PEPC过表达可以减轻干旱胁迫对水稻光合的抑制作用

为了明确磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)过量表达能否提高水稻的光合速率,测定了42个表达不同PEPC水平的转玉米PEPC基因水稻株系及对照(受体亲本中花8号)开花期和灌浆期的光合速率。结果表明,在水田条件下,转基因株系光合速率与未转基因对照相比没有明显差异;而在旱地条件下,转基因水稻的光合速率显著高于对照(27%和24%)。随机选取2个PEPC相对活性分别为10倍和25倍的转基因株系进行网室精确控水盆栽实验得到相似的结果。说明单纯导入PEPC并不能提高水稻的光合速率,而干旱胁迫下转基因水稻的光合优势可能是由于PEPC参与水稻的抗旱反应而减轻了干旱胁迫对光合作用的抑制作用。     

转ppc基因水稻苗期抗旱特性研究

通过C₄转基因技术改善C₃作物光合作用, 以期提高作物产量是国内外研究的热点之一。然而, 目前关于转磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因对水稻的光合作用、产量和抗旱性的影响及其调节机理仍不很清楚。本研究以T₄代转ppc基因水稻为材料, 进行产量和苗期抗旱性研究。结果表明, 在旱作栽培条件下, 两个转ppc基因株系(T1, T2)单株产量分别比未转基因的对照(WT)增产28%和42%, 分蘖增加27%和40%; T1和T2可维持较高的光合速率、气孔导度和水分利用效率; 干旱胁迫使超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量增加, T1和T2 SOD活性增幅(+25%)都显著高于WT(+9%), 而MDA含量增幅显著低于WT, 表明转ppc基因水稻具有较强的抗氧化能力; T1和T2比WT具有较高的脯氨酸含量和渗透势下降幅度, 说明转PEPC基因水稻的渗透调节能力高于对照。PEG-6000处理下, 得到的结果相似。     

光抑制条件下转PEPC基因水稻的光合表现

用原种粳稻Kitaake和转PEPC基因水稻为材料,比较光合速率、叶绿素荧光参数、叶绿素含量等光合特性的差别.结果表明,转PEPC基因水稻的饱和光强为1200 μmol/m2.s,比原种高200 μmol/m2.s,光饱和光合速率比原种高50%以上.在高光强1400 μmol/m2.s(2 h)下,与原种相比,转PEPC基因水稻的PSⅡ光化学效率(Fv/Fm)下降较少、 光化学猝     

田间条件下转玉米C4型PEPC基因小麦的光合生理特性

为了检验转PEPC基因小麦是否具有C₄光合生理特性,以转PEPC基因小麦和对照周麦19为试验材料,分别于抽穗期、开花期、花后第7天和花后第15天测定其单株旗叶的气体交换参数日变化,对净光合速率日变化进行单位日光合总量分析, 并且对净光合速率日变化与单株气孔导度、胞间CO₂浓度、蒸腾速率日变化的相关性进行了分析;在花后第15天测定其单株叶绿素荧光参数,并在成熟期调查了单株产量性状。与对照相比,转基因株系在4个测定时期的旗叶净光合速率明显提高,尤其在花后第15天,单位日光合总量较对照提高29.1%和23.3%,气孔导度和蒸腾速率均明显增加,胞间CO₂浓度降低;花后第15天12:00与8:00相比,转PEPC基因小麦的F_v/F_m、q_p、NPQ、Φ_PSII的变幅均小于对照;单茎重、千粒重、单穗重和收获指数较对照显著增加。以上结果表明,转PEPC基因小麦材料在田间条件下光合特性明显优于对照,且具有提高小麦产量水平的潜力。     

转C4光合基因水稻及其在育种中的应用

按光合作用途径可将植物分为C3植物、C4植物和CAM植物,由于C4植物在高光强、高温和高氧分压的条件下,比C3植物具有较高的光合效率,作物生理和育种学家就试图用C4光合途径改造C3作物,以提高主要农作物如稻、麦和大豆等光合生产力,但通过常规杂交的方法难以奏效。近年来,随着分子生物学的兴起和植物转基因技术的快速发展,许多与C4光合作用途径相关的关键酶PEPC、NADP-苹果酸(NADP—ME)和PPDK等一系列基因已从玉米、高粱和苋菜等C4植物中被克隆,对这些基因启动子序列分离、重组、转化及表达的研究,发现它们可以在C3植物中驱动外源基因并进行组织特异性表达,而且一系列C4型光合基因导入C3植物的成功报道。特别是获得高表达的转C4光合基因水稻,表现光合能力和种子产量显著提高,而且在光逆境的条件下,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)的活性提高,从而有效地清除活性氧分子,表现耐光抑制(氧化)等。目前利用转C4光合基因水稻的育种研究也取得了重要进展,培育出携带C4光合基因的高光效水稻株系,在遗传上证明了常规育种和生物技术结合可以将转C4光合基因水稻中高表达的C4光合基因遗传给后代,获得高光效的超级稻,最后提出了本研究中尚需深入研究的问题。     

高粱C_4型pepc基因转入大豆可改善大豆光合特性

改善作物的光合性能能够有效突破作物的产量潜力,目前国内关于转高粱C4型pepc基因大豆的研究尚未见报道。本研究以东北地区主栽大豆品种‘黑农41’为材料,通过农杆菌介导法将高粱C4型全长pepc基因转入‘黑农41’,获得了转基因植株。通过对转基因植株T0代和T1代进行了分子生物学检测、农艺性状调查和生理指标检测,结果表明目的基因已整合到大豆基因组中,T0代和T1代植株的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均有不同程度的提高,而胞间CO2浓度降低,其中T0代和T1代植株的净光合速率分别比对照提高了37.4%和20.7%,在T1代净光合速率增幅最大的T1-3-3,单株产量增加也最多,说明pepc基因的导入改善了转基因植株的光合特性,进而使转基因大豆产量提高。本研究可为高光效转基因大豆新品种的选育提供重要素材。     

外源葡萄糖增强高表达转玉米C4型pepc水稻耐旱性的生理机制

为揭示葡萄糖参与植物耐旱性的内在机制,以高表达转玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC) 基因(C4-pepc)水稻(PC)和受体“Kitaake”(WT)为材料,通过盆栽和水培试验,研究外施葡萄糖联合干旱处理下,功能叶片的光合参数、总可溶性糖及其组分、Ca²⁺、NO含量、己糖激酶活性、B类钙调磷酸酶(calcineurin B-like, CBL)与蔗糖非发酵1 (sucrose nonfermenting-1, SNF1)相关蛋白激酶(SNF1-related protein kinase 3s, SnRK3s)基因表达的变化。结果表明,在盆栽试验中,分蘖期外施3%葡萄糖联合干旱处理对水稻的产量及其构成因子影响不显著,而在孕穗期处理,PC的株高、穗数、每穗实粒重和单株产量均显著高于WT。在水培试验中,外施1%葡萄糖和12% (m/v)聚乙二醇6000 (polyethylene glycol-6000, PEG-6000)模拟干旱处理,均显著提高了PC功能叶片的净光合速率(P_n)、气孔导度(Gs)和羧化效率(CE),叶片内蔗糖和果糖的含量也均显著高于WT。值得关注的是,PC叶片己糖激酶(hexokinase, HXK)活性、CBL1/SnRK3.1/SnRK3.4/ SnRK3.21基因的相对表达量在外施1%葡萄糖联合12% PEG模拟干旱处理下均显著低于12%PEG处理,而NO含量则显著上升。相关性分析也表明,PC中Pn、胞间CO2浓度(Ci)和Gs分别与葡萄糖含量、HXK活性和SnRK3.16基因表达显著相关。外施葡萄糖处理可上调PC糖水平,下调其CBL和SnRK3s基因表达,诱导NO参与叶片气孔调节,从而增强保水能力,保持光合能力稳定,最终表现为耐旱。     

干旱胁迫下PEPC过表达增强水稻的耐强光能力

以过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的水稻为材料,研究了不同程度干旱胁迫下开花期剑叶光合作用的光响应过程、叶绿素荧光参数、色素含量和活性氧代谢。结果表明,在干旱特别是重度干旱胁迫下,野生型水稻在强光下净光合速率迅速下降,而转Zmppc基因水稻没有明显的下降现象; 而且表示光化学活性的叶绿素荧光参数F_v/F_m、Φ_PSⅡ和q_P下降程度低,说明PEPC增强了干旱胁迫下水稻抵御强光胁迫的能力。这可能是因为干旱胁迫下转Zmppc基因水稻玉米黄质含量高,光系统对过剩光能的耗散能力强,能够保护光系统免受过剩光能的伤害,从而减小O₂^?产生速率; 同时干旱胁迫下转PEPC基因水稻抗氧化酶SOD、POD和CAT活性高,能有效清除活性氧,减轻膜质过氧化。     

引种到青藏高原大田的玉米叶片中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的日变化

引种到青藏高原大田的玉米,其拔节期的全天光合进程中,叶片中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性总是大于相应时间点的净光合速率(Pn),且全天变化幅度较Pn缓和.通过研究PEPC活性和Pn之间差异的全天变化,分析了环境因子(如光强、气温)和气孔状态对光合作用的影响.     

根癌农杆菌介导获得稗草Ecppc转基因小麦的研究

采用携带pUbi-Ecppc质粒的3个根癌农杆菌菌株（LBA4404、EHA105和C58c1），对经过预培养10~12 d的春小麦品种扬麦158、Bobwhite和扬麦12的幼胚愈伤组织进行了遗传转化。对筛选中的抗生素浓度、菌液浓度、共培养温度和时间、受体基因型、菌株-质粒组合等影响转化的重要因素进行了研究。首次将单子叶野生C₄植物稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（Ecppc）导入小麦受体基因型，并得到具有潮霉素（Hyg）抗性的转化植株。从816块共培养愈伤组织中转化得到34株抗性植株，其中14株PCR检测为阳性。扬麦158的转化效率达3.03%。Southern和RT-PCR分析表明外源基因已整合到小麦基因组并得到正确的转录。生理学检测显示，转基因小麦植株的光合速率和PEPC活性都有所提高。说明Ubiqintin基因启动子控制的稗草PEPC cDNA基因在小麦中可以正确表达和起到一定的生理作用。这些工作为进一步探讨PEPC对小麦光合作用及其他生理过程的影响奠定了基础。     

豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因在转基因水稻中的表达特性研究

以豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)转基因水稻自交品系和其衍生的花培品系为实验材料，通过PCR扩增和CpTI表达蛋白活性的测定，研究了CpTI基因的遗传稳定性和表达特性。结果表明CpTI基因在转基因自交后代可以稳定遗传，而在部分花培品系中发生丢失。同时CpTI基因的表达表现出一定的时空特性，同一转基因品系中叶片CpTI蛋白的表达活性通常高于茎杆，而不同发育时期的CpTI蛋白的表达活性以分蘖期最高。除花培品系DH401外，转基因品系叶片和茎杆的蛋白酶抑制剂的活性随着水稻的生长发育呈下降的趋势。     

OsBTF3基因在水稻光合作用和生长发育中的功能

为了揭示转录因子OsBTF3在水稻生长发育中的功能,比较分析了OsBTF3过量表达和RNAi转基因水稻T₁代株系叶片生长和株型发育的表型。结果表明,与野生型对照株相比,过量表达株系在叶绿素含量、叶绿体数量、光合速率、叶片大小、株高、节间长方面显著增加或增强; 而RNAi株系的明显降低或减弱。OsBTF3基因的增量或减量表达显著影响水稻光合作用、叶片生长和株型发育。说明OsBTF3在水稻生长发育中具有重要调控功能,可能在水稻转基因分子育种方面具有潜在的应用价值。     

水分胁迫抑制水稻光合作用的机理

水分胁迫降低了水稻的光合速率。轻度水分胁迫下，气孔的限制是光合速率下降的主要原因；而严重水分胁迫下，叶肉细胞光合能力的降低是光合速率下降的主要原因。顺肉细胞光合能力的降低可能是由于光合量子效率、羟化效率、光合电子传递速率及光合磷酸化活力的下降所致。     

转PEPC基因水稻花粉株系不同生育期的光合生理表现

以父本转玉米PEPC基因水稻、母本粳稻9516和杂交后代稳定的花粉株系JAAS45为材料,研究了JAAS45及其亲本的不同生育期的光合色素含量、净光合速率和水分利用效率。结果表明:分蘖期以后,杂交后代JAAS45的单位叶面积Chl含量超过母本9516,并一直维持着较高水平,与PC相近。在整个生育期,JAAS45和PC的叶绿素a/b一直高于9516。JAAS45苗期的净光合速率(Pn)与9516相近,而到了分蘖期,其Pn超过了9516,尤其到了抽穗及灌浆期,其Pn还超过了PC。从苗期到抽穗期,JAAS45的水分利用效率(WUE)与PC相接近,明显高于9516。这些结果说明,JAAS45具有较高的光合能力和水分利用效率,与父本PC相似。通过转PEPC基因水稻和杂交稻的亲本杂交,可将玉米PEPC基因转移到普通水稻品种中,培育出高光合效率和高产的水稻品系。     

OsWD40过表达水稻根系响应盐胁迫的转录组分析

盐胁迫是影响水稻产量的主要因素之一,开展水稻耐盐机制的研究十分必要。为了揭示OsWD40基因参与耐盐的分子机制,以日本晴和OsWD40过表达水稻株系为材料,用浓度为200mmol/L的NaCl分别处理0、12、24和48h,对其根系进行转录组测序分析。结果显示,比较日本晴和OsWD40过表达株系在盐胁迫相同时间（ST0与NT0、ST12与NT12、ST24与NT24、ST48与NT48）的基因表达量,分别检测到1950、1646、3499和1522个差异表达基因。其中,盐胁迫处理24h的差异表达基因多于0、12和48h处理。对4个比较组的差异表达基因分别进行GO功能富集分析和KEGG代谢通路分析,发现差异表达基因主要富集在盐胁迫响应、脱落酸响应和转录调控等GO条目中,富集的重要代谢通路主要是植物激素信号转导,植物MAPK信号传导途径和苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成相关的次生代谢途径等。同时,转录因子家族基因,如WRKY、MYB和bHLH等,在各比较组中呈现差异表达。由此推测,苯丙烷生物合成和类黄酮生物合成等植物次生代谢途径在OsWD40过表达水稻根系响应盐胁迫中发挥着重要作用,而且OsWD40可能介导响应脱落酸的基因转录调控,激活下游盐胁迫相关基因的表达。     

玉米高光效基因PPDK在籼稻IR64中的整合及其与光合作用相关的特性分析

丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）在C4植物光合作用途径中,是CO2固定的关键酶。将编码玉米丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）基因的质粒通过基因枪和农杆菌介导转化导入籼稻IR64中,PCR-Southern的结果表明,玉米丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）基因已经整合到IR64中。在温室条件下,分析了转基因IR64植株的剑叶全氮含量,结果表明,大部分的转基因IR64植株剑叶的全氮含量高于非转基因IR64对照,在转基因IR64植株中,最高的剑叶全氮含氮量为3．61％,比非转基因的IR64对照高1．07个百分点,剑叶全氮含量提高了42．1％。对转基因IR64植株的产量构成因素的分析结果表明,不同的转基因IR64植株之间,产量构成因素差异比较大,比如植株干重、收获指数等,有助于育种家们选择不同的育种材料用于水稻育种。     

土壤宏基因组中抗草甘膦新基因的克隆与转化水稻的研究

EPSPS (5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶EC 2.5.1.19)是植物芳香族氨基酸和植物次生代谢产物生物合成中莽草酸途径的关键酶; 同时也是广谱性除草剂草甘膦的作用目标。本实验通过对草甘膦污染土壤宏基因组文库的建立及筛选, 成功克隆了一个新的草甘膦抗性的EPSPS基因(命名为soilEPSPS)。序列分析表明soilEPSPS基因全长1404 bp, 其编码的467个氨基酸中未涉及已公布专利中保护的氨基酸序列。原核功能验证表明该基因对草甘膦的耐受能力优于EPSPS CP4基因。将该基因与水稻Rubisco SSU引导肽相融合构建由actin启动子驱动的植物表达载体, 用农杆菌介导法实现了水稻的遗传转化。抗性再生植株的PCR和Southern杂交结果表明所获得的26株再生植株均为转基因阳性植株, 其中共有3个单拷贝转化事件。草甘膦抗性鉴定证明纯合体T₂代植株能够耐受高达500 mmol L^-1的草甘膦。本研究为转基因抗除草剂水稻新品种的培育奠定了基础。