龙眼胚性愈伤组织2个乙烯受体基因的克隆及序列分析

以龙眼胚性愈伤组织为材料,采用同源克隆和RACE方法分离得到两个乙烯受体基因的cDNA序列,即DL-ETR1和DL-ERS1,并在GenBank登录(检索号分别为FJ513322和FJ513323)。DL-ETR1全长为2611bp,包含长2223bp的完整的开放阅读框(ORF)以及388bp的3-UTR,3'poly(A)尾长24bp;DL-ERS1全长为2259bp,包含一个1929bp的ORF及330bp的3-UTR,3'poly(A)尾长17bp。两者根据核苷酸序列推测的蛋白质具有61.62%的同源性,在N端的同源性较C端高,DL-ERS1比DL-ETR1少104个氨基酸,DL-ERS1的蛋白在C端缺乏信号接受域,HisKA、ATPase_c以及GAF是它们共有的结构域,同属ETR1亚类乙烯受体。     

龙眼胚性愈伤组织γ-ECS基因的克隆及表达分析

γ-ECS基因编码的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶是细胞内谷胱甘肽（GSH）从头合成的限速酶。以龙眼转录组数据库为基础,采用同源克隆的方法从龙眼胚性愈伤组织中分离得到γ-ECS基因cDNA全长序列,在GenBank上的登录号为JF815477。γ-ECS基因序列全长1 812 bp,包括17 bp 5′UTR及254 bp 3′UTR;ORF长度为1 541 bp编码511个氨基酸。生物信息学分析结果表明,龙眼胚性愈伤组织γ-ECS的核甘酸序列及其推导的氨基酸序列分别与蓖麻、毛果杨等具有较高的同源性;γ-ECS为1个具有跨膜结构的非分泌蛋白,具有亲水性;亚细胞定位于过氧化物酶体,不含信号肽,并存在亮氨酸拉链结构。龙眼胚性愈伤组织γ-ECS基因在龙眼体胚发生过程中的整体表达趋势是先升高,后降低,其表达量在心形胚阶段达到最大值之后在鱼雷形胚阶段急剧下降。γ-ECS基因表达量变化可能与GSH在龙眼体胚发生过程中的含量变化一致。     

龙眼古树胚性愈伤组织Dlwrky44基因的克隆及分析

参考龙眼转录组数据库信息,以莆田宝庵寺的龙眼古树“宝树”幼胚诱导的胚性愈伤组织作为试验材料,获得了龙眼古树wrky44基因的全长序列,命名为Dlwrky44,登录号为JF709012,共2313 bp,其中3′UTR458 bp,poly A尾长25 bp,5′UTR 735 bp,并包含1个1119 bp的开放阅读框,编码373个氨基酸.根据推导的氨基酸序列进行生物信息学分析结果表明:D1WRKY44蛋白是不稳定、亲水蛋白;无信号肽和跨膜结构,亚细胞定位于细胞核中;具有2个WRKY结构域,并具有核定位信号,在wrky家族中属第1类.系统进化树分析结果表明:龙眼古树DlWRKY44蛋白与柽柳亲缘关系最近.对龙眼古树EC Dlwrky44基因在不同低温胁迫条件下(0、5、10、15、20、25℃)处理12h的表达进行了分析,结果表明:Dlwrky44基因的表达量随着温度的逐渐降低,表达量逐渐升高,当温度升到15℃时,表达量达到最高.     

龙眼胚性愈伤组织ACC合成酶基因（DL-ACS1）的克隆及表达分析

以龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织为材料,采用同源克隆和RACE方法分离得到龙眼胚性愈伤组织乙烯合成限速酶DL-ACS1(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase)基因的cDNA全长序列(GenBank,FJ617537),共1 817 bp,包含了5’非编码区(73 bp),开放阅读框(1 437 bp),3’非编码区(307 bp)。该cDNA开放阅读框的氨基酸序列(含478个氨基酸)与其它植物ACS具有77%～63%同源性,属于ACC Synthase家族。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在龙眼体细胞胚胎(以下简称龙眼体胚)各阶段的表达量存在较大的时期差异,其中,球形胚(Stage 5)的表达量最高,鱼雷形胚(Stage 7)的表达量最低。     

龙眼胚性愈伤组织NBS-LRR类抗性基因的同源克隆及序列分析

以龙眼胚性愈伤组织cDNA为材料进行龙眼抗性基因同源克隆(RGA).结果表明:在51个阳性克隆中有29条没有重复的序列与已知抗性基因具有同源性.经多重序列对比发现,29条序列均发现典型的NBS结构,其中26条序列具有完整的NBS结构域基序,包括p-Loop/Kinase-1a[GGV (I/M) GKTT],kinase-2[LVDDVW(D)],kinase3a (GSRⅢTTRD)以及一个疏水的[GL(F)PL(F)AL];3条序列表现为截断的NBS序列,其中有2条出现终止信号.进化树分析发现,29条序列可分为明显的2个类群,仅2条序列归为TNL类群,其余27条均为non-TNL类群.non-TNL类群可以进一步分为4个亚类群,non-TNL-1、non-TNL-2类群与毛果杨BED-NBS-LRR (BNL)基因有较高同源性,non-TNL-1类群kinase-2[LLMDGLW]基序在组内保守,但与已知R基因存在较大差异.通过RACE克隆non-TNL-1成员NBS39全长发现,NBS39氨基酸残基序列N-端具有明显的coiled-coil结构,pfam分析具有NBS及LRR8功能域,但不具有BED-finger结构.     

不同光质对龙眼胚性愈伤组织类黄酮含量的影响

以龙眼胚性愈伤组织为材料,研究不同继代培养基、培养时间和光质对龙眼胚性愈伤组织生长和类黄酮含量的影响。参照前人的研究结果,龙眼胚性愈伤组织分别在含2,4-D和Ag NO3的继代培养基上交替继代培养,测定其在黑暗条件下15、20、25、30、35 d的类黄酮含量,分析其含量变化;在此基础上,分别于红光、蓝光、白光、黄光4种不同的光质下培养愈伤组织,研究不同光质对龙眼胚性愈伤组织类黄酮含量积累的影响。研究结果表明:在黑暗条件下,龙眼胚性愈伤组织在含Ag NO3培养基上培养25 d时类黄酮含量最高为1.857 0%;在不同光质处理下,光质影响类黄酮含量从高到低依次为:蓝光(8.802 3%)红光(4.659 4%)白光(4.272 4%)黄光(2.816 9%)黑暗(1.857 0%)。     

龙眼胚性愈伤组织限制生长保存及其染色体数目变异

以龙眼"红核子"品种为材料,研究甘露醇与肌醇交互培养及蔗糖含量、琼脂含量、盐浓度、PP_(333)浓度、光质等对龙眼胚性愈伤组织(Emhryogenic callus,EC)限制生长保存的影响,结果表明:同时添加20 g/L甘露醇、0.10 g/L肌醇,并把接种量控制在O.1 g/瓶,龙眼EC的继代周期可进一步延长到70 d左右.同时,以"红核子"、"松风本"和"聚龙105"为材料,对保存的龙眼EC及其体胚发生过程中染色体数目的变异进行研究,结果表明:染色体变异始于胚性愈伤组织.但有趋丁稳定的趋势.     

龙眼胚性愈伤组织限制生长保存过程中有机酸含量的变化

试验以限制生长保存的龙眼胚性愈伤组织（Eembryogenic Callus,EC）为材料,测定了龙眼3个品种红核子、松风本、苗翘在4种不同培养基中限制生长保存过程中的有机酸含量的变化。结果表明：龙眼不同基因型以及不同培养基限制生长保存过程中有机酸含量变化都有所不同。红核子EC有机酸含量在A、B、C、D培养基中出现1次积累高峰;苗翘EC有机酸含量在A、B培养基中变化较平稳,在C、D培养基中出现1次积累高峰;松风本EC有机酸含量在A、B、C、D培养基中较平稳。     

龙眼胚性愈伤组织中ELF4家族基因克隆及其表达分析

ELF4家族是植物特有基因,能调节生物钟、调控开花时间、感受光周期和参与幼苗去黄化等。以龙眼松散型胚性愈伤组织为材料,采用RT-PCR结合RACE法克隆了ELF4家族3个成员cDNA全长,分别命名为DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE 4。DlELF4全长599 bp,编码140个氨基酸;DlELF4-LIKE 1全长762 bp,编码142个氨基酸;DlELF4-LIKE 4全长661 bp,编码114个氨基酸;DlELF4家族成员均为不稳定的亲水蛋白,无信号肽与跨膜结构,都含有DUF1313保守功能结构域。进化树分析表明,植物中ELF4家族可分成二个亚组,ELF4与ELF4-LIKE 1聚为一组,ELF4-LIKE 2、3、4聚为另一组。qPCR结果表明：在体胚发生过程中DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE 4表达模式相同,均在球形胚时期表达量极高,而在其它时期表达量很低;DlELF4家族对不同光质和不同处理时间的响应存在差异：DlELF4的表达经24 h处理时可能受绿光和红光诱导,经72 h处理时可能受红光、蓝光和白光诱导;DlELF4-LIKE 1的表达在24 h处理时可能受绿光诱导,经72 h处理时受红光和绿光抑制;DlELF4-LIKE 4的表达在24 h和72 h处理时可能受蓝光和白光诱导。水杨酸和茉莉酸甲酯能促进龙眼胚性愈伤组织中DlELF4家族成员的表达。以上结果表明,ELF4家族可能参与龙眼体胚发生过程中球形胚的形态建成与胁迫应答。     

龙眼体胚发生过程中两个乙烯受体基因的定量表达分析

以龙眼体细胞胚胎发生8个不同发育阶段同步化胚性培养物为材料,采用荧光定量PCR方法,分析两个乙烯受体基因(DL-ETR1和DL-ERS1)的mRNA动态变化水平。试验结果表明:DL-ETR1表达量整体的变化趋势呈近似"W"状,松散型的胚性愈伤组织(Stage 1)的表达量最高,心形胚(Stage 6)阶段的表达量最低;龙眼体胚发生过程的8个阶段均有DL-ERS1基因的表达,子叶形胚(Stage 8)的表达量最高,其它7个阶段的表达量都很低,鱼雷形胚(Stage 7)的表达量极低,几乎不表达。DL-ETR1与DL-ERS1有着不同时期的表达模式,并且可能起到结合乙烯,调节龙眼体胚对乙烯敏感性的综合作用。     

龙眼生长素受体基因TIR1的克隆及表达分析

为进一步明确龙眼生长素受体基因TIR1的结构和功能,本试验采用RT-PCR和RACE-PCR对龙眼胚性愈伤组织2个TIR1基因(分别命名Dl TIR1-1和Dl TIR1-2)进行克隆,并进行生物信息学和表达分析。研究结果表明:Dl TIR1-1全长4 343 bp,包含ORF 1 755 bp,编码584个氨基酸(Gen Bank登录号:KR558759),而Dl TIR1-2全长2 821 bp,包含ORF 1 926 bp,编码641个氨基酸(Gen Bank登录号:KR558760)。生物信息学分析结果表明,Dl TIR1-1和Dl TIR1-2理化性质较为一致,均属于不稳定蛋白,不含信号肽,具有跨膜螺旋;亚细胞定位于细胞质中,分别含有31个和45个蛋白磷酸化位点;系统进化树分析显示,Dl TIR1-1与十字花科的亚麻荠和甜菜处于同一分支,而Dl TIR1-2与甜橙和胡杨等木本植物保持较近的遗传距离。q PCR结果表明,Dl TIR1-1和Dl TIR1-2在龙眼体胚发生过程中和不同组织器官中的表达模式较为一致,且在非胚性愈伤组织、根和花中表达量最高;此外,在一定的浓度范围内,IAA、ETH、ABA和GA3均能适当提高龙眼TIR1的表达量,而添加Me JA却明显抑制TIR1的转录。上述结果表明,Dl TIR1-1和Dl TIR1-2可能具有相似功能,且均参与龙眼非胚性愈伤组织形成、根系分化以及花器官发育,此外龙眼生长素信号转导途径可能受多种植物激素调控。     

龙眼胚性愈伤组织DlHOS1基因克隆与表达分析

以龙眼胚性愈伤组织为材料,采用RT-PCR和RACE-PCR技术对植物抗寒重要调控因子HOS1(DlHOS1)进行克隆,并进行密码子使用偏爱性、生物信息学和低温胁迫下表达等方面的分析。结果表明:DlHOS1基因序列全长3 577 bp,包含ORF 3 000 bp,编码999个氨基酸,5’UTR和3’UTR分别162 bp和415 bp(GenBank登录号:KY990404);密码子使用偏爱性分析表明,DlHOS1密码子的选择偏爱性较弱,偏爱以A/T结尾;生物信息学分析结果表明,DlHOS1编码的蛋白属于不稳定的疏水性跨膜蛋白,不含信号肽,定位于细胞质和细胞核,二级结构富含α螺旋,与柑橘的亲缘关系较近;qPCR结果发现,DlHOS1能够响应低温胁迫诱导,总体上低温下其表达水平上升。研究结果认为,DlHOS1参与龙眼抗寒和低温胁迫过程。      

荔枝古树胚性愈伤组织Fe-SOD成员基因克隆及生物信息学分析

为了解Fe-SOD在荔枝古树胚性愈伤组织保存中的分子机制,选择荔枝古树宋荔花药诱导而来的胚性愈伤组织为试验材料,采用同源克隆和RACE方法,获得荔枝Fe-SOD的两个转录本和基因组序列,并对该基因组的内含子进行分析。克隆获得长1 285 bp含有完整开放阅读框的荔枝Fe-SOD核酸序列,其编码1个含有250个氨基酸的蛋白质,将该序列命名为LcFe-SOD7a。生物信息学分析结果表明:该蛋白为稳定的、亲水的、含跨膜结构域的偏酸性蛋白质,定位于微体(过氧化物酶体)和细胞质,具有多样的磷酸化位点。LcFe-SOD7a基因组序列长2 284 bp,含7个内含子,其中第4个内含子较长,达920 bp。同时还得到其中的1条内含子驻留型可变剪接基因,该可变剪接基因提前终止,仅编码207个氨基酸的蛋白质,将该可变剪接基因命名为LcFe-SOD7b。     

真菌诱导子对龙眼胚性愈伤组织生长和多糖积累的影响

为探讨真菌诱导子对龙眼胚性愈伤组织生长及多糖含量的影响。以龙眼胚性愈伤组织为材料,采用单因素分析法探究了真菌诱导子种类、诱导时间和浓度对龙眼胚性愈伤组织生长和多糖积累的影响。结果表明,不同真菌诱导子处理下龙眼胚性愈伤组织中多糖含量由高到低排序分别为:龙眼拟茎点霉胶孢镰刀菌尖孢镰刀菌;采用100 mg/L浓度的龙眼拟茎点霉诱导子诱导15 d,龙眼胚性愈伤组织多糖含量最高,比对照提高了61.34%,且不同处理间存在显著差异。但真菌诱导子处理下龙眼胚性愈伤组织生长状态较差,且增殖率显著下降。龙眼拟茎点霉作为龙眼病原内生菌,其活性诱导物能促进龙眼胚性愈伤组织中多糖积累,从而一定程度上提高植物的免疫防御能力。研究结果为探究真菌诱导子对龙眼多糖合成和代谢机理的研究奠定基础。