性.PCR鉴定均为阳性.分离株16s rRNA和nuc部分基因片段与Genbank公开的相关序列相似性分别为98.0%以上和99.0%以上.5株分离株与S.aureus GHA10等处于同一进化分支.S.aureus分离率21.67%.肺脏、拭子、母猪和仔猪分离率分别是21.52%、21.79%、19.71%和23.41%.本研究结果对湖南地区S.aure-us致病性、耐药性和耐药机制的研究提供了素材.     

长春部分地区犬猫源葡萄球菌的高通量测序分析

为了解长春地区犬猫源金黄色葡萄球菌(Staphylococcu saureus,S.aureus)和伪中间型葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius,SP)耐药基因和毒力基因携带情况,利用高通量测序技术对17株S.aureus与38株SP所携带的耐药基因与毒力基因进行分析,根据Kirby-Bauer纸片扩散法的结果分析耐药基因型与表型的关系,同时进行了MLST分型。结果表明S.aureus和SP对常规抗菌药物表现中介或耐药,但对呋喃妥因敏感率为100%;β-内酰胺类耐药基因bla_Z检出率较高,分别为100%和57.9%;各有1株同时携带bla_Z和bla_NDM;S.aureus中检出2株携带磷霉素类耐药基因fosA;SP中检出21株携带多药耐药基因cfr;各检出3株携带多药外排耐药基因mdfA;共检出4株MRSA和11株MRSP;优势ST型分别为ST25和ST1430;在大多数分离菌中携带有γ-溶血素hlgB、黏附素clf、fnb、杀白细胞素LukF-PV、LukS-PV等毒力基因。分离株耐...     

湖南部分地区乳源金黄色葡萄球菌耐药性及溶血性分析

为调查湖南省部分地区奶牛场生鲜乳源金黄色葡萄球菌的耐药性及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的检出情况，同时调查金黄色葡萄球菌溶血素基因型与溶血表型的分布情况及二者的关系。采用肉汤稀释法对分离自湖南省部分地区奶牛场生鲜乳的54株金黄色葡萄球菌进行18种常见抗菌药物耐药性检测，采用绵羊血琼脂平板检测细菌溶血性，并采用PCR方法扩增分离菌株mecA基因及5个溶血素基因。结果显示，54株金黄色葡萄球菌均表现不同程度的耐药，耐药谱型达21种；21株金黄色葡萄球菌表现为多重耐药，最高耐药重数为9重；对青霉素耐药最严重，耐药率达85.19%,对头孢西丁、苯唑西林、克林霉素、庆大霉素及大环内酯类药物(红霉素、替米考星)耐药率在20%～30%之间，对多西环素与万古霉素敏感；从24株分离菌中检出mecA基因，鉴定为MRSA。54株分离株在羊血琼脂平板上主要以β和γ溶血为主，α、β及γ溶血率分别为12.9%、44.4%和42.6%;各溶血素基因检出率分别为98.1%(hla)、94.4%(hlb)、96.3%(hld...     

牛源抗金黄色葡萄球菌β溶血素单链抗体的鉴定及其生物学特性

β溶血素(β-hemolysin,Hlb)在金黄色葡萄球菌感染奶牛乳腺的致病过程中起到了重要的作用,但是关于牛源抗β溶血素的免疫制剂研究较少。本研究首先以金黄色葡萄球菌ATCC25923的DNA为模板,利用PCR技术扩增编码β溶血素的基因hlb,构建原核表达质粒pET32a-hlb,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达重组Hlb蛋白。以纯化的重组Hlb蛋白为包被抗原,从牛源噬菌体单链抗体表达文库中筛选到了一株针对β溶血素高亲和力单链抗体(single-chain variable fragment, scFv),通过构建原核表达质粒pET32a-scFv在大肠杆菌Transetta中诱导表达。结果表明,重组Hlb蛋白具有良好的溶解奶牛红细胞的能力,抗β溶血素单链抗体可以显著抑制重组Hlb蛋白和金色葡萄球菌培养物上清的溶血作用。本研究一方面为研制抗金色葡萄球菌所致奶牛乳腺炎新型抗体制剂提供参考,另一方面也为深入研究β溶血素在金色葡萄球菌致病过程的作用奠定基础。     

我国部分地区奶牛乳房炎病例中金黄色葡萄球菌血清型及毒力调查

为了解我国奶牛乳房炎病例中金黄色葡萄球菌(S.aureus)流行血清型和不同血清型菌株的毒力情况,本研究采用玻板凝集和双重PCR方法分别对北京、山西、内蒙古、山东、浙江和新疆奶牛乳房炎乳样中分离的191株S.aureus进行血清分型并从各血清型中随机选取100株菌以小白鼠进行毒力测定.结果表明:这些地区牛源S.aureus中,336PS型为流行血清型,占60.2％(115/191),CP8型占19.4％(37/191),CP5型占11.5％(22/191),未分型菌株占8.9％(17/191).毒力测定显示:336PS、CP8和CP5型菌株中强毒力菌株分别占65.1％、62.9％及61.9％,未分型菌株中强毒力菌株为22.2％.该调查为我国奶牛乳房炎S.aureus疫苗菌株的筛选提供了依据.     

高寒地区奶牛乳房炎凝固酶阴性致病葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析

为调查高寒牧区引起奶牛乳房炎的凝固酶阴性致病葡萄球菌流行现状及耐药情况,本研究对呼伦贝尔地区3个规模化奶牛养殖场采用加州乳房炎测试法(CMT)进行高体细胞牛脂病检测,并采集330份牛奶样品,应用PCR方法、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型和药敏试验等对样品中的葡萄球菌进行分离鉴定和耐药性分析。结果显示,该地区隐性乳房炎发病率达47.8%,共分离和鉴定出9种葡萄球菌60株(34.5%);60株葡萄球菌分为41个克隆谱型;60株葡萄球菌对青霉素和林可霉素的耐药率较高,分别为40.0%(24/60)和50.0%(30/60),表明这两种药是治疗乳房炎常用药物。本研究为高寒地区致病葡萄球菌引起的奶牛乳房炎临床合理用药及对病原菌的防控提供实验依据和指导。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌对四环素耐药性分析

为分析奶牛乳房炎中分离的金黄色葡萄球菌(S.aureus)四环素耐药机制,本研究以K-B法和常量肉汤法测定最低抑菌浓度(MIC)值,并对26株奶牛乳房炎S.aureus进行四环素耐药表型检测及加入利血平后的MIC值检测;以PCR检测四环素耐药基因tetM、tetO、tetL和tetK,对扩增产物进行序列分析。检测结果表明:26株菌株中,7株对四环素耐药,19株敏感;利血平能显著降低部分耐药株对四环素的MIC值;在7株耐药菌株中,1株检测出tetM基因,6株检测出tetK基因,没有检测到tetL和tetO基因;tetK基因与S.aureus质粒pT181同源性为100%,tetM基因与转座子Tn916序列同源性为99.9%。实验研究表明,26株奶牛乳房炎S.aureus四环素耐药表型与耐药基因相符,耐药机制以外排蛋白介导为主,并在国内牛源S.aureus中首次检测到tetK基因。     

兔源金黄色葡萄球菌的耐药性及耐药基因分析

为了解四川地区规模化兔场金黄色葡萄球菌(S.aureus)的耐药情况,本研究从四川地区部分规模化兔场共分离鉴定出41株S.aureus,采用纸片扩散法对分离株进行了耐药表型鉴定,同时采用PCR方法对相关耐药基因进行了检测。药敏试验结果显示:分离株对β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类和大环内脂类药物的耐药率分别为87.80%、97.56%、78.05%和56.10%,对多肽类、喹诺酮类及磺胺类耐药率较低。耐药基因检测结果显示:所有分离株均检测到耐药基因,并且29株分离株具有多重耐药性,其中耐药基因mec A、tet、erm、aac(6')/aph(2')、ant(4',4')及aph(3')-III的检出率分别为75.61%、70.73%、46.34%、92.68%、80.49%及53.66%。结合耐药表型与耐药基因结果分析显示兔源S.aureus的耐药表型与耐药基因检出率基本呈正相关。本研究通过检测41株兔源S.aureus对临床常用抗生素的耐药性及相关耐药基因,初步掌握了四川地区规模化兔场S.aureus的耐药情况,为该地区规模化兔场预防及治疗葡萄球菌病临床合理用药提供了依据。     

世界奶牛乳房炎研究发展态势图谱分析

为了分析近些年来世界奶牛乳房炎研究领域的最新研究进展、研究热点和未来发展趋势,基于web of science数据库中2001-2018年发表的奶牛乳房炎研究文献7 470篇,利用VOSviewer软件绘制该研究领域的机构合作网络、作者合著网络、关键词热度图谱、关键词聚类图谱、参考文献共被引图谱,对该研究领域的研究热点和发展态势进行分析。结果表明,从2001年-2017年期间,国际奶牛乳房炎领域发文量总体趋势不断上升,但在2004年、2006年、2007年和2014年发文量较前一年有下滑趋势;全球研究奶牛乳房炎主要国家及机构主要集中在美洲和欧洲,大学是主要研究机构,发文量最多的核心作者大多集中在比利时、荷兰和美国,中国在该领域仍处于劣势;该领域研究的热点主要集中于乳房炎与经济效益的关系、病原微生物分离鉴定、耐药性和致病机理、疫苗免疫和病原菌检测方法等。奶牛隐性乳房炎的诊断及实验动物乳腺感染模型的建立可能会是未来奶牛乳房炎研究领域的焦点。     

双氯芬酸钠注射液的肌肉刺激性试验

考察双氯芬酸钠注射液的肌肉刺激性,为临床安全用药提供参考。采用同体左、右侧自身比对法,对日本大耳白兔进行股四头肌注射给药,经折算,供试品双氯芬酸钠注射液给药剂量为14.39mg/kg,等体积9mg/mL氯化钠注射液用作阴性对照,每天1次,连续3d。自给药起到给药后第19天,观察试验兔的一般状况,进行注射部位解剖及组织病理学检查,综合评价其肌肉刺激性。双氯芬酸钠注射液注射后1周内对股四头肌有较强的刺激性,在给药19d后肌肉损伤可以完全恢复。双氯芬酸钠注射液符合我国《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》中注射剂对于肌肉刺激性的要求,可用于肌内注射。     

病原菌分子生物学诊断技术及其在奶牛子宫内膜炎诊断中的应用进展

子宫内膜炎(Endometritis)是奶牛常见的生殖系统疾病,影响奶牛的生产性能,给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失。奶牛子宫内膜炎多由病原菌混合感染,若能及时、准确地检测出致病菌,对该病的综合防控至关重要。目前,奶牛子宫内膜炎病原菌诊断技术的相关报道甚少,为进一步研究开发奶牛子宫内膜炎病原菌诊断技术,论文对目前应用于其诊断的PCR技术、环介导等温扩增(LAMP)技术、基因芯片技术等的研究进展进行了综述,并对其应用情况和优缺点进行了分析与总结,以期为奶牛子宫内膜炎病原菌诊断技术研究提供参考。     

茶树精油兽用消毒剂中1,8-桉叶素和松油烯-4-醇检测方法的建立

通过检测茶树精油兽用消毒剂中1,8-桉叶素和松油烯-4-醇的含量,并建立茶树精油中1,8-桉叶素和松油烯-4-醇的气相色谱检测方法,为茶树精油新制剂的质量标准研究提供理论依据。采用水蒸气蒸馏法先将茶树精油兽用消毒剂中的茶树精油提取出来,再用GC法测定提取的挥发油中1,8-桉叶素和松油烯-4-醇的含量。茶树精油兽用消毒剂不同批次中1,8-桉叶素和松油烯-4-醇含量保持稳定;1,8-桉叶素在0.013mg/mL～0.41 mg/mL之间具有良好的线性关系(r=0.999 98),松油烯-4-醇在0.175 mg/mL～5.575mg/mL之间具有良好的线性关系(r=0.999 93),1,8-桉叶素的平均加样回收率为99.19%,RSD为1.89%(n=6),松油烯-4-醇的平均加样回收率为102.58%,RSD为1.45%(n=6)。该方法能够简便、准确、快速的测定茶树精油兽用消毒剂中1,8-桉叶素和松油烯-4-醇的含量,可为茶树精油兽用消毒剂的质量评价提供依据。     

利用亚硝基胍诱变和高通量测序技术分析疯草内生真菌产SW生物合成通路

阐明产苦马豆素(swainsonine,SW)疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis中SW的生物合成通路,可以为生物发酵获得大量SW用于抗肿瘤应用和疯草的脱毒育种奠定理论基础和技术支撑。采用不同作用剂量的化学诱变剂亚硝基胍,在28℃,120r·min^-1与Alternaria Section Undifilum oxytropis孢子悬液分别作用5、10、15、20、25、30min,选取生长良好的菌株接种PDA培养基,连续培养发酵24d,应用α-甘露糖苷酶活性分析法检测菌丝及发酵液中SW含量,评价其传代及产SW稳定性。联合使用玻璃珠、液氮破壁法预处理菌丝,选用真菌基因组提取试剂盒提取原始菌株和突变株D4基因组DNA,经纯化、酶切、构建菌株DNA文库,并应用荧光定量PCR法检测评价文库构建质量,利用Ion torrent PGM^TM测序平台进行突变株和原始株高通量全基因组测序。结果表明,经化学诱变成功获得1株突变株D4,利用MIRA软件对高通量测序序列拼接、组装,分别获得突变株D4和原始株相关基因组片段19、21条,经BLAST、GO分析,注释到AlternariaSection Undifilum oxytropis生物合成SW的关键基因SwnK、SwnH2、SwnH1、SwnR和关键酶putative amino acid transporter、pyrroline-5-carboxylate reductase、formate/glycerate dehydrogenase catalytic、saccharopine reductase-like protein,并结合KEGG数据库,预测了AlternariaSection Undifilum oxytropis产SW可能的生物合成通路。本研究为揭示AlternariaSection Undifilum oxytropis生物合成SW机制作出了新的探索尝试。     

阳起石、菟丝子与淫羊藿对肾阳虚大鼠性激素及其受体表达的影响

为了比较阳起石、菟丝子、淫羊藿对肾阳虚模型大鼠的治疗效果,通过肌肉注射氢化可地松制作了肾阳虚大鼠模型,并在3种药物治疗前后分别对体质量、脏器指数、子宫角长度、子宫中段外径、激素水平及其受体基因的表达情况进行了比较研究。结果显示,阳起石、菟丝子、淫羊藿均能够显著增加大鼠的肝脏指数,提高大鼠黄体生成素、卵泡刺激素、雌激素及激素受体的表达水平,其中阳起石与菟丝子对激素分泌的调节优于淫羊藿,而阳起石与淫羊藿对激素受体表达的调节优于菟丝子。结果表明,这3种药物能通过促进激素分泌和激素受体的表达来改善肾阳虚动物子宫和卵巢的功能,且3种药物的疗效各有优势。     

动物机体胆固醇代谢调控机制研究进展

胆固醇的代谢,即胆固醇的合成和转化过程,尤其是胆固醇和胆汁酸之间的相互转化是胆固醇降解的主要通路。胆固醇的代谢和调控紊乱,以及高胆固醇血症所引起的如动脉粥样硬化等心血管疾病的研究越来越多,同时治疗这种高胆固醇血症相关疾病的药物也相继发现。论文通过对胆固醇的代谢途径、调控机制、高胆固醇疾病及其治疗药物进行综述,对胆固醇的来源、去路以及该代谢过程中的调控机制进行较为全面的探讨,为与胆固醇相关疾病及其治疗研究提供依据。     

菪可轮蒲水煎液对多杀性巴氏杆菌体内外抑菌活性研究

研究菪可轮蒲水煎液对多杀性巴氏杆菌的体内外抑菌活性作用。用传统水煎法制备菪可轮蒲水煎液,用HPLC法测定菪可轮蒲水煎液中龙胆苦苷浓度,并用龙胆苦苷浓度标定复方药物浓度,分别采用牛津杯法和宏量肉汤稀释法测定菪可轮蒲水煎液对多杀性巴氏杆菌的抑菌圈直径和最小抑菌浓度(MIC),通过建立死亡率为75%的多杀性巴氏杆菌体内感染小鼠模型,测定浓度为0.0232mg/mL的菪可轮蒲水煎液,在感染前和感染后给药方式下,分别给予0.1、0.3、0.5mL药物时对小鼠多杀性巴氏杆菌感染的预防和治疗作用。结果显示,菪可轮蒲水煎液浓度为0.0464mg/mL时,对多杀性巴氏杆菌的抑菌圈平均直径为13.5mm,MIC值为0.0029mg/mL,经病理剖检、细菌镜检、全自动微生物鉴定及药敏系统(VITEK2COMPACT)细菌鉴定,表明死亡率为75%的多杀性巴氏杆菌体内感染小鼠模型建立成功,且预防组各组和治疗组各组小鼠死亡率依次为58.3%、41.7%、83.3%、66.7%、58.3%和91.7%。综合以上试验结果,菪可轮蒲水煎液对多杀性巴氏杆菌具有良好的体内外抑菌活性,且其预防作用较治疗作用明显。     

3种固相萃取柱在测定牛血清样品中乙酰氨基阿维菌素前处理中的比较研究

初步评价在乙酰氨基阿维菌素药动学前处理中3种固相萃取柱对乙酰氨基阿维菌素的净化、萃取效果。首先在空白胎牛血清中加入一定量的乙酰氨基阿维菌素标准溶液,经色谱甲醇提取后,分别经Agilent公司、Waters公司和Agela Technologies公司的C₁₈SPE柱进行萃取(分别简称A固相萃取柱、W固相萃取柱、AT固相萃取柱),再经N-甲基咪唑和三氟乙酸酐衍生化,最后用超高效液相色谱-荧光检测器进行测定。与此同时,将等量的乙酰氨基阿维菌素标准溶液进行衍生化,用超高效液相色谱-荧光检测器进行测定,其结果作为对照。以绝对回收率作为评价3种SPE柱净化、萃取EPR效果的标准。结果显示,含有EPR的胎牛血清经A固相萃取柱萃取后,EPR峰形尖锐对称且无明显杂质峰,其绝对回收率为80.79%;经W固相萃取柱萃取后,乙酰氨基阿维菌素峰形尖锐对称且无明显杂质峰,其绝对回收率为83.61%;经AT固相萃取柱萃取后,乙酰氨基阿维菌素峰形尖锐对称且无明显杂质峰,其绝对回收率仅为64.20%。相对于A与AT固相萃取柱,Waters公司的C₁₈SPE柱萃取EPR的效果更好。研究结果为后期乙酰氨基阿维菌素的药物代谢动力学试验奠定了基础。     

利用康奈尔净碳水化合物-蛋白质体系与聚类分析技术评价油菜秸秆营养价值

本试验旨在利用康奈尔净碳水化合物-蛋白质体系(CNCPS)与聚类分析技术对油菜秸秆营养价值进行评定与分类,并探究各类油菜秸秆在瘤胃中的降解规律。试验于甘肃省、青海省、宁夏回族自治区3省18县(区)采集油菜秸秆样品125份,对其进行营养成分测定,用CNCPS 6.5计算样品中碳水化合物和蛋白质各组分的含量,以中性洗涤纤维(NDF)、粗蛋白质(CP)含量为分类指标对油菜秸秆进行聚类分析,将125份油菜秸秆分为3类(第1类:NDF含量平均值为55.75%、CP含量平均值为12.33%;第2类:NDF含量平均值为62.06%、CP含量平均值为5.60%;第3类:NDF含量平均值为72.72%、CP含量平均值为4.59%),并将这3类油菜秸秆进行原位降解试验。结果显示:1)油菜秸秆常规营养成分含量变化范围为干物质(DM)91.20%～96. 39%、CP 2. 06%～15. 92%、粗灰分(Ash) 4. 12%～12. 46%、粗脂肪(EE) 0. 27%～9.84%、NDF 50. 51%～82. 12%、酸性洗涤纤维(ADF) 39. 76%～65. 38%、碳水化合物(CHO)69.16%～92.07%、中性洗涤不溶性蛋白质(NDIP) 0. 50%～2. 10%、酸性洗涤不溶性蛋白质(ADIP) 0.19%～1.70%。2) CNCPS中油菜秸秆碳水化合物各组分含量变化范围为不可利用纤维(CC) 16.16%～63.66%、可利用纤维(CB2) 11.23%～58.62%、非结构性碳水化合物(CNSC) 12.03%～43.00%、糖类(CA) 12.03%～43.00%。3) CNCPS中油菜秸秆蛋白质各组分含量变化范围为非蛋白氮(PA) 0.01%～6.04%、溶于缓冲液中的真蛋白质(PB1) 0.01%～4.31%、中性洗涤可溶性蛋白质(PB2) 0.07%～5.18%、酸性洗涤可溶性蛋白质(PB3) 0.01%～1.26%、不可利用氮(PC) 0.19%～1.70%。4)原位降解试验结果显示,3类油菜秸秆DM 24 h降解率和有效降解率分别为36.8%和31.8%、24.5%和21.9%、19.1%和20.6%。由上可知,油菜秸秆中含有较多的不可利用的碳水化合物和蛋白质,需进一步通过饲料添加剂来提高反刍动物的消化利用。