LAMP检测沙门氏菌方法的建立

环介导等温扩增(LAMP)是利用设计的4条特殊引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。研究选取沙门氏菌编码DNA解旋酶B亚单位的gyrB基因设计了1套引物,总反应体系25μL,63℃恒温1 h,用LAMP对9株沙门氏菌属扩增的结果均为阳性,而大肠杆菌O216等7株致病菌株扩增的结果均为阴性;LAMP的灵敏度为6.8×101cfu/mL。LAMP检测方法更快速、灵敏,有着较为广泛的发展前景。     

检测鸡蛋中沙门氏菌的LAMP方法的建立及初步应用

根据GenBank上公布的沙门氏菌invA基因序列中的保守区域,设计一套环介导等温扩增(LAMP)引物,将其用于沙门氏菌的检测,结果成功地扩增出特异性的梯形条带。LAMP方法检测沙门氏菌纯培养的灵敏度为1.04×102 cfu.mL-1,对11株不同细菌进行LAMP检测,仅沙门氏菌获得阳性结果。应用该方法对扬州市场上销售的鸡蛋进行沙门氏菌检测,检测结果与传统培养方法相符合。因此,LAMP方法检测沙门氏菌具有灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便等特点,有望发展成为快速检测鸡蛋中沙门氏菌的有效手段。     

猪细小病毒LAMP检测方法的建立

 【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪细小病毒(PPV)环介导等温扩增(LAMP)方法,为诊断猪细小病毒提供准确可靠工具。【方法】根据GenBank公布的PPV序列,在其保守序列区域设计了多套LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程并筛选最佳引物、反应条件,建立了对PPV病毒DNA进行特异扩增的 LAMP检测方法,并可通过加入SYBR Green I肉眼判断结果。【结果】该方法在63℃恒温下作用45 min,PPV病毒DNA获得了高效率的特异性扩增;其检出限量为0.23 TCID50,敏感性高;在反应结束后加入SYBR Green I肉眼判断结果,与Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。通过对20份临床样品的LAMP检测与免疫荧光鉴定、PCR方法比对,符合率均为20/20。【结论】本研究建立的PPV LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏,操作简单、设备要求低的特点,适合用于临床PPV快速检测。     

沙门氏菌LAMP检测方法的建立及其在蔬菜栽培土壤中的应用

[目的] 建立沙门氏菌可视化环介导恒温扩增体系(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),并在快速检测蔬菜栽培土壤中应用,为蔬菜栽培土壤中沙门氏菌的防控提供技术支撑.[方法] 根据沙门氏菌特有侵袭蛋白A (invA)基因序列设计可视化LAMP检测引物,并优化LAMP反应...     

以cytC基因为靶标的LAMP快速检测番茄溃疡病菌方法的建立

以番茄细菌性溃疡病病菌的特异性基因cytC为检测靶标,以番茄溃疡病病菌等8种病原细菌为供试菌株.根据检测靶标设计环介导等温扩增(LAMP)引物并进行特异性和灵敏度检测.结果显示,引物cytC-170能特异性检测出番茄溃疡病病菌,检测灵敏度高达5×105 copy/μL,环引物的加成将试验进程缩短为33.06 min,使...     

青藏高原放牧家畜小肠结肠炎耶尔森氏菌LAMP检测方法的建立及应用

为了建立特异性、敏感性和适用性强的LAMP检测方法,采用分子生物学方法,根据GenBank数据库中该细菌的outL基因,进行了多序列比对和保守区域确定。根据其保守序列,在线设计和筛选了一套LAMP引物。温度优化及特异性和敏感性验证后建立了检测该病菌的LAMP检测方法,并对青藏高原放牧牛、羊临床粪便样品进行了检测。结果表明,LAMP检测方法的最适温度为63℃;检测其与大肠杆菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌及蜡样芽胞杆菌无交叉反应;检测下限为100 fg目的基因;利用建立的方法检测了208份放牧牦牛、藏羊粪便DNA样品,共检测到26份阳性样品,阳性率为12.5%。这表明成功建立了一种检测该病的特异性、敏感性和适用性强的LAMP检测方法。     

玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法的建立

[目的]建立玉米内州萎蔫病菌的快速恒温扩增检测技术.[方法]利用GenBank公布的玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis,Cmn)16S-23S序列设计LAMP(loop-mediated isothermal amplification)引物,建立玉米内州萎蔫病菌LAMP检测体系,并对反应条件进行了优化.[结果] LAMP在内引物、环化引物和外引物比为6∶4∶1(30 pmol∶20 pmol∶5 pmol)的25山体系下64℃反应30 min为最佳反应条件,且LAMP引物能从供试的7种菌株中特异性扩增出Cmn梯度性条带.以玉米内州萎蔫病菌基因组和菌悬液梯度稀释液为模板检测LAMP体系的灵敏度,结果显示,LAMP检测体系针对基因组和菌悬液的灵敏度分别达到了50fg和3.6CFU,比普通PCR灵敏度高100倍.[结果]LAMP检测体系简单、快速、灵敏度高、特异性好,在玉米内州萎蔫病菌检测方面潜力巨大.     

冻鸡肉中金黄色葡萄球菌LAMP快速检测方法的建立

[目的]建立冻鸡肉中金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法。[方法]根据金黄色葡萄球菌特异性耐热核酸酶基因序列设计2对引物,建立LAMP检测方法,并用于检测采购自贵阳市各大超市的冻鸡肉样品。[结果]设计合成的2对引物和建立的LAMP方法检测金黄色葡萄球菌具有良好的特异性,反应体系的灵敏度为65 CFU/m L。检测采购自贵阳市各大超市和经人为污染的264份冻鸡肉样品分别用LAMP方法检测,并用国标方法检测验证,其特异性为95.2%,准确度为97.3%。[结论]该研究建立的方法为实现在冻鸡肉中金黄色葡萄球菌的快速检测奠定了良好的基础。     

青稞条纹病LAMP检测体系的建立

【目的】建立青稞条纹病的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术检测体系,为青稞种子带菌检测及其条纹病的有效防控提供参考。【方法】根据麦类核腔菌（Pyrenophora graminea）的ITS-rDNA序列区间设计5组引物,从中筛选特异性引物,并通过设置60,61,62,63,64和65 ℃ 6个温度梯度来优化LAMP反应体系的温度,以建立高效检测麦类核腔菌的LAMP技术体系;分别以麦类核腔菌、大麦坚黑粉菌、裸黑粉菌、禾生指葡孢霉、细链格孢和禾谷镰孢菌基因组DNA为模板进行LAMP扩增反应,对该体系的特异性进行检测;以310,31,3.1,0.31,0.031和0.003 1 pg/μL的麦类核腔菌基因组DNA为模板,对该体系的灵敏度进行分析;最后利用该体系对肚里黄、柴青1号、1141、北青9号和昆仑15 等5个青稞主栽品种的种子带菌率进行检测。【结果】青稞条纹病LAMP检测体系的特异性引物为引物组2,最佳反应温度63 ℃,反应时间70 min;该检测体系对麦类核腔菌具有良好的特异性,其最低检测限为0.31 pg/μL;肚里黄、柴青1号、1141、北青9号和昆仑15种子的带菌率分别为68.18%,72.73%,100%,77.27%和68.18%。【结论】建立了青稞条纹病LAMP检测体系,该体系能在63 ℃、70 min内检测出青稞种子是否携带条纹病菌。     

猕猴桃细菌性溃疡病可视化LAMP检测方法的建立与应用

为了建立能够广泛应用于田间的猕猴桃细菌性溃疡病快速检测技术,参考国外经验,设计并优化LAMP反应的检测体系,并可将检测结果可视化;同时,测试评价优化后的检测体系的灵敏性及特异性;通过采集猕猴桃不同部位的组织样品,验证优化后的检测体系的田间实际应用效果.结果 表明:该方法能够特异性地检测出Psa病原菌,检测灵敏度达到10...     

环介导等温扩增技术检测沙门氏菌反应体系的优化

[目的]建立快速检测沙门氏菌的环介导等温扩增（LAMP）技术。[方法]以沙门氏菌的特异性基因（invA）序列为靶序列设计引物,并对该序列进行等温扩增;对Mg2＋浓度、反应温度和反应时间扩增条件进行优化,并对沙门氏菌进行检测和鉴定。[结果]在Mg2＋浓度为2.0mmol/L时,62℃反应40min,扩增可达最佳效果,LAMP法检测的灵敏度为7.8cfu/ml。[结论]建立了快速检测沙门氏菌的LAMP技术,该方法灵敏度高、耗时短、方法简便,便于在基层推广,为检测食源性致病菌构建了一个技术平台。     

猪细环病毒1型环介导等温扩增方法的建立

猪细环病毒(Torque teno sus virus,TTSu V)是一种无囊膜,单链的DNA病毒,存在猪细环病毒1型和猪细环病毒2型2个亚型。为建立一种新型快速的TTSu V1检测方法。针对TTSu V1保守的非编码区域(untranslated regions,UTR)设计2对LAMP引物,并对反应体系和反应条件进行了优化调整,建立了TTSu V1 LAMP检测方法。结果表明该方法最佳反应条件为62℃1 h,病毒最低检出限可达9.2 copies/μL,特异性良好。LAMP反应是一种集特异性强,灵敏度高,反应速度快于一体的的基因检测方法,有望成为快速检测TTSu V1的手段之一。     

环介导等温扩增技术的应用及研究进展

环介导等温扩增（LAMP）技术自 2000 年被发明以来以其快速、灵敏、低耗等特点,引起众多研 究者的关注。该技术在人、动物、植物、环境等相关微生物的检测、监控等领域得到了广泛研究与应用,其检 测灵敏度普遍高于传统 PCR 。但是传统 LAMP 技术对于产物检测存在耗时、易造成污染等问题,以及在野外或 医疗点检测时存在判读不便的弊端。就 LAMP 技术与其他多种产物检测技术结合后的方法如目视 LAMP、实时 LAMP、微流控 LAMP、横向流 LAMP 及电化学 LAMP 进行了总结、举例及讨论。目视 LAMP 具有费用低、适合 多环境下使用的特点;实时 LAMP、微流控及电化学 LAMP法能够有效提高样品检测的准确度,且可减少检测时间; 横向流 LAMP 具有可操作性强、便于判读等特点。根据目前 LAMP 技术的研究进展及各技术优劣势的分析,预 测 LAMP 技术未来发展的方向和重点可能为研发手持便携式检测仪。     

环介导等温扩增技术在植物寄生线虫检测中的应用

植物寄生线虫是世界各地农林业生产中一种重要的生物胁迫,如何在早期快速、准确地鉴定出植物寄生线虫种类是减少其危害的重要前提。环介导等温扩增技术因在实际操作中简易、快速和灵敏等特点,已被广泛应用于多种植物病原体的检测和诊断。本文主要就LAMP技术在松材线虫、根结线虫、孢囊线虫、短体线虫、滑刃线虫、粒线虫等重要植物寄生线虫中的应用研究情况进行综述,为针对不同的植物寄生线虫开发和选用最佳的LAMP检测方法提供参考。     

番茄黑环病毒RT-LAMP检测方法的建立

为了快速有效地检测出植物样品中的番茄黑环病毒(tomato black ring virus,TBRV),根据TBRV的保守序列设计RT-LAMP反应的特异引物,通过试验成功建立了TBRV的RT-LAMP特异性检测方法。该方法检测快速,约27 min即可检测到扩增曲线;特异性强,可有效区分同样侵染马铃薯的马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯Y病毒(PVY)、番茄斑萎病毒(TSWV)及番茄环斑病毒(ToRSV);灵敏度高,比普通RT-PCR灵敏度至少高10倍;并可通过肉眼观察反应颜色的变化直接进行结果判断。该方法适用于TBRV的快速检测。     

应用DNA环介导恒温扩增技术快速检测空肠弯曲菌

【目的】空肠弯曲菌是一种重要的人畜共患病致病菌,主要经被污染的水源、乳制品、生禽肉进行传播,建立快速、准确的诊断方法是防控空肠弯曲菌感染的重要措施。【方法】本文引入一种新型的核酸检测技术--DNA环介导恒温扩增 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP),以空肠弯曲菌ORF-C序列为检测靶基因,建立了空肠弯曲菌LAMP快速检测方法。【结果】利用本LAMP方法对21种病原菌进行检测,仅空肠弯曲菌为阳性结果,说明该方法具有高度的特异性。该LAMP方法对空肠弯曲菌纯培养菌的检测灵敏度达6CFU/反应管,对污染材料中空肠弯曲菌的检测灵敏度为9CFU/反应管。【结论】本研究建立的空肠弯曲菌LAMP检测方法操作简便、检测快速,具有良好的实用性。      

环介导恒温扩增技术在植物病原物检测中的应用

环介导恒温扩增反应（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是一种新型的核酸扩增方法,具有特异性强、灵敏度高、操作简单且适合于多种检测环境等优点,自开发以来,其作为一种分子生物学检测技术,被广泛应用于许多领域。简要介绍了该技术的原理,综述了其在植物病原物检测方面的应用,讨论了其在应用中出现的问题,并针对这些问题提出了相应的解决办法,最后展望了其应用前景。     

等温荧光定量沙门氏菌快速检测试剂盒的评价与应用

食源性致病菌的快速检测一直是保障食品安全的关键。沙门氏菌(Salmonella)是重要的食源性致病菌之一。本研究以沙门氏菌人工污染的3种样品为对象,对一种基于环介导等温荧光扩增技术的沙门氏菌快速诊断试剂盒进行了灵敏度和准确性评估;再以该试剂盒对市售食品样品和临床腹泻样品适用性进行验证。结果表明,该等温荧光定量沙门氏菌快速检测试剂盒的检测限为10~3 CFU/mL,准确性96.7%以上。所有不同样品的结果显示:阴性样本的假阳性率分别为0.0%、3.3%和3.3%;阳性样本检出率分别为97.9%、100.0%和65.7%(含低浓度细菌污染样品)。该试剂盒具有检测周期短、操作简便、适用性广等特点。     

环介导等温扩增技术的引物设计与筛选研究

[目的]研究引物设计与非特异扩增之间的关系.[方法]以单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的特异性基因hlyA与沙门氏菌（Salmonella）的特异基因invA为例设计引物,进行环介导等温扩增.[结果]就环介导等温扩增的任何2条引物而言,如果2条引物3’端的3～4碱基在同一条引物上都有2个互补序列,在常用的LAMP反应体系与反应条件下,必然有非特异性扩增,LAMP引物设计与筛选应避免这种情况出现.[结论]按照该试验的原则设计引物,可降低非特异性扩增.