利用H9亚型的HA1蛋白建立ELISA抗体检测方法

该试验对ELISA反应条件进行摸索,并确定了最适工作条件。结果表明,重组蛋白最适包被浓度为200倍稀释,最适包被条件为4℃过夜,血清稀释度为1∶50,HRP-兔抗鸡IgG的最适工作浓度为1：1000,待检血清和酶标二抗的反应时间均37℃30min,底物在室温显色10min。根据已经建立的ELISA方法及反应条件,确定阴阳性临界值为0.109。     

禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测方法的建立

将禽流感病毒H7亚型标准抗原作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫合格的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合。通过血凝抑制试验,筛选得到12株杂交瘤细胞上清具有HI效价,且与禽流感病毒H7亚型阳性血清间具有较好的竞争效果。将竞争效果最好的1H11细胞扩大培养后制备腹水,获得的单克隆抗体具有效价高、特异性好等特点。使用H7标准抗原包被ELISA板,将HRP标记的单克隆抗体作为竞争抗体,建立了一种禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测方法。利用该方法对待检血清进行测试,与HI试验有99.3%的符合率,说明试制的禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测试剂盒可以用来检测禽流感病毒H7亚型抗体,且操作简便快捷,可批量操作,大样本检测鸡群抗体水平。     

鄂西北地区规模化鸡场H9亚型禽流感抗体水平监测

本试验旨在了解鄂西北地区规模化鸡场鸡禽流感(H9亚型,下同)免疫水平。2007年8月—2010年5月对鄂西北地区65个鸡场接种H9禽流感疫苗20 d后的鸡随机采集血样2311份,应用ELISA方法对血清的禽流感抗体水平进行监测调查。调查结果表明,所检测的2311份血样中,2007年检测11家鸡场共135份血样,104份阳性,阳性率77.0%,强阳性83份,强阳性率61.5%。其中,免疫合格鸡场4家,占受检鸡场36.4%;2008年检测25家鸡场共985份血样,883份阳性,阳性率89.6%,强阳性732份,强阳性率74.3%。其中,免疫合格鸡场21家,占受检鸡场84.0%;2009年检测16家鸡场共433份血样,348份阳性,阳性率80.4%,强阳性277份,强阳性率64.0%。其中,免疫合格鸡场12家,占受检鸡场75%。2010年检测13家鸡场共758份血样,638份阳性,阳性率84.2%,强阳性575份,强阳性率75.6%。其中,免疫合格鸡场11家,占受检鸡场84.6%。2007年禽流感的血清抗体水平较低,相比较,2008—2010年有了明显增加。受检的规模化鸡场仅部分能达到保护水平,且各鸡场的免疫合格鸡比例方面存在较大差异。     

H3N2亚型犬流感病毒重组HA1蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种H3N2亚型犬流感病-毒(CIV)血清学检测方法,本研究利用CIV重组HA1蛋白作为检测抗原,建立H3N2亚型CIV抗体的间接ELISA检测方法,并优化反应条件.通过检测阴性血清样本30份确定其临界值为0.228.该方法与抗猪流感病毒H1N1、H1N2、H6N6、H9N2的阳性血清和犬瘟热病、犬细小病、犬副流感的阳性血清均无交叉反应.变异系数在1.01％～7.52％之间,具有较好的重复性.通过对150份临床样品进行检测并与血凝抑制试验检测结果比较,总符合率为98.6％.本研究为CIV流行病学调查提供了一种快速、方便、敏感的抗体检测方法.     

H9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据H9亚型禽流感病毒HA基因上的保守序列,设计合成引物,以阳性H9亚型禽流感病毒HA基因重组质粒为标准品做标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应检测方法。结果表明:本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.997,灵敏度约为6拷贝/μL,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好,重复性佳,对193份临床泄殖腔棉拭样品的检测,其结果与经典病毒分离方法符合率大于90.0%。该方法为H9亚型禽流感病毒检测提供了一种特异、敏感、快速、较便宜、高通量、生物安全性好的定量检测手段,将在禽流感病毒临床样品快速筛检、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。     

H9和H6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

试验旨在建立可同时鉴别检测H9和H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的二重RT-PCR方法。根据GenBank中H9和H6亚型AIV的HA基因保守序列,分别设计2对特异性引物,优化引物浓度与退火温度等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H6亚型AIV的二重RT-PCR检测方法。用该法对H9和H6亚型AIV混合感染样品、H9亚型AIV单一感染样品和H6亚型AIV单一感染样品进行扩增,结果均得到对应的目的条带,而对其余亚型AIV及其他禽病病原体均未扩增出特异性条带。该法对H9和H6亚型AIV的检测下限均为5×10⁴拷贝/μL。本研究建立的二重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、稳定性和重复性良好,可同时鉴别检测H9与H6两种亚型AIV,为H9与H6亚型AIV的监测提供技术支撑。     

H9亚型禽流感病毒免疫层析快速检测试剂盒的研制及应用

利用胶体金免疫层析技术,在建立H9亚型禽流感病毒免疫层析检测方法的基础上组装成试剂盒.试剂盒由试纸卡,稀释液、样品管、塑料吸管、一次性手套及说明书组成.对试剂盒的特异性、敏感性、保存期和重复性等进行了测定.结果表明,试剂盒在室温可以保存6个月,4℃可以保存12个月;与HA试验相比特异性强、灵敏度高、重复性好,操作简单、方便、快捷,能在10 min内准确检测出样品中是否含有H9亚型禽流感病毒.先后制备了5批试剂盒,对武汉市及周边地区的鸡场共抽检498份样品,经病毒分离鉴定准确率达到100%.     

H5亚型禽流感病毒反应原性差异及ELISA检测方法的研究

在获得禽流感病毒多克隆抗体及H5亚型特异性单克隆抗体的基础上,建立了H5亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法。通过分析不同单克隆抗体与不同禽流感毒株的反应性差异,筛选高特异性和高敏感性的H5亚型单克隆抗体。优化反应条件,确定包被抗体、检测抗体及酶标抗体的最佳工作浓度,进行敏感性、特异性、重复性及稳定性分析,并与斑点ELISA、H5N1多重RT-PCR或病毒分离鉴定的结果相比较,同时使用该方法对野外样品进行了检测。结果表明,该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于检测临床样品、鸡胚培养物及细胞培养物中的H5亚型禽流感病毒。     

禽流感病毒N9亚型RT-PCR检测方法的建立

为建立一种简便、快速、灵敏、准确的禽流感病毒N9亚型检测方法,根据GenBank中收录的禽流感病毒N9亚型高度保守的基因序列设计引物,通过优化反应条件建立禽流感病毒N9亚型RT-PCR检测方法,并对该方法进行灵敏度、敏感性、特异性试验和临床样品检测。建立了禽流感病毒N9亚型RTPCR检测方法,用该方法检测时,H7N9、H10N9均呈阳性,而非N9亚型的禽流感病毒及新城疫病毒等其他禽传染病病毒均呈阴性,能检测到1/32血凝单位的H7N9禽流感病毒。建立了禽流感病毒N9亚型RTPCR检测方法,具有操作简便、灵敏度高、特异性强的特点,值得推广应用。     

禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法的建立

为了简便、快速、准确的检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H5、H7、H9亚型(lumpy skin disease virus,LSDV),本研究通过对禽流感病毒HA2基因保守区域的分析,设计、合成特异性引物和探针,结合Taq man-MGB探针技术,建立禽流感病毒H5、H7、H9亚型...     

猪流感病毒H1N1亚型HA蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得H1N1亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体(McAb),选取A/swine/NanChang/H1N1/2009毒株,病毒经增殖、超速离心后,收集病毒粒子作为免疫原,将SIV粒子包被建立了间接ELISA方法。将免疫4次的BALB/c小鼠,经间接ELISA测定小鼠血清效价,将效价高的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(sp2/0)进行融合。采用间接ELISA的方法筛选效价高的阳性细胞孔,采用有限稀释法进行3轮亚克隆,得到了5株杂交瘤细胞株,分别命名为2C6、5G5、1D5、3G3、4F11。随后对5株杂交瘤细胞的亚型进行鉴定,显示2C6、1D5、4F11为IgM亚型,5G5、3G3为IgG1亚型,5株杂交瘤的L链均为k链。间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测表明,5G5能够与HA蛋白发生特异性的结合。本研究为进一步建立H1亚型SIV的相关检测方法及对HA蛋白的功能研究奠定基础。     

抗禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体的抗原结合特性分析

为了解和确定抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体所针对的抗原表位及今后的确切用途，用竞争性结合ELISA试验结合Western-blotting分析，对10株单克隆抗体的抗原结合特性进行了分析。抗体反应增值结果表明，10株单抗针对的是同一大的抗原决定簇，根据增值结果可将10株单抗分成4个亚群。除2A1外，其他9株单抗的ELISA反应增值结果与Western-blot-ting分析结果一致，认为可能是由于2A1与其他9株单抗的免疫原不同所致。     

H5N1和H9N2亚型禽流感病毒型特异性抗原捕捉ELISA检测方法的建立

采用禽流感病毒多克隆抗体及型特异性单克隆抗体，研究建立了型特异性抗原捕捉ELISA检测方法，用于检测H5N1和H9N2亚型禽流感病毒。优化了反应条件，确定了包被抗体、检测抗体及酶结合物的最佳工作浓度，对该方法的敏感性、特异性、重复性及稳定性进行了分析，并与病毒分离鉴定的结果进行了比较。结果表明，该方法敏感、特异，具有良好的重复性和稳定性，可用于临床样品及鸡胚、细胞培养物中禽流感病毒的检测。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗H5N1禽流感病毒(AIV)的单克隆抗体(MAb),本研究以灭活的H5N1亚型A/Chickeen/Guangdong/S2261/2009(H5N1GD261)株免疫4周龄～6周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA及HI筛选获得了3株能稳定分泌抗HA的MAb杂交瘤细胞,分别命名为1A4、2F5和3D3.MAb亚类鉴定表明,2F5为IgM类,其它为IgG2a亚类,轻链均为k链.经血凝抑制检测,3株MAb均能与H5亚型的AIV结合,并具有较好的型广谱性.     

具有HI活性的H1亚型流感病毒特异性单克隆抗体的制备与应用

为了制备具有HI活性的HI亚型流感病毒特异性单克隆抗体(MAb),本研究以H1N1亚型猪流感病毒(SIV)株A/Swine/Guangdong/718/01(H1N1)为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经常规细胞融合后,血凝抑制(HI)方法进行检测,融合细胞经稀释克隆纯化后,获得11株能稳定分泌抗血凝素特异性HI MAb的杂交瘤细胞株。鉴定表明,所获MAb与其他具有血凝活性的病毒以及其他14个HA亚型的流感病毒均不具有HI交叉反应,表明这11株MAb均具有良好的流感病毒亚型特异性。其中A6F、2BBF和2BB与其他H1亚型流感病毒分离株的HI试验证实我国不同地区分离株之间的抗原性存在一定差异。11株MAb对H1SIV抗原的HI试验结果显示其HI效价有明显差异。叠加实验表明这些MAb分别识别HA抗原的不同表位。间接免疫荧光试验表明,2BBF、8HB、1DH、7FC和2BB均可与2009年流行H1N1病毒A/California/04/2009HA抗原发生特异性反应。这些MAb特异性的研制为H1亚型流感病毒的疫情病原学快速诊断以及病毒抗原性变异的相关研究提供了物质基础。     

H9亚型禽流感病毒SD96株HA蛋白特异性单抗的制备及鉴定

本研究用H9N2亚型禽流感病毒分离株A／Chicken／Shandong／6／1996（CK／SD／6／96）免疫6周龄BALB／c雌性小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／0融合。采用血凝抑制（HI）和ELISA方法筛选阳性细胞克隆,连续多次克隆培养后获得3株能稳定分泌H9亚型HA特异性单抗的细胞株1F4C4、9F12D1、2C5H12。3株阳性杂交瘤细胞的培养上清及腹水对CK／SD／6／96的HI效价分别为2^6、2^4、2^1和2^12、2^10、2^7。特异性试验表明该3株单抗均不与其他主要禽类病毒和其他14个HA亚型的禽流感病毒发生交叉反应。1F4C4和2C5H12抗体亚类为IgG2b,9F12D1为IgG2a。这3株单抗对H9亚型不同抗原群流感毒株有不同程度的中和作用,表现出单抗识别抗原住点的差异性,为进一步研究H9亚型流感病毒的抗原性差异以及抗原识别提供了物质基础和条件。     

检测流感病毒H5亚型抗体竞争ELISA方法的建立及初步应用

本研究采用灭活的H5亚型禽流感纯化病毒包被ELISA反应板,以辣根过氧化物酶标记的HA蛋白单克隆抗体作为竞争检测抗体,建立了检测H5亚型流感病毒抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法.实验结果表明:抗原最佳包被浓度为8.27ug/mL(1:800),酶标抗体最佳稀释倍数为1:800,待检血清最佳稀释倍数为1:10.对已知阳性样品的检测结果表明,本研究中所建立的竞争ELISA方法的敏感性高于经典的血凝抑制方法(HI).特异性试验表明该ELISA方法仅能检测H5亚型流感病毒抗体,具有良好的特异性.对临床样品检测表明C-ELISA与HI 方法的符合率达到93%以上.该方法可以对不同种属动物血清H5亚型流感病毒抗体进行快速定量的检测,为H5亚型流感病毒流行病学调查与抗体的检测提供了一种快速、方便、敏感的方法.     

不同检测抗原对H5亚型禽流感抗体检测结果的影响

禽流感（Avian Influenza,AI）是由A型流感病毒引起的禽类的一种急性高度致死性的传染病,尤其是高致病性禽流感（HPAI）,严重威胁着养禽业的生产。实行强制免疫是我国防控H5亚型禽流感的一项重要措施,血凝抑制试验（HI）检测禽流感抗体是对免疫效果进行评价的主要手段。随着H5亚型禽流感疫苗种毒株的不断更新,     

重组H5亚型流感病毒HA1抗原的制备及其特性分析

为获得重组表达的H5亚型流感病毒血凝素(HA1)抗原.将PCR扩增的H5亚型流感病毒HA1基因克隆到原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒pETHA1-H5.结果显示,转化pETHA1-H5的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下以包涵体形式表达了HA1蛋白.HA1重组蛋白能与不同禽类(鸡、鸭和鹅)H5亚型流感病毒阳性血清发生特异性反应,同时以HA1重组蛋白为抗原制备的单克隆抗体具有与H5亚型完整病毒粒子抗原反应的能力,说明重组表达的HA1蛋白保留了自然条件下H5亚型流感病毒的抗原特征.将重组表达的HA1蛋白作为ELISA抗原检测禽血清中的H5亚型流感病毒抗体,以HI试验结果为参考,两者的符合率为96.6%,证明HA1重组蛋白作为ELISA检测抗原是可行的.