编码日本血吸虫CIAPIN1 cDNA的克隆及其重组蛋白的原核表达

本研究利用生物信息学并结合分子生物学实验对日本血吸虫细胞因子诱导凋亡因子CIAPIN1（cytokine induced apoptosis inhibitor 1）基因进行了初步研究。研究表明日本血吸虫存在CIAPIN1同源基因,将其命名为SjCIAPIN1,SjCIAPIN1基因已知cDNA长1143 bp,包括完整的CDS,编码276个氨基酸,预测分子量为30.55863 kDa。通过原核表达系统对该蛋白进行了重组表达和纯化,并制备了多克隆抗体制备。Western blot分析表明,本研究制备的多克隆抗体能与SjCIAPIN1重组蛋白特异识别。     

日本血吸虫正常发育和发育阻遏雌虫的转录组差异分析

为探讨日本血吸虫雌虫生长发育、性成熟及产卵的调控机制,本研究采用RNA-seq高通量技术对25日龄两性感染而来的正常发育雌虫(MF)和单性感染而来的发育阻遏雌虫(SF)的转录组进行测序、定量及差异基因的筛选。从MF和SF中分别获得3 696 376条和3 662 109条clean reads,将clean reads与日本血吸虫基因组数据库进行匹配发现2组样本的匹配率皆达79%以上。以|Log_2 Ratio|≥1, p-Value0.001为筛选条件,得到775个在MF和SF间差异表达的基因,其中有401个基因在MF中高表达,374个基因在SF中高表达。利用荧光实时定量RT-PCR对差异基因进行验证,结果与RNA-seq相符。生物信息学分析表明,在MF中高表达的基因多与代谢和生物合成过程相关,这些过程对于促进和维持雌性性成熟和产卵至关重要;而在SF中高表达的基因多与运动和细胞通讯等功能相关。这些发现可为深入研究日本血吸虫雌虫生殖发育以及产卵的生物学机理提供一定的理论依据。     

日本血吸虫Sj32KD抗原基因的克隆、表达及诊断应用

目的开展日本血吸虫中国大陆株Sj32KD抗原基因研究,探讨其作为诊断抗原的潜力。方法应用PCR方法克隆Sj32KD抗原基因,并在大肠杆菌系统中进行表达,利用H is亲和层析方法纯化融合蛋白,并应用重组的Sj32KD抗原检测羊日本血吸虫病。结果克隆了ORF为1 272bP的日本血吸虫中国大陆株Sj32KD抗原基因,成功构建表达质粒Sj32-pET28 a,并在BL21(DE3)菌株中获得了分子量为47KD的特异性表达产物。应用Sj32KD重组抗原应用于检测羊日本血吸虫病,结果阴性血清的特异性为85.71%,阳性血清的敏感性为95.45%。结论成功克隆表达了日本血吸虫Sj32KD抗原,原核表达融合蛋白有一定的诊断应用潜力。     

编码日本血吸虫Akt蛋白的cDNA克隆及原核表达

本研究利用生物信息学分析日本血吸虫编码Akt蛋白的cDNA并对编码该蛋白的cDNA进行了克隆和原核表达。生物信息学分析表明日本血吸虫存在两个Akt蛋白。利用PCR将其中一个Akt蛋白催化功能域的编码cDNA进行了克隆,并利用原核表达系统对此蛋白片段进行诱导表达并进行了重组蛋白的纯化,将重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。Western blot分析表明,该抗体能被日本血吸虫Akt重组蛋白特异性识别。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

日本血吸虫中国大陆株Sj23抗原基因在家蚕细胞中的表达及鉴定

将日本血吸虫 2 30 0 0膜蛋白 (Sj2 3抗原 )基因从原核表达载体 p ET2 8(c)中亚克隆入转移载体 p Bac PAK- His1,构建了 p Bac PAK- his1- Sj2 3转移载体 ,并与线性化家蚕杆状病毒共转染家蚕细胞 ;经 PCR鉴定得到重组病毒 ,经过蓝、白斑筛选得到纯化的重组病毒 ;SDS- PAGE显示日本血吸虫 2 30 0 0膜蛋白基因在家蚕细胞中实现表达 ,蛋白的相对分子质量为 2 6 0 0 0 ;重组 Sj2 3经 Western- Blot鉴定能够识别血吸虫感染多克隆兔血清     

日本血吸虫精氨酸酶的克隆表达及酶活性分析

为解析日本血吸虫精氨酸酶的功能,本研究克隆了SjARG基因、长度为1095 bp,并将该基因克隆一到原核表达载体pET-28a,获得重组质粒pET-28a-SjARG,并在大肠杆菌中成功表达,Western blot显示重组蛋白具有良好的抗原性;通过酶活性分析显示,重组蛋白SjARG在添加Mn2+后活性得到提高,酶活性大小为502 U/mg,Km值为82.7mM。该研究结果为进一步深入研究该基因的表达特性、酶学性质以及候选疫苗分子研究方面提供了基础。     

日本血吸虫丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶基因的表达及其免疫保护试验

为研究日本血吸虫丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶（SjPP）的免疫功能，构建了原核表达重组质粒pET28a（＋）-SjPP，转化大肠埃希氏菌BL21（DE3）进行诱导表达，并用重组蛋白进行了小鼠免疫保护试验，免疫剂量为每次20μg／只，共免疫3次。结果表明，pET28a（＋）-siPP／BL21（DE3）在0．1mmol／L IPTG诱导2h时，每1g菌体可产生17．8mg以包涵体形式存在的重组蛋白；重组蛋白免疫小鼠后诱导产生了高效价的血清特异性IgG抗体，并获得了部分减虫率、肝组织减卵率和显著的粪便减卵率，具有一定的免疫保护作用。     

日本血吸虫编码抱雌沟蛋白保守区cDNA片段的克隆表达及其免疫保护功能

本研究根据曼血吸虫抱雌沟蛋白（Gyncophoral canal protein)基因SmGCP保安区片设计－对引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用TR－PCR法扩增出一大小为868bp的基因片段。测序后分析序列推断该片段与SgGCP相应片段碱基同源性86．6％。说明所克隆的基因为编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因,推断的氨基酸序列同源性为84．1％,将其克隆到表达载体pET28（a)中,在大肠杆菌BL21中获得了较高量的融合表达,表达产物分子量为29KD。利用因吸虫成虫粗抗原免疫大白兔所得抗血清对该表表达产物进行Westernblto检测,在预测位置出现了明显的识别条带,显示了该表达产物良好的抗原性。将该表达产物用佐剂处理免疫昆明系小鼠攻击血吸虫尾蚴,7周后剖杀小鼠冲虫,进行成虫和虫卵计数,其数虫率为35．2％,减卵率为37．8％,与对照组比较差异显著,初步证明血吸虫抱雌沟蛋白具有一定的免疫保护功能。     

日本血吸虫Wnt受体蛋白SjFz5在不同发育阶段的组织定位及mRNA表达水平分析

为研究日本血吸虫(Sj)Wnt信号分子受体SjFz5(Frizzled5)在Sj生长发育中的作用,本实验对其在不同发育阶段的mRNA转录水平及组织分布进行了检测,并采用定量PCR方法比较SjFz5基因在Sj不同发育阶段间的mRNA水平差异。以7 d童虫cDNA为模板,扩增SjFz5基因编码胞外区CRD(Cystein rich domain)的基因片段,构建pET-SjFz5-CRD表达重组质粒进行原核表达。以纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并进行SjFz5蛋白的组织定位。结果显示:SjFz5基因mRNA在发育早期表达水平相对较高,其中7 d童虫中表达量最高,13 d和18 d童虫下调了约1/3。23 d及其后雌雄虫的表达水平继续下调,雄虫下调比雌虫略显缓慢。整个成虫阶段SjFz5 mRNA维持在一个相对较低的水平。免疫组化结果显示SjFz5蛋白在虫体组织中分布广泛,其中雌雄虫生殖器官组织中的分布最为明显。随着卵巢和睾丸的逐步发育,SjFz5蛋白的量也呈现增加的趋势。SjFz5 mRNA在7 d童虫内表达量最高,SjFz5蛋白在雌雄生殖器官组织中分布最为明显,提示其介导的Wnt信号通路可能参与调节童虫阶段的细胞增殖、器官分化,并可能调节两性生殖细胞的发育。     

3个日本血吸虫新基因的克隆和分析

为获得新的可表达保护性抗原分子的编码基因 ,以重复感染兔血清为探针 ,筛选日本血吸虫成虫 c DNA文库 ,对获得的阳性克隆进行 PCR鉴定并测序后 ,通过互联网将测序结果进行同源性分析 ,并对新基因的编码阅读框及其编码蛋白质的结构及功能进行预测。 3个日本血吸虫新基因 IR1、IR2、IR3在 Gen Bank的登录号分别为 AY1 70 31 3、AY1 73930、AY2 5 1 4 81。 BL AST分析结果表明 ,它们与 Gen Bank中其他基因无显著的同源性。其中 IR3为全基因 ,含897个碱基 ,编码 2 99个氨基酸 ,推测等电点 ( p I)为 6 .0 9,相对分子质量约为 331 90     

日本血吸虫Wnt1基因的鉴定及在不同发育阶段表达水平分析

为研究Wnt信号通路对血吸虫发育的调节作用,本研究克隆鉴定了日本血吸虫的Wnt1基因(SjWnt1).序列分析显示,SjWnt1蛋白具有Wnt信号蛋白家族的结构功能域,但比高等生物的Wnt1少一个保守的Cys.mRNA和蛋白的定量分析结果显示,SjWnt1表达于血吸虫的整个发育过程,而在虫卵和早期童虫中呈高表达水平,提示SjWnt1对卵胚发育和早期童虫的细胞分化具有调节作用.来源于非适宜宿主及单性感染的发育不良虫体中SjWnt1 mRNA水平比发育正常的虫体高,表明不良发育的虫体相应的Wnt信号阻滞.SjWnt1表达下调后则引起Wnt/β-catenin、Wnt/PCP及Wnt/Ca2+通路的相应下游基因的mRNA水平下降,推测SjWnt1可能通过这3种传递途径行使信号传递的功能.     

日本血吸虫童虫液氮冷冻保藏期的研究

日本血吸虫童虫经２４ｈ到２年冻藏后，其活力和感染率与冻藏时间长短不相关，与冻存培养液的ｐＨ相关，最佳ｐＨ为７。冻藏５０ｄ传至Ｆ４，冻藏２年传至Ｆ１。童虫及其子代在终宿主小鼠和中间宿主钉螺体内的移行、生长、发育、繁殖、传代、性别比率及对终宿主的致病力，同相应对照组无明显差异，由此证明日本血吸虫童虫可用液氮冻藏长期保种。     

猪ERK6基因编码区的克隆及组织表达谱分析

利用RT-PCR方法扩增了猪ERK6基因编码区的序列，将扩增产物与pMD18-T载体连接，构建了重组质粒；重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序；采用Northern杂交和半定量RT-PCR方法在猪不同部位骨骼肌中分析了ERK6基因转录本的个数、大小及组织表达谱。结果显示，所克隆的猪ERK6基因片段长1113bp，含有1个1104bp的开放阅读框（ORF），该ORF编码367个氨基酸；该基因与已报道的人ERK6基因核苷酸序列相似性为90％；猪ERK6基因在肌肉组织中只有一个转录本，大小约1．5kb。此基因在骨骼肌中的表达量最高，心、子宫次之，卵巢最低；而在脂肪、胃、肝、脾、肺、肾、十二指肠和胰腺中未见表达。结果表明，猪ERK6基因与已报道的小鼠和人ERK6基因一样，主要在骨骼中特异表达。     

鸭毛囊中ASIP基因片段的克隆及组织表达分析

根据GenBank发表的鸡刺鼠信号蛋白(ASIP)基因序列的同源保守区域,设计了1对特异性引物。以番鸭、高邮鸭和英系北京鸭(即樱桃谷鸭)毛囊RNA为模板,经扩增、测序及拼接得到的部分mRNA序列均为编码序列,共308bp,对应编码102个氨基酸。与已发表的原鸡和鹌鹑的ASIP对应的mRNA核苷酸序列进行比对,番鸭、高邮鸭和英系北京鸭的同源性均在92.53%以上,相应编码的氨基酸序列同源性均高于92.16%。高邮鸭与英系北京鸭核苷酸,氨基酸序列一致,同源性为100%。半定量PCR结果显示,番鸭ASIP基因表达具有较高的普遍性,在皮肤组织(毛囊和皮肤)和中枢神经系统(下丘脑)及其他非皮肤中均有表达。皮肤和毛囊的表达差异不显著(P>0.05),下丘脑中的ASIP基因相对表达量最高,极显著高于皮肤中ASIP基因的表达量(P<0.01),而与毛囊中的差异不显著(P>0.05)。     

柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG2基因的克隆与表达

根据生物信息学预测的基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA扩增获得了鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原2(surface antigen 2,SAG2)基因序列,将其与pGEM-T easy载体连接后转化E.coliDH5α,筛选阳性克隆,以带有限制酶切位点的特异性引物用PCR方法扩增不含SAG2 N端信号肽序列的ORF序列后克隆至表达载体pET-32 a(+),构建了重组表达质粒pET-32 a(+)-SAG2,并将其转化至E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导,获得了SAG2重组抗原在大肠杆菌的高效表达,重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,融合蛋白的分子量约为47 ku。菌体经超声处理后进行SDS-PAGE分析表明,表达蛋白以包涵体的形式存在。     

旋毛虫肌幼虫分泌性蛋白P49基因的克隆与表达

通过设计、合成引物，以旋毛虫RNA为模板，用RT—PCR法扩增出旋毛虫P49序列，并进行了序列测定。将P49基因亚克隆至表达载体pET—28b中，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经IPTG诱导表达，作SDS—PAGE及Western blot分析。结果表明，PCR法扩增出P49序列，其大小约为960bp，将构建的重组质粒pGEM—P49进行序列测定表明其与Genbank中的P49序列具有高度的同源性。成功构建了重组表达载体pET—P49；SDS—PAGR及Western blot分析表明，表达产物分子量约为38kDa，约占菌体总蛋白的7％左右，且能被感染旋毛虫猪阳性血清所识别。     

猪附红细胞体SRP54基因的克隆及真核表达质粒的构建

为了研究猪附红细胞体信号识别颗粒54（SRP54）基因的功能,试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体KI₃806全基因组序列（登录号为NC₀15153.1）中信号识别颗粒（SRP）蛋白基因设计合成1对特异性引物,采用PCR方法扩增猪附红细胞体SRP54基因片段,将扩增产物克隆至pMD18-T载体上,重组质粒经PCR和酶切鉴定后测序,并将SRP54基因与pVAXⅠ真核表达载体连接。结果表明:克隆的SRP54基因片段长1 173 bp,与GenBank中原序列同源性为97%,构建的真核表达质粒pVAXⅠ-SRP54经PCR和酶切鉴定正确,为猪附红细胞体SRP54基因的后续研究奠定了基础。