H2O2对镉胁迫下黄瓜种子萌发及生长的影响

以黄瓜品种“津春7号”为材料,研究了H2O2对Cd2+胁迫下黄瓜种子萌发、幼苗生长的影响.结果表明:Cd2+浸种导致黄瓜种子发芽势、发芽指数和活力指数下降,幼苗芽和根生长受抑制.外源H2O2提高了Cd2+胁迫下黄瓜种子发芽势、发芽指数和活力指数,提高了Cd2+胁迫下黄瓜幼苗芽长、根长和侧根数,增加了黄瓜幼苗的生物积累量,部分缓解了Cd2+胁迫对黄瓜种子萌发和幼苗生长的抑制作用,且外源H2O2对Cd2+胁迫下黄瓜幼苗生长的促进作用随着H2O2浓度的增加而增大.     

拟南芥AT2G14260基因功能及其表达特异性分析

拟南芥AT2G14260基因编码脯氨酸亚氨基肽酶，基因芯片表达谱数据显示该基因响应高盐、低温等非生物胁迫。为研究其功能和表达特性，本研究采用野生型和突变体植株pip-1进行低温、干旱和盐胁迫处理，结果显示在正常培养基中野生型与pip-1植株表型没有区别。而在逆境处理下pip-1植株的根比野生型明显短，且在干旱胁迫下，突变体的叶子比野生型植株明显变黄萎蔫。在正常环境、冷、干旱、盐胁迫下，野生型植株脯氨酸含量的平均值分别是突变体的1.11、1.23、1.10和1.34倍，这说明AT2G14260基因对提高非生物胁迫的耐性具有一定的作用。同时分离了该基因的启动子，构建了表达GUS基因的载体并转化拟南芥，结果表明该启动子在正常环境中不表达。胁迫处理时从两叶期开始在根、叶、茎中表达，到达花期后，干旱处理下的花瓣、花枝和冷处理下的花柱头中也有表达。GUS相对活性试验也证明对胁迫的响应能力。可见AT2G14260基因启动子是逆境胁迫诱导表达启动子，同时具有组织表达特异性，因此，AT2G14260基因及其启动子在转基因工程育种中具有潜在的应用价值。     

表达豌豆过氧化锰歧化酶转基因水稻的耐旱性研究

本试验研究了一种重要抗氧化酶——过氧化锰歧化酶在水稻耐旱性方面的作用。在氧化胁迫诱导SWPA2启动子的控制下，采用农杆菌介导转化法，我们将豌豆的过氧化锰歧化酶（Mn SOD）转到了水稻叶绿体中，培育出了耐旱水稻植株。在PEG6000诱导的干旱胁迫条件下，转基因水稻植株（T1）中豌豆MnSOD进行了功能表达。在经聚乙二醇（PEG）处理后，不管是否置于甲基紫精（MV）中，转基因叶片切片的电解质渗漏与原始类型（WT）相比都减少了，这说明转基因植株更抗MV或PEG诱导的氧化胁迫。当用PEG处理后，转基因植株还表现出所受损伤较少的特点（采用净光合率测定）。我们的研究结果表明SOD是植物叶绿体中ROS清扫机制的关键性成分，MnSOD的表达可改善水稻耐旱性。     

过量表达棉花GhACO2基因增强拟南芥抗逆性研究

乙烯在植物生长发育过程中起到非常重要的作用,ACO基因对于细胞内乙烯的合成起到关键的作用,然而乙烯在植物响应非生物胁迫方面的功能有很大的未知性。研究通过PCR方法从棉花基因组中克隆获得GhACO2基因,构建了植物过量表达载体p35S::GhACO2,通过花序侵染法转化拟南芥,用卡那霉素对转化植株进行初步筛选,进一步对阳性植株进行PCR和GUS组织化学分析检测,结果表明,在转基因拟南芥叶片中有很强的GUS活性,茎和根有微量表达;GhACO2基因已经整合到拟南芥基因组中,成功获得转基因拟南芥。经过纯合筛选后获得转基因T2代拟南芥植株,利用NaCl和PEG6000对T2代植株进行盐胁迫和干旱胁迫处理,结果显示,与野生型拟南芥相比,转GhACO2基因拟南芥对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性显著性的增强。研究结果为进一步探讨GhACO2的生物学功能和利用基因工程技术进行转基因育种质奠定了基础。     

外源H2O2对孕穗期转C4PEPC水稻及原种光合特性的影响

为阐释转C4 PEPC光合基因水稻过氧化物胁迫条件下的光合生理特性,以转PEPC基因水稻(PC)、未转基因原种(Kitaake)为材料,运用Li-6400便携式光合仪观测其在不同浓度外源H2O2处理下的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)以及水分利用率等光合参数的变化.结果发现,与未用H2O2处理的PC相比,PC在0.5~5 mmol/L H2O2浓度处理下,其Pn在不同光强下均表现下降,与其Gs的下降一致,这个抑制过程随光强的增加而减弱,而50 mmol/L H2O2处理下PC,虽Gs增加,但是其Pn并没有增加,表现不同H2O2的浓度效应;而未转基因水稻则没有上述表现,推测PC可能通过低浓度的H2O2参与气孔运动的调节,从而影响其光合特性.     

水稻WRKY19基因启动子功能研究初报

利用已获得的水稻WRKY19基因启动子(OsW19p::GUS)的转基因植株进行研究，分析了OsW19p在T1代苗期时的诱导表达特性，GUS荧光测定结果表明：OsW19p的表达可被ABA(100 μmol/L)、SA(500 μmol/L)、高温(42℃)、低温(5℃)和伤处理增强；被2,4-D(1μmol/L)、NaCl(200 mmol/L)和PEG4000(25%)处理抑制；IAA(5 μmol/L)、MeJA(100 μmol/L)和紫外线照射处理对OsW19p的表达几乎没有影响。OsW19p在转基因植株根中的表达水平高于35s，但在叶片中低于35s。OsW19p在转基因水稻扬花期茎部中表达水平最高，其次是花、叶鞘和叶片，在根部表达水平最低。     

生长素异位合成对水稻根系构型的影响

生长素在调控植物根系发育上起着重要的作用。本研究利用根系特异表达的磷转运蛋白AtPht1;1的启动子驱动生长素合成基因OsYUCCA1,构建表达载体,通过农杆菌介导法转入水稻品种中花11,获得转基因阳性植株;根据Os YUCCA1基因在水稻根中的表达量高低将转基因植株分为强表达株系和弱表达株系。转基因植株与野生型对照相比,根系构型变化明显,不定根、侧根和根毛数目均增加,主根长度变短。强表达转基因株系的地上部分的生长发育也受到影响。我们的研究结果表明弱表达株系根系构型变化适中且地上部分生长不受影响,具有实际应用的潜力。     

玉米PLATZ基因GRMZM2G006585启动子的克隆及表达分析

高转录活性籽粒特异性启动子可调控目的基因在植物籽粒中特异性、高水平表达。为发掘玉米籽粒特异性启动子，以公开发表的玉米表达谱芯片数据为切入点，筛选出籽粒优势表达基因GRMZM2G006585,克隆其编码区上游约2 000 bp的DNA序列，命名为PZm2G006585。利用在线网站New PLACE和PlantCARE对其进行启动子顺式作用元件分析，发现其含有E-box、P-box等多个籽粒特异性相关元件，初步认为所克隆编码区上游序列为玉米来源的籽粒特异性启动子。为验证其功能，构建该启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的表达载体并进行植物遗传转化。转基因水稻的GUS组织化学染色结果表明，该启动子驱动外源基因表达模式为籽粒特异、胚优势表达；转基因拟南芥单拷贝株系T₃种子中GUS活性检测结果显示，PZm2G006585驱动的GUS活性为909.52 nmol/(min·mg)。籽粒特异性启动子PZm2G006585的发掘和功能验证为驱动目标基因在玉米、水稻等单子叶植物籽粒中特异性表达提供了候选启动子资源。     

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。     

梭梭HaFT-1、HaFT-9基因启动子克隆及胁迫响应分析

14-3-3蛋白是一类普遍存在于真核生物中的分子伴侣,研究表明梭梭14-3-3蛋白HaFT-1和HaFT-9功能与胁迫响应密切相关。为进一步分析HaFT-1和HaFT-9基因胁迫响应机制,本研究采用染色体步移技术扩增HaFT-1和HaFT-9基因5’端上游调控序列,分别获得961和879 bp启动子序列。序列分析表明二者启动子除含有基本的启动子核心元件外,还包含多种逆境响应元件。分别构建HaFT-1和HaFT-9基因启动子-GUS重组载体瞬时转化烟草、棉花、梭梭幼苗,GUS染色结果显示：二者启动子在正常生长条件或高温、脱水、NaCl胁迫及ABA处理下均能调控GUS表达,并且HaFT-1启动子对以上处理的响应更加明显;在高温胁迫下,梭梭幼苗中二者启动子调控的GUS表达具有组织特异性。RT-qPCR结果显示,在梭梭幼苗中,高温、脱水、NaCl胁迫及ABA处理下HaFT-1和HaFT-9基因表达趋势与以上GUS染色结果基本一致。本研究为进一步阐明HaFT-1和HaFT-9基因在胁迫响应中的作用机制提供了科学依据。     

对转蚕丝芯蛋白轻链基因棉花的分析

利用根癌农杆菌介导转化法,将棉纤维特异表达启动子GAE6-3A驱动的蚕丝芯蛋白轻链基因（FBN）转入陆地棉R15中。T₀代转基因再生株FNB基因PCR检测阳性率达70%。随机选取4个转基因株系T₁代材料的Southern杂交显示,3个为双拷贝插入、1个为单拷贝插入;Northern分析结果证实FBN基因在转基因棉纤维中表达。转基因后代的纯合选育主要以田间卡那霉素检测结合实验室内GUS组织化学检测进行,其中4个株系已获得了T₃代转基因材料,其他若干个转化子也获得T₁代和T₂代的不同材料。对6个转基因棉花株系后代纤维检测结果表明,蚕丝芯蛋白轻链基因对棉花纤维品质的影响主要体现于对纤维强度的改良。H18、H32、H34株系转基因棉花后代纤维强度较对照显著提高,其中H18纤维强度提高12.3%。     

生长素响应报告基因转化棉花及GUS检测

通过构建以GUS为报告基因的生长素响应表达载体的遗传转化,开展了棉花生长素的原位研究。经棉花叶片瞬时表达分析,证实该报告基因在棉花中有效。采用农杆菌子房注射法将该报告基因转化至湘杂棉21号后,经筛选检测,获得了3株阳性转基因棉花植株。对转基因棉花胚珠及花原基进行的GUS检测表明在棉花受粉前2 d(-2 DAP,Dayafter pollination)至受粉后2 d(2 DAP)的胚珠发育期间,棉花胚珠表面生长素水平呈现"V"形变化过程,且在受粉2 DAP后,GUS染色更集中分布在分化了的纤维细胞中。说明在棉花受粉前的胚珠发育早期,表层细胞中含有较高浓度水平的生长素,维持着表层细胞的持续分裂。而在胚珠表层纤维细胞分化期生长素浓度降低,GUS着色变浅。受精后,纤维细胞开始伸长突起,伸长的纤维细胞中有更强的GUS着色,证明分化了的纤维细胞中具有较高浓度的生长素分布,这可以促进纤维细胞的伸长生长。胚珠表层相邻细胞的低水平的生长素对棉花纤维细胞的分化突起可能起关键作用。对花原基的GUS染色观察,生长素主要集中分布在分化的花组织细胞分裂活跃的区域,表明生长素在促进花器官的发育和器官建成方面有重要作用。     

GUS基因和NPTⅡ基因表达的相关性及其在转基因棉花检测研究中的应用

利用农杆菌介导转化法,将含有35S启动子驱动NPTII基因和GUS基因以及棉纤维特异表达启动子E6驱动目的基因FB的植物表达载体转入到常规棉花R15中.重点分析了GUS基因和NPTII基因在愈伤诱导阶段、T0代及T1代转基因棉花中的表达情况.综合两个基因的表达来进行转基因棉花的阳性鉴定,可以为转基因棉花后代的纯合选育提供双重保障.7个转基因株系选育到T3代共获得株行51个,卡那霉素检测多数株行阳性率在90%以上,其中21个株行阳性率达100%.     

以谷蛋白GluA-2信号肽增强外源蛋白在转基因水稻胚乳中的表达与积累

提高外源蛋白在特定目标组织器官中的表达量是转基因植物研究与开发的核心技术之一。谷蛋白是水稻种子中最主要的贮藏蛋白,其表达具有严格的时空特异性。为进一步研究谷蛋白信号肽序列在指导基因表达中的作用,本研究克隆了水稻谷蛋白Glu A-2基因的启动子及其信号肽编码序列,并与GUS报告基因编码区融合,构建了分别含有和不含有信号肽的表达载体p13GG和p13GSG;经农杆菌介导法分别转入同一水稻品种中,获得了20多个独立转化子,PCR证明外源基因都已整合进了水稻基因组中。Northern杂交结果表明,融合Glu A-2信号肽编码序列可显著提高GUS基因在水稻胚乳中的转录;利用GUS特异的抗体进行Western杂交分析,显示该信号肽序列可显著提高外源蛋白在转基因水稻胚乳中的积累,但是其所指导表达的GUS蛋白在水稻胚乳中并没有表现出相应的活性,其机制有待进一步深入解析。相关结果对于水稻品质改良基因工程研究以及以水稻种子作为生物反应器高效表达外源蛋白具有重要的指导作用。     

转水稻OsSIK1基因玉米植株的获得及抗旱性分析

类受体激酶基因Os SIK1具有通过激活抗氧化系统,增强水稻对于干旱和盐胁迫抗性的作用。为了丰富可利用的作物抗旱基因,获得具有较高抗旱水平的玉米新种质,通过超声波辅助花粉介导法,将水稻类受体激酶基因Os SIK1导入玉米自交系郑58中,并对转化株进行卡那霉素筛选及T1、T2、T3的PCR及Southern Blotting杂交等分子检测,获得转化植株并在T3获得转基因纯合株系。对T3转基因玉米和非转基因玉米对照以16.1%的PEG模拟水分胁迫进行抗旱性分析。结果表明,与对照相比,在水分胁迫处理下,转基因玉米株系叶片相对含水量提高了7.4%~19.8%,叶绿素含量提高了11.3%~106.9%,SOD活性上升45.8%~93.4%,而转基因玉米叶片的相对电导率下降了35.4%~58.1%,MDA含量下降了25.7%~50.4%,说明转Os SIK1基因玉米植株抗旱性得到提高,其中,5个转化株系与对照在抗旱性方面有显著差异,且生长状况明显优于对照。综上所述,研究最终获得5个转Os SIK1基因玉米株系,并证明导入水稻Os SIK1基因可以提高玉米植株的抗旱性。     

棉花半乳糖基转移酶基因GhGalT1启动子的克隆及表达分析

糖基转移酶(glycosytransferase, GT)是催化活化的供体糖基转移到特异受体生成糖苷键的酶类, 在应答多种生物和非生物胁迫中起重要作用。本研究利用PCR技术从陆地棉品种Coker 312基因组中分离克隆了GhGalT1基因的启动子, 序列长度为539 bp, 命名为pGhGalT1。启动子分析软件PlantCARE分析表明pGhGalT1含有CAAT-box、TATA-box核心元件, 以及响应干旱、热、脱水、防御与胁迫应答的顺式作用元件MBS、HSE、MYCCONSE、TC-rich repeats和CGTCA-motif等。因此将pGhGalT1构建到启动子检测载体pBI101-GUS上, 形成pBI101-pGhGalT1-GUS融合表达载体, 以检测其启动子活性。通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥, 经卡那霉素抗性筛选及PCR检测成功获得阳性转基因植株。对T₃代转基因拟南芥进行组织化学染色分析显示该启动子主要在生长5~15 d的幼苗主根及侧根根尖表达, 在子叶及莲座叶边缘也有微弱表达。非生物胁迫和激素处理后的组织化学染色、GUS酶活性及GUS基因定量分析结果显示GhGalT1基因的启动子受盐、渗透胁迫和激素(6-BA、MeJA、BL)的诱导, 该结果为合理选用启动子改良作物提供理论依据。     

水稻抗白叶枯病基因Xa21转基因水稻及其杂交稻研究

用基因枪转基因技术将高抗白叶枯病的Xa21基因导入中国三系杂交稻恢复系(明恢63)和保持系(皖B)中，获得转基因水稻系，其中4个株系只含有Xa21基因，不含选择标记潮霉素抗性基因hph。筛选抗白叶枯病转基因纯合系，在田间种植6代，用PCR检测证明，Xa21基因能稳定遗传表达。用转基因水稻配制两系杂交稻，杂交组合F1含有Xa21基因     

Pib基因启动子内YTCANTYY暗诱导分子元件功能的转基因验证

用不同长度5′端缺失的Pib启动子驱动gus基因的水稻转基因植株, 系统研究了Pib启动子中分子元件YTCANTYY拷贝数目与该启动子启动活性和暗诱导性的关系。GUS组织化学分析结果表明, 含6个、3个和1个拷贝该分子元件的Pib启动子的转基因水稻愈伤组织在暗处理后均能在X-Gluc溶液中显示不同深浅的GUS蓝色, 而6个分子元件全部缺失的启动子片段的转基因愈伤组织不显现GUS蓝色。荧光定量分析结果表明, Pib启动子序列具有很强的器官特异性, 即便是长仅222 bp、不含YTCANTYY元件的5′端缺失体Pib启动子-gus构建的转基因植株, 其根部Pib启动子活性仍高于地上部器官。但其启动活性和暗诱导性都随启动子缺失片段的缩短即该分子元件拷贝数增加而提高。这些结果表明, YTCANTYY在Pib启动子序列中是一个暗诱导的功能性分子元件, 它赋予了启动子的暗诱导性, 至少在6个拷贝以内, Pib启动子的暗诱导活性与其拷贝数目呈正相关, 各个YTCANTYY分子元件的暗诱导活性可能是累加的。