猪瘟病毒NS3丝氨酸蛋白酶功能区基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

用RT－PCR方法扩增分别获得了中国猪瘟病毒强毒石门株和兔化弱毒株非结构蛋白NS3丝氨酸蛋白酶功能区[即NS3（△C）]基因cDNA，将之克隆到pGEM T载体测定其核苷酸序列，并出其对应氨基酸序列，结果表明这两个毒株间的NS3（△C）区基因核苷酸序列同源性为95.8%，氨基酸序列同源笥为99％，有2个残基的差异；两毒株与一些猪瘟病毒以及同属的牛病毒性腹泻病病毒代表毒株的对应序列进行比较，所测核苷酸序列及的氨基酸序列均极为保守，而且氨基酸序列分析结果还表明，瘟病毒NS3（△C）序列也含有与其它黄病毒同样保守的由His，Asp和Ser残基构成的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶催化三分体，三分体中Ser为丝氨酸蛋白酶催化活性关键氨基酸残基，将上述NS3（△C）基因亚克隆至原核表达载体pET-28a中，并在E.coli中获得高效表达，将表达产物纯化并免疫小鼠，间接免疫荧光和Western blot结果表明制备了针对NS3（△C）蛋白的多克隆抗体，上述实验结果为继续深入研究非结构蛋白NS3在猪瘟病毒的复制及病毒与宿主细胞相互关系中的作用，提供了基础材料及参考数据。     

旋毛虫新生幼虫p46 000抗原基因的克隆及序列分析

应用旋毛虫感染猪血清，对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行了免疫筛选。对阳性克隆pBK-cMV-WN10的序列分析结果表明。cDNA全长为1352bp。含有1个1218bp的完整的开放阅读框架(ORF)，编码的多肽由406个氨基酸残基组成，其相对分子质量理论推导值为45900，等电点为5．43，N末端的信号肽及糖基化位点(NCS)表明其可能为分泌性糖蛋白，氨基酸序列19～156与158～295为重复区域，相似性为74％．C末端有1个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域，但旋毛虫p46000抗原与其他线虫的半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白结构有很大差异，可能已经失去半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白的功能。PCR结果显示。从旋毛虫新生幼虫、肌幼虫、3日龄成虫和5日龄成虫cDNA中均扩增出此基因，表明此基因在旋毛虫各个时期均有表达。     

柞蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂6基因Apserpin-6的克隆及功能分析

昆虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)可以通过抑制丝氨酸蛋白酶的活性调控机体的免疫防御反应。依据柞蚕中肠转录组数据库中一段编码serpin的CDS序列设计正、反向引物,以柞蚕幼虫总c DNA为模板克隆得到一段全长1 239 bp的序列,经序列分析后命名为Apserpin-6(Gen Bank登录号:MF944108)。该基因编码412个氨基酸残基,其中N端第1~17位氨基酸为信号肽序列,在C端第357~391位氨基酸之间有一个反应中心环,第374~375位丝氨酸之间是预测的蛋白质裂解位点。半定量RT-PCR检测Apserpin-6在柞蚕5龄幼虫脂肪体中的表达量最高,在血淋巴和头部组织的表达量次之,在中肠、丝腺和马氏管中的表达量较低。荧光定量PCR检测在受到柞蚕肠球菌(Enterococcus pernyi)、白僵菌(Beauveria bassiana)以及柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus)侵染后的柞蚕幼虫血淋巴中,Apserpin-6的表达量均明显上升。利用在原核表达系统表达的重组Apserpin-6蛋白,对柞蚕幼虫血淋巴中的酚氧化酶原(pro PO)和酚氧化酶(PO)活性进行体外抑制试验,结果显示该重组蛋白能够抑制pro PO的活性,但对PO活性没有影响。试验结果提示,Apserpin-6可能作为一种负调控因子参与调控柞蚕血淋巴对于病原菌的免疫防御反应。     

柞蚕溶菌酶基因的克隆和序列分析

采用cDNA末端扩增(RACE)方法及简并引物克隆了柞蚕溶菌酶(Antheraea pernyilysozyme)基因(Gen-Bank登录号:DQ353869)。该基因cDNA序列全长675 bp,由3个外显子和2个内含子组成,其开放读码框(ORF)长420 bp,编码140个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白的1-20位氨基酸为信号肽序列,21-140位氨基酸为柞蚕溶菌酶成熟蛋白(分子质量14 kD,等电点8.46)。柞蚕溶菌酶氨基酸序列中含有c型溶菌酶分子所特有的活性中心Glu32、Asp50以及8个半胱氨酸残基,与鳞翅目昆虫溶菌酶的氨基酸序列同源性较高,属非钙结合型c型溶菌酶。柞蚕溶菌酶的模拟三级结构与印度柞蚕(Antheraea mylitta)溶菌酶的三级结构十分相似。     

大片吸虫组织蛋白酶L全长序列的获取及其生物信息学分析

根据文库载体序列与原组织蛋白酶表达序列标签（EST）设计引物,以大片吸虫cDNA文库为模板,进行Touchdown PCR与梯度PCR相结合的扩增反应,扩增产物克隆人pMD18-T载体。经鉴定后测序,并采用生物信息学技术对序列进行开放阅读框（ORF）、编码氨基酸序列、蛋白质同源性比较、二级、三级结构等分析;结果所获序列全长990bp,编码330个氨基酸,分子量36771.2u,等电点5．44;具有较明显的螺旋、片层和无规卷曲等二级结构,α螺旋占17．3％,β折叠占27．0％,无规卷曲占55．8％;具有2个较明显的跨膜区和2个疏水区,未发现明显的信号肽和糖基化位点;氨基酸序列同源性比对显示其属于半胱氨酸家族;三级结构同源建模预测显示其与组织蛋白酶K（PDB number 2f7dA）有49％的一致性。     

鸡β-防御素CDNA的克隆与序列分析

使用总RNA提取试剂盒,从1月龄粤黄鸡骨髓细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡β-防御素(Gal-2)cDNA片段.PCR产物经凝胶回收纯化,加A尾后与载体pGEM-T Easy相连,然后转化感受态细胞DH-5α在含X-gal、IPTG的LA平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR与提取质粒作限制性酶切鉴定后,对目的片段进行测序.结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段碱基数为195bp,用Blast程序进行检索比较表明此扩增序列与Genbank中发表的鸡Gal-2 cDNA编码区序列100%相同.该cDNA编码64个氨基酸,包括信号肽、前片段和成熟肽,成熟肽由36个氨基酸残基组成.     

用cDNA末端扩增法克隆柞蚕攻击素(attacin)基因及序列分析

利用cDNA末端扩增(RLM-RACE)方法,克隆了柞蚕攻击素(attac in)基因cDNA序列(GenBank登陆号:AY960680)。柞蚕攻击素基因cDNA序列全长912 bp,其中699 bp的蛋白质编码区可编码233个氨基酸。预测蛋白质分子量为25 kD,等电点(pI)为7.54。柞蚕攻击素基因中包含2个内含子。S ignal P 3.0 Server程序分析结果显示,柞蚕攻击素第1-17位氨基酸为信号肽序列。蛋白质功能区分析预测,柞蚕攻击素在第47-112氨基酸之间为攻击素-N(attac in-N)功能区,第113-233位氨基酸之间为攻击素-C(attac in-C)功能区。以邻接法(ne igh-bor-join ing,NJ)建立了与其它昆虫攻击素的系统关系图。     

旋毛虫肌幼虫p53cDNA的克隆及鉴定

根据GenBank中旋毛虫53000抗原基因的序列设计引物，用PCR技术直接从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因p53cDNA，将其克隆到pMD-18T载体，转化至大肠埃希氏菌NovaBlue后测序分析，结果表明，克隆到1176bp的p53cDNA，共编码391个氨基酸。序列分析表明，p53cDNA序列与GenBank中的旋毛虫p53基因序列相比共有12个核苷酸发生改变，二者的同源性为98％，所编码蛋白质氨基酸序列的同源性为98％。将其克隆到原核表达载体pET28a并转化至表达菌BL21star（DE3），经IPTG诱导表达后获得约48000的重组蛋白。Western blotting检测证实，p53重组蛋白可以被旋毛虫感染猪血清识别，具有很好的抗原性。     

中国猪瘟兔化弱毒全基因组cDNA文库的构建和序列分析

根据已发表的猪瘟病毒（CSFV）序列设计并合了26条覆盖全长基因组的套式和半套式PCR引物。应用RT－PCR、Nested PCR和Half-nested PCR技术从试验感染的兔脾中成功地扩增出了各相应的cDNA重叠片段，分别克隆和测序，构建了C株全基因组cDNA文库，采用DNAstar软件对全基因组的核苷酸和氨基酸序列进行了同源性比较分析。CSF C株全基因组cDNA文库的构建为进一步构建全长感染性cDNA奠定了基础。     

旋毛虫丝氨酸蛋白酶基因的克隆与分析

以旋毛虫感染猪血清为抗体探针,对旋毛虫3日龄成虫cDNA文库进行免疫筛选,将获得的阳性克隆进行测序,用分子生物学软件对所得cDNA序列进行了分析。序列分析结果显示,阳性克隆Zh68cDNA全长为1372bp,含有1个1287bp的完整的开放阅读框架,编码由429个氨基酸组成的多肽,理论分子质量为47．5ku,等电点为8．45。SMART分析表明,1～18位氨基酸为信号肽序列,37～277位氨基酸为典型的丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶类结构域,其中His88、Asp142、Ser233为催化中心的3个主要氨基酸残基,78～80位氨基酸为N-糖基化位点（NCS）,另外还有6个保守的Cys形成二硫键。BLASTn同源性分析表明,与其他生物丝氨酸蛋白酶的基因序列无明显的同源性,为1个新的cDNA分子。BLASTp蛋白质同源性分析表明,与丝氨酸蛋白酶的同源性为30％左右。Southern—blot杂交表明,此基因在旋毛虫基因组中属于多基因家族,具有基因多态性。cDNA的PCR结果表明,此基因在旋毛虫肌幼虫、新生幼虫及成虫期均有表达。     

日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆和分析

为筛选新的有潜在保护性的抗原分子编码基因，采用重复感染兔血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，将阳性克隆的插入序列进行了PCR扩增和序列分析。结果发现，所筛选的阳性克隆中有2个为日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(SPI)。序列分析表明，它可编码分子质量为4．6ku，等电点为5．76的蛋白，与GenBank中日本血吸虫SPI基因(大陆株)、曼氏血吸虫SPI基因和埃及血吸虫SPI基因编码的氨基酸序列的同源性分别为98％、62％和62％。TMpred分析表明，该蛋白具有2个明显的跨膜区即36～55和356～372位氨基酸。     

鸡β-防御素Gal-1 cDNA的克隆及序列分析

利用细胞总RNA提取试剂盒,从1月龄SPF鸡白细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡β-防御素(Gal-1)cDNA片段。PCR产物经凝胶回收纯化后与pMD18-T载体连接,转化感受态JM109细胞,在含X-gal、IPTG的LB平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR与质粒限制性酶切鉴定后,对目的片段进行测序。结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段ORF大小为198bp,用Blast程序进行检索比较表明该序列与Genbank中发表的鸡Gal-1 cDNA编码区序列同源性高达99.5%。该cDNA序列编码65个氨基酸,包括信号肽、前片段和成熟肽,成熟肽由40个氨基酸残基组成。     

柞蚕蛹全长cDNA文库的构建和随机EST测序

采用RNA转录5′末端转换(SMART)技术构建了柞蚕(Antheraea pernyi)蛹的全长cDNA文库。所构建cDNA文库的容量为5×105个独立克隆,插入片段长800~2500 bp,且90%的插入片段大于1 kb。随机挑取288个克隆进行表达序列标签(EST)测序,有效序列为250条,根据EST测序结果计算文库重组率达95%。经序列拼接得到175个unigenes,通过序列比对发现其中97个unigenes与GenBank中的已知基因高度同源,且有88条全长序列,基因的完整性比率达90%。在随机EST测序中获得了具有5′端和3′端非编码区的延伸因子-1α基因(Gen-Bank登录号:FJ788508),该基因cDNA全长1743 bp,有一个1392 bp的开放阅读框,编码含463个氨基酸残基的蛋白,蛋白的理论分子质量为50.4 kD,等电点8.96。EST测序分析表明,柞蚕蛹cDNA文库符合构建基因文库的质量要求,该文库的构建将有助于柞蚕功能基因的克隆和研究。     

柔嫩艾美耳球虫裂殖子全长cDNA文库的构建及应用

为克隆柔嫩艾美耳球虫裂殖子阶段的功能基因的全长序列,利用SMART技术,采用Clontech公司的Creator TMSMARTTMcDNA Library Construction Kit构建了鸡球虫裂殖子的全长cDNA文库。用试剂盒提取mRNA后,以cDNA合成试剂盒合成cDNA。连接至pDNR-LIB载体,用电转化法将重组质粒转化到E.coli DH10B内得到原始文库,扩增后保存于-80℃冰箱内;最后以文库为模板,分别以研究室已成功克隆序列(EtSAG2、EtMIC-2、EtMCAT)及Sanger的部分EST序列(Contig1218)设计引物,进行PCR扩增并测序检验文库的实用性。经测定,构建的初级cDNA文库约含有8.72×107个重组子,插入的片段多在1kb～3kb之间,平均插入片段长度约1.8kb,扩增后文库保存的滴度为2.4×104 cfu/mL;通过文库的PCR扩增,不仅可以成功扩增出研究室已成功克隆的序列(EtSAG2、EtMIC-2),并成功获得EtMCAT和EST序列(Contig1218)的全长cDNA序列,经比对分析Contig1218所编码的蛋白为组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶(Cathepsin B)。结果表明,已成功构建了柔嫩艾美耳球虫裂殖子高质量的全长cDNA文库,从而为筛选鸡球虫的功能基因全长序列奠定了基础。     

禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)HA基因序列分析

采用RT_PCR技术,以A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)RNA为模板,扩增了1.73kb 的HA 全基因cDNA。将HAcDNA克隆后进行了序列测定,测序结果表明所扩增的1728 个核苷酸片段包含了完整的HA基因的开放阅读框架和上下游引物序列、蛋白质合成的起始密码子和终止密码子。核苷酸序列比较分析结果表明:A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1) 与A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)有11 个核苷酸差异,同源率99.4% ;与A/HongKong/156/97(H5N1) 有25 个核苷酸差异,同源率98.6 % ;与A/Chicken/HongKong/258/97 (H5N1) 有30 个核苷酸差异,同源率98.3% ;它们的氨基酸序列同源率依次分别为99 .2 % 、98.6% 和98.1% 。受体结合位点的氨基酸序列完全一致;HA裂解位点氨基酸序列也完全一致,各有5 个碱性氨基酸插入。这说明上述4 个流感病毒分离株可能来自同一个祖先,具有相同的毒力和相似的生物学特性。     

6株猪流感病毒分离株HA部分基因的克隆和序列分析

从6株H1N1亚型猪流感病毒(SIV)中提取RNA，用RT-PCR法扩增了其HA基因的部分cDNA片段，克隆后测定其核苷酸序列，并推导出相应的氨基酸序列。结果表明，扩增的6，株SIV HA部分基因长度均为1005个核苷酸，共编码335个氨基酸，氨基酸序列同源性在98．2％～100％之间。HA部分基因核苷酸序列与已发表的中国香港、中国大陆、美国及欧洲分离的经典H1亚型毒株相近，核苷酸和氨基酸序列同源性均在95％以上，同属H1亚型，系统发育分析表明6个SIV分离株均属于经典H1亚型，与欧洲类禽SIV分离株亲缘关系较远，其HA1、HA2之间切割位点序列均为PSIQSR↓G，从分子水平推论，均属于非高致病力毒株；其HA2氨基端的14个氨基酸残基均为GLFGAIAG—FlEGGW，且高度保守。从分子流行病学角度证实经典H1亚型WIV毒株在广东多个猪场猪群存在。     

仙居鸡抑制素/活化素βB亚基成熟区cDNA的克隆及序列分析

根据发表的哺乳类抑制素 /活化素 βB亚基 c DNA序列设计引物 ,运用 RT- PCR技术从仙居鸡卵泡的颗粒细胞总RNA中扩增出抑制素 /活化素βB亚基成熟区序列 ,并进行了克隆和测序。结果显示 ,鸡成熟βB亚基是由 115个氨基酸(aa)残基组成的蛋白质 ,具有 9个半胱氨酸残基 ,与发表的哺乳类相应序列对比 ,其核苷酸序列的同源性为 79.7%～82 .9%,其编码氨基酸序列的同源性为 95 .7%～ 98.3%。 βB亚基成熟区半胱氨酸残基的数目和位置与发表的哺乳类相同。说明该亚基的序列及结构在不同物种间具高度保守性 ,提示抑制素 /活化素 βB亚基可能具重要的生理功能。     

犬瘟热病毒TN野毒株核蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中收录的犬瘟热病毒(CDV)Onolerstepoort株核蛋白基因(N)序列，设计了1对特异性引物，用该引物对分离的TN野毒株进行了RT-PCR扩增；将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM-T质粒连接，得到重组质粒pTN。经核苷酸序列测定，CDVTN株N基因的ORF全长1569bp，编码523个氨基酸；将TN野毒株与GenBank中收录的其他CDV毒株进行比较，N基因核苷酸序列的同源性为94％～99％，推导的N蛋白氨基酸序列的同源性为97％～99％。TN株与Onderstepoort疫苗株氨基酸序列的差异主要集中在N端(17～159位)和C端(408～519位)。中间的区域则高度保守。此外，在CDVN蛋白N端281～289位上也发现存在与麻疹病毒(MV)N蛋白完全相同的Y-P-A-L-G-L-H-E-F9肽序列，推测可能是诱导CTL活性的靶蛋白的抗原表位之一。氨基酸组成分析发现，推导的N蛋白氨基酸序列中亮氨酸、丝氨酸和异亮氨酸所占比例很高，提示该蛋白具有高度螺旋和缠绕的分子结构。     

镰形扇头蜱丝氨酸蛋白酶SP30基因的克隆及原核表达

根据丝氨酸蛋白酶保守性氨基酸序列设计引物,以镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA为模板,经PCR扩增得到SP30基因的保守区,通过5’RACE(rapid amplification of cDNA Ends)和3’RACE技术得到全长基因。将该基因连入原核表达载体pGEX-4T-1,经IPTG诱导纯化得到重组蛋白。以镰形扇头蜱卵、幼蜱、若蜱、成蜱各发育阶段的cDNA为模板进行Real-timePCR实验。结果显示,SP30基因全长1194 bp,开放阅读框长900 bp,编码299个氨基酸,预计蛋白分子质量30 kDa。Real-time PCR分析结果表明,该基因在四个不同的发育阶段均有不同程度的表达。     

大片吸虫成虫cDNA文库的构建和组织蛋白酶L1基因的克隆

目的大片吸虫cDNA文库的构建及组织蛋白酶L1(Fasciola gigantica Cathepsin L1,FgCL1)基因的克隆。方法提取大片吸虫成虫总RNA,运用SMART技术构建大片吸虫cDNA文库。根据文献设计并合成PCR引物,从上述文库中克隆大片吸虫FgCL1基因,定向克隆至原核表达载体pET28a中。结果文库容量为2.08×106pfu/mL,重组率为98%。扩增后的文库滴度为6.23×109 pfu/mL,插入片段平均大小约为1 000 bp。应用两个已知基因(FgCL1 FgGST)从文库中成功钓取到相应的全长基因。将含有FgCL1的阳性克隆测序,用Genebank Blast进行序列比较,证实为FgCL1基因。结论成功构建了cDNA文库,提供筛选大片吸虫基因资源;从该文库中克隆出FgCL1,为进一步表达该基因,研制诊断试剂盒创造了条件。