除虫菊内生真菌Y2菌株的分离鉴定及其发酵产物抑菌活性初步研究

在对从除虫菊中分离到的内生真菌进行抑菌活性系统筛选的基础上,对其中活性较高的Y2菌株进行了初步的鉴定和活性物质的分离。经形态学初步鉴定该菌株为镰孢属真菌Fusarium sp.,其发酵液粗提物高抑菌活性馏分集中在丙酮、乙酸乙酯等中等极性馏分段。Y2菌株发酵液10倍稀释液对玉米大斑病菌Exserohilum turcicum等6种供试植物病原真菌菌丝生长的抑制率在80.41% ~93.26%之间,其5倍稀释液对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea和苹果炭疽病菌Glomerella cingulata孢子萌发的抑制率均大于80%。活体生测结果表明,该发酵液对番茄灰霉病和黄瓜霜霉病的保护效果大于50%,治疗效果不明显。     

嗜线虫致病杆菌YL001菌株代谢产物的抑菌活性

从陕西杨凌土样中筛选得到一株昆虫病原线虫,从其体内分离到它的共生菌嗜线虫致病杆菌Xenorhabdusnematophilus,编号为YL001,为明确其代谢产物的抑菌活性,本试验采用抑制菌丝生长速率法、抑制孢子萌发法、组织测定法和盆栽试验法系统测定了其发酵液对植物病原真菌的抑制作用。结果表明,在离体条件下该菌株发酵液对供试的15种植物病原真菌菌丝生长均有一定的抑制作用,对番茄灰霉病菌和辣椒疫霉病菌的抑制作用最强,EC50分别为53.54和90.39mg·L-1;对供试的6种植物病原真菌孢子萌发均有一定的抑制作用,其中对番茄灰霉病菌和烟草赤星病菌孢子萌发有较强的抑制作用,EC50仅分别为16.97和21.87mg·L-1;组织法测定中,发酵液稀释10倍后,对番茄灰霉病的保护效果为74.98%,治疗效果为63.50%;对盆栽番茄灰霉病的保护效果为65.11%,治疗效果为54.64%。显微观察表明,YL001菌株的发酵液可使菌丝生长形态异常、变形萎缩,甚至断裂。     

冬青卫矛内生放线菌YDG17菌株发酵液抑菌活性研究

从冬青卫矛植株中筛选得到一株内生链霉菌YDG17,其发酵液对多种植物病原真菌有较强的抑制作用。室内生物测定结果表明,YDG17菌株发酵液对供试的11种植物病原真菌菌丝生长均有一定的抑制作用,其中对小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、番茄灰霉病菌Fulvia fulvum和番茄早疫病菌Alternaria solani的抑制作用最强,EC50值分别为259.98、336.13和100.72 mg/L;对供试的3种植物病原真菌孢子萌发也均有一定的抑制作用,其中对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制作用最强,EC50值为87.84 mg/L。离体子叶法测定结果表明,发酵液原液对番茄灰霉病的保护效果为97.62%,治疗效果为79.63%。盆栽试验结果表明,发酵液原液对番茄灰霉病的保护效果为71.34%,治疗效果为64.23%。捷克八溶剂系统纸色谱测定结果表明,该发酵液的主要活性物质为碱性水溶性抗生素。选用弱酸性离子交换树脂吸附法对YDG17发酵液活性成分进行了初步分离,并对其活性馏分进行ESI-MS/MS分析,表明其活性物质主要为链丝菌素类化合物,该类化合物为首次从植物内生菌中分离得到。     

肉桂精油对4种重要果蔬病原真菌的生物活性研究

为进一步明确肉桂精油的农用抑菌活性,采用菌丝生长速率法、孢子萌发法和活体组织法系统测试了其对番茄灰霉病菌、苹果青霉病菌、番茄茎枯病菌和黄瓜镰刀菌4种重要果蔬病原真菌的抑菌活性。结果表明,肉桂精油对番茄灰霉病菌的抑制效果较好。离体活性测试中,肉桂精油对4种供试菌菌丝生长的抑制中浓度（EC50）分别为272.17、324.78、316.24、326.95 mg/L;对4种供试菌孢子萌发的EC50分别为196.01、273.52、390.44、311.23 mg/L。果实针刺法试验结果表明,在10 g/L处理剂量下,肉桂精油对番茄灰霉病的治疗作用和保护作用分别为64.16%和34.90%（3 d）,保护作用与对照药剂1 g/L腐霉利无显著差异。     

短短芽胞杆菌对植物病原真菌的抑菌活性和抑菌机理

为探讨短短芽胞杆菌菌株011对植物病原真菌的防控效果,采用平皿打孔法测定菌株011粗提液对14种植物病原真菌的抑制作用,并以番茄早疫病为研究对象,研究了其抑菌机理。结果显示,菌株011粗提液对14种病原真菌均有抑菌活性,其中对番茄早疫病菌的抑菌活性最强,抑菌率达45.9%;菌株011粗提液能导致番茄早疫病菌菌丝生长异常,抑制孢子萌发;对番茄早疫病菌菌丝生长的EC50为71.4 mg/m L,对孢子萌发的EC50和MIC分别为0.12 mg/m L和0.8 mg/m L;该粗提液能引起番茄早疫病菌菌丝的脂质过氧化程度和细胞内过氧化氢含量上升,菌丝细胞膜的蛋白质合成量下降,当粗提液浓度高于50 mg/m L时,菌丝细胞膜的麦角甾醇合成量下降;该粗提液还能降低番茄早疫病菌胞外果胶酶和纤维素酶的活性。研究表明,菌株011粗提液可作为生防制剂应用于植物病原真菌的防治。     

脂肽类抗生素fengycin在枯草芽胞杆菌NCD-2菌株抑制番茄灰霉病菌中的功能分析

 枯草芽胞杆菌NCD-2菌株及其无细胞发酵液对多种植物病原真菌具有较强的拮抗活性。为了明确NCD-2菌株抑菌作用机理,本研究利用快速蛋白液相色谱技术(FPLC)结合抑菌活性测定,对NCD-2菌株的脂肽类抑菌物质进行分离、纯化,经质谱鉴定,该抑菌物质为芬荠素(fengycin)。从NCD-2菌株中克隆出fengycin合成酶基因fenC及其上游启动子序列,通过同源重组技术对fenC基因进行了内缺失突变,同NCD-2野生型菌株相比,fenC基因缺失突变子丧失了fengycin的合成能力,同时该突变子显著降低了对番茄灰霉病菌的拮抗活性。进一步在离体叶片上比较了NCD-2野生型菌株和突变子之间脂肽提取物和菌体细胞对番茄灰霉病的保护作用,结果发现,突变子不论是脂肽提取物还是菌体细胞显著降低了对番茄灰霉病的防治作用。     

生防细菌BMY-1对几种植物病原真菌的抑制作用

采用平板对峙培养法和滤纸片培养法测定细菌BMY-1菌株对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、玉米小斑病菌(Bipolaria maydis)、玉米弯孢霉叶斑病菌(Curvularia lunata)等11种植物病原真菌生长的抑制作用。结果表明,BMY-1菌株对供试病原菌生长具有很好的抑制效果。平板对峙培养法中,BMY-1菌株对番茄灰霉病菌、玉米弯孢霉叶斑病菌、玉米小斑病菌的抑制效果最好,抑菌宽度分别达到15.0 mm,14.0 mm,13.0mm。滤纸片培养法中,BMY-1菌液对番茄灰霉病菌抑制效果最好,抑菌带宽度为8.0 mm。BMY-1菌液及其无菌发酵液对病原菌孢子萌发也有很强的抑制作用。其中对辣椒疫霉病菌和玉米小斑病菌孢子萌发的抑制效果最好。BMY-1菌液处理后,孢子萌发率分别为0.97%和1.00%,而对照萌发率为分别为96!29%和93.04%。     

拮抗放线菌A03的生防作用及其分类鉴定

从京郊菜园土壤中分离到一株拮抗放线菌,编号为A03。为了科学评价该菌株在植物病害生防中的应用潜力,采用平板对峙培养法和温室盆栽防治法测定了其抑菌活性,并通过形态学、化学和分子分类的方法研究其分类地位。结果表明,该菌株对供试的多种植物病原真菌均有抑制作用,其中对果蔬灰霉病菌、番茄早疫病菌、小麦纹枯病菌和瓜果腐霉的抑制作用较强,平板抑菌带宽度达11．0～12．0 mm。温室防病试验结果表明,其发酵上清液对甜椒灰霉病和番茄灰霉病具有良好的生防作用,防治效果分别为84．97%和79．51%。根据其菌株形态特征、培养性状、生理生化特性、细胞壁化学组分及16S rDNA序列分析,将菌株A03归入链霉菌属,并鉴定为吸水链霉菌Strep- tomyces hygroscopicus。     

生防细菌HMQ20YJ04发酵条件优化及其对番茄灰霉病的效果评价

菌株HMQ20YJ04是从甘肃民勤盐碱土壤中分离筛选的对多种植物病原真菌具有较强抑菌活性的拮抗细菌。为提高其发酵液的防控效果,以发酵液活菌数作为检测指标,采用单因素试验、正交试验、Plackett-Burman试验和响应曲面法对发酵培养基组分和摇瓶发酵条件进行筛选和优化。结果表明,最佳发酵培养基组分配比为可溶性淀粉5 g/L、酵母提取物10 g/L、Mg SO₄·7H₂O 5 g/L、Na Cl 5 g/L,最佳发酵条件为转速200 r/min、接种量5%、温度32℃、时间60 h、初始p H 6.5。温室盆栽防控番茄灰霉病试验结果表明,该菌株的发酵液对番茄灰霉病具有良好的防控效果,防效为63.03%。研究结果为枯草芽胞杆菌菌株HMQ20YJ04的菌剂研发及番茄灰霉病的生物防治提供了依据。     

发光杆菌NJ菌株的抑菌活性研究

测定了发光杆菌NJ菌株对16种植物病原真菌的抑菌活性,结果表明该细菌具有较广的抑菌谱,其中对甘蓝黑斑病菌、玉米大斑病菌、番茄猝倒病菌、玉米小斑病菌等植物病原真菌具有较强抑制作用。对该菌的发酵条件研究表明,该菌在种龄为24 h、接种量在4%～6%条件下,在TSY培养液中72 h即可获得较高的抑菌活性。而装瓶量为10～50 mL/100 mL锥形瓶,转速为120～200 r/min对菌的活性影响不大。不同温度处理发酵液,其抑菌活性发生变化,其中经60℃处理10 min后,抑菌活性降低约50%,说明发酵液中的抑菌活性成分可能有多种。     

木霉菌素的光稳定性及其降解产物分析

为明确木霉菌素的光稳定性及其主要降解产物,分别采用可见光、紫外光、纳米氧化钛(TiO2)、纳米氧化钛加紫外光(TiO2-UV)催化降解等技术,测试了木霉菌素的光稳定性;并采用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析方法,通过与所合成的木霉菌素衍生物进行对照分析,确定了其主要降解产物,同时分析了其降解后活性降低甚至失活的原因。结果表明:可见光、紫外光和纳米TiO2单独作用时对木霉菌素的降解效果均较差,而TiO2-UV的催化降解效果较好;TiO2-UV催化降解24 h后的主要降解产物为木霉菌素衍生物木霉菌醇、12,13-二羟基木霉菌素(M-1)、(12-H,13-OH)-木霉菌素(M-2)及(12-H,13-OH)-木霉菌醇(M-3)。研究表明,木霉菌素具有很强的光稳定性,而采用TiO2-UV的方式可催化降解木霉菌素,其降解产物活性降低甚至失活可能是由于木霉菌素抑制蛋白质合成的关键基团被降解破坏所致。     

枸骨内生真菌抗菌代谢产物的鉴定及活性研究

对一株枸骨内生真菌哈茨木霉Trichoderma harzianum抗菌活性成分的分离、鉴定及其抗菌生物活性进行了研究。该真菌发酵液经乙酸乙酯萃取、正相硅胶和ODS-反相色谱分离纯化得到一单端孢霉烯化合物,经红外、质谱和核磁分析,鉴定为:4β-乙酰基-12,13-环氧-9-单端孢霉烯(trichodermin),这是首次从哈茨木霉菌代谢产物中分离出该化合物。Trichodermin对蕃茄早疫病和黄瓜立枯病病原菌的离体抑制活性EC50值分别为3.35和3.59 mg/L;活体测定结果表明,在 100 mg/L的剂量下对两种病的保护效果分别为97.8% 和98.1%,治疗效果为96.7%和97.3%。     

枸骨内生菌No.2的鉴定及其对黄瓜立枯病的生防作用

从枸骨植物中分离到一株对立枯丝核菌Rhizoctonia solani具有抑制作用的内生真菌(编号为No.2),借助Biolog微生物自动分析仪对该真菌进行了分类鉴定,根据菌株的生理生化和形态特征,初步确定该菌株为哈茨木霉菌Trichoderma harzianum Rifai。双重培养试验表明,该哈茨木霉菌对黄瓜立枯病菌存在竞争和寄生作用;盆栽试验测定结果表明,喷施哈茨木霉菌胞外代谢产物木霉素的1 000倍液7 d后,其对黄瓜立枯病的保护和治疗效果分别为88.89%和95.83%。施药后各处理对黄瓜的株形、叶色均未产生药害症状,表明其安全性较好。     

脐孢木霉菌Trichoderma brevicompactum 0248 tri5基因片段的克隆及表达分析

脐孢木霉菌Trichoderma brevicompactum能合成木霉素等单端孢霉烯类化合物,而基因tri5编码的单端孢霉二烯合酶是合成途径中的关键酶,它催化反式法呢基焦磷酸（tFPP）合成单端孢霉二烯。为分析基因tri5与木霉素合成的关系,本研究从脐孢木霉菌0248中克隆了基因tri5片段,并运用实时荧光定量PCR技术分析了基因tri5在不产木霉素培养基和产木霉素培养基中的差异表达。在相同培养时间下,基因脚在不同产木霉素状态间的表达量差异显著;在培养96h时基因tri5在2种培养基中均达到最大值,基因tri5在产木霉素状态下的表达量是不产木霉素状态下的107．18倍。通过检测产木霉素培养基中基因tr／5表达量与木霉素含量的变化,结果显示木霉素的含量随着基因tr／5表达量的增加而不断增加,在培养96h时达到最大值118．71mg·L-1,推测基因tri5表达量与木霉素合成相关。该研究为基因tri5功能的进一步研究和对脐孢木霉菌0248进行基因工程菌改造奠定了理论基础。     

分批发酵和补料分批发酵生产木霉素的研究

为了提高木霉素的发酵产量,以哈茨木霉Trichoderma harzianum Rifai菌株LC2为生产菌,在10L发酵罐中对分批发酵和补料分批发酵工艺进行了研究。结果表明,在分批发酵工艺中,在8%接种量、4L/min通气量和200r/min搅拌转速条件下,发酵72h时木霉素产量达到最大值149.6mg/L。在间歇补料分批发酵工艺中,分6次补料,使培养基中各成分的终浓度与分批发酵相同,木霉素的发酵产量提高到182mg/L,比分批发酵提高21.7%。     

紫杉木霉突变株UL60-11产木霉菌素的发酵条件优化

为了提高紫杉木霉Trichoderma taxi ZJUF0986突变株UL60-11木霉菌素的产量,采用单因素试验筛选出菌株UL60-11生长及产素的最佳碳氮源为葡萄糖、淀粉、蛋白胨、酵母粉、酒石酸铵;通过均匀设计与正交试验相结合优化出最佳培养基配方：葡萄糖23g、淀粉15g、蛋白胨5g、酵母粉3g、酒石酸铵2g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1.0g、氯化钠0.2g、硝酸钙0.4g。在最适工艺条件：初始pH4.0、温度25℃、种龄48h、10%接种量1、00ml/500ml的装液量和150r/min下摇瓶发酵试验,木霉菌素产量达到632.16μg/ml,比优化前提高32%。     

哈茨木霉发酵产木霉素的培养条件优化

采用快速有效的数学统计方法对一株枸骨内生真菌哈茨木霉生产木霉素的培养条件进行了优化。首先利用Plackett-Burrman设计在影响木霉素产量的6个因素中筛选出主效因素：葡萄糖浓度、发酵时间、接种量。在此基础上,再利用响应面分析法对以上三个显著因子的最佳水平范围进行研究,建立并分析了各因子与木霉素产量关系的回归模型。通过模型确定出最佳的试验条件：葡萄糖浓度42.8g/L,接种量1.39ml和发酵时间102.88h,该条件下木霉素的产量可达147.44mg/L。经五批培养验证,预测值与验证试验平均值接近。     

哈茨木霉发酵液中peptaibols抗茵肽的鉴定及活性研究

通过大孔吸附树脂、葡聚糖凝胶、薄层制备硅胶板（TLC）及制备高效液相色谱（HPLC）从哈茨木霉菌Trichoderma harzianum发酵液中分离、纯化出 4 种由 20 个氨基酸组成的线性peptaibols 抗菌肽FD1、FD2、FD3、FD4.经ESI-IT-MS串联质谱鉴定,其分别为抗菌肽Alamethicin F-50、Atroviridin B、Alamethicin II和Atroviridin C.菌丝生长及孢子萌发实验表明其对水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani AG4、黄瓜立枯病菌R. solani、黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum、西瓜枯萎病菌F. oxysporum f. sp. niveum、水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae具有较好的抑制作用,同时发现木霉素Trichodermin与peptaibols抗菌肽Alamethicin F-50联合作用时对菌丝生长具有协同抑制作用.     

Peculiarities of behaviour of taiga (Ixodes persulcatus) and sheep (Ixodes ricinus) ticks (Acarina: Ixodidae) determined by different methods

A comparison of the behavioural peculiarities of Ixodes persulcatus Schulze, 1930 (north-western population, Russia) and Ixodes ricinus (L., 1758) from western Russia and Denmark was determined by using two methods. Method 1 involved a sojourn of ticks on vertical plastic sticks and showed that the questing behaviour of I. ricinus nymphs was dependent on temperature and relative humidity (RH). A significantly greater number of nymphs quested at 22 degrees C and 100% RH than at 18 degrees C. When the humidity was reduced to 30% all of the nymphs departed. In the second method, the activity of ticks on an inclined "ticksdrome" was estimated. The activity of I. ricinus adults from the Danish population was 1.2 times greater than that of ticks from Russia. Females of the species studied and specimens from all study areas were more active than all other stages of development. The locomotor activity of both adult and immature I. ricinus that were infected with Borrelia burgdorferi sensu lato was suppressed when compared with uninfected specimens. The locomotor activity of I. persulcatus females infected by borreliae with exoskeleton anomalies was 1.3 times greater (P<0.05) than that of infected ticks without anomalies. Our data showed that infected females with exoskeleton anomalies could crawl faster on a human and reach uncovered parts of the body that are vulnerable for attachment and feeding. A study of locomotor activity and questing behaviour may be useful for comparing the risk for different tick species and populations to transmit tick-borne pathogens.     

8种植物提取物对小麦白粉病病菌抑制活性研究

采用室内盆栽法,测定8种植物提取物对小麦白粉病的抑菌活性。结果表明,香樟叶、黄杨和刺槐提取物对小麦白粉病病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)有良好的抑制活性。其粗提物干质量浓度为40 mg/m L时,对白粉菌抑菌效果依次为57.68%,38.67%,42.39%;香樟叶粗提物对小麦白粉的室内预防和治疗作用的EC50分别为10.39 mg/m L和30.43 mg/m L,其预防效果显著优于治疗效果;测定香樟叶4种萃取物对小麦白粉病的预防效果,发现石油醚萃取物抑菌效果最好,EC50为8.71 mg/m L。说明其抑菌活性物质主要存在石油醚相中。