抗猪流行性腹泻病毒变异株卵黄抗体的制备、纯化及其活性影响因素的研究

为制备抗猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）变异株卵黄抗体并探索卵黄抗体的纯化方法，本试验采用灭活的PEDV变异株CH/JX01全病毒免疫蛋鸡，收集免疫后所产的鸡蛋，分别用水稀释法、PEG-6000法和水稀释-硫酸铵二次沉淀法对鸡蛋中IgY进行提纯，然后运用间接ELISA和Western blotting方法鉴定和比较3种方法的提纯效果，获得可用于规模化生产的提纯方法；同时研究不同温度、pH条件下抗体活性，寻找对提纯IgY活性具有保护作用的物质。结果显示，本试验成功制备了抗PEDV变异株的卵黄抗体。浓度检测结果表明，水稀释法提取的IgY浓度最高，为6.204 mg/mL；PEG-6000方法提纯的IgY浓度次之，为4.673 mg/mL；水稀释-硫酸铵二次沉淀法IgY浓度最低，为3.359 mg/mL。间接ELISA检测结果表明，水稀释-硫酸铵二次沉淀法提纯的IgY效价最高，为1：12 800；其次是PEG-6000，为1：6 400；而水稀释法最低，为1：1 600。综合3种方法所提纯的卵黄抗体浓度与效价，发现水稀释-硫酸铵二次沉淀法的提纯效果优于其他两种方法。活性影响因素试验结果表明，提纯的IgY在37~60℃活性稳定；pH为4.0~11.0时具有良好的活性；在酸性条件下，20%硫糖铝对IgY活性具有较好的保护作用。本试验结果将为卵黄抗体的大规模生产运用与储存提供了有效的参考依据。     

抗猪流行性腹泻病毒变异株卵黄抗体的制备、纯化及其活性影响因素的研究

为制备抗猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)变异株卵黄抗体并探索卵黄抗体的纯化方法,本试验采用灭活的PEDV变异株CH/JX01全病毒免疫蛋鸡,收集免疫后所产的鸡蛋,分别用水稀释法、PEG-6000法和水稀释-硫酸铵二次沉淀法对鸡蛋中IgY进行提纯,然后运用间接ELISA和Western blotting方法鉴定和比较3种方法的提纯效果,获得可用于规模化生产的提纯方法;同时研究不同温度、pH条件下抗体活性,寻找对提纯IgY活性具有保护作用的物质。结果显示,本试验成功制备了抗PEDV变异株的卵黄抗体。浓度检测结果表明,水稀释法提取的IgY浓度最高,为6.204mg/mL;PEG-6000方法提纯的IgY浓度次之,为4.673mg/mL;水稀释-硫酸铵二次沉淀法IgY浓度最低,为3.359mg/mL。间接ELISA检测结果表明,水稀释-硫酸铵二次沉淀法提纯的IgY效价最高,为1∶12 800;其次是PEG-6000,为1∶6 400;而水稀释法最低,为1∶1 600。综合3种方法所提纯的卵黄抗体浓度与效价,发现水稀释-硫酸铵二次沉淀法的提纯效果优于其他两种方法。活性影响因素试验结果表明,提纯的IgY在37~60℃活性稳定;pH为4.0~11.0时具有良好的活性;在酸性条件下,20%硫糖铝对IgY活性具有较好的保护作用。本试验结果将为卵黄抗体的大规模生产运用与储存提供了有效的参考依据。     

抗猪繁殖与呼吸综合征病毒IgY的制备

利用猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）疫苗超量免疫母鸡,用水稀释法和硫酸铵沉淀法分离纯化IgY抗体,并用间接ELISA方法测抗体效价。结果表明：母鸡初次免疫后10d即有抗体产生,初次免疫75d后IgY效价可达1：10000,最高可达1：12800并能持续7-10d。IgY蛋白含量为10．64mg／mL蛋黄。IgY纯度达90％以上。     

采用改良的水稀释法提取卵黄抗体的试验

以鼠伤寒沙门氏菌免疫产蛋鸡后，收集卵黄液，用水稀释法提取卵黄抗体(IgY)。实验中所用的水稀释法，即将释释倍数和稀释时的pH值均重新调整，且采取关键性的滤纸过滤，再盐析和柱层析，最后得到IgY的纯度为90％以上，表明改良的水稀释法可以较好的提纯卵黄抗体，避免了常规方法中除脂不彻底的弊端。     

丹顶鹤血清IgY的纯化及其抗血清的制备

利用分离的丹顶鹤血清,应用饱和硫酸铵沉淀法对血清中的IgY进行初步提取,然后通过DEAE-52纤维柱进行纯化,SDS-PAGE测定IgY的纯度,最后以纯化后的丹顶鹤IgY为免疫原常规免疫法制备兔抗丹顶鹤IgY血清。结果表明:提纯后的IgY经电泳检测在分子质量63ku和27ku处出现2条特异性条带,经扫描软件分析其纯度大于90%;常规免疫法制备的兔抗丹顶鹤IgY血清经免疫双扩散法测定效价为1∶32。     

蛋鸡抗原对蛋黄免疫球蛋白含量的影响及提取方法的研究

本文研究蛋鸡注射抗原后蛋黄免疫球蛋白含量的变化及提取方法.并以此为基础,对免疫前后母鸡所产蛋中的IgY含量变化进行了分析,结果表明,在母鸡经免疫注射1个月后蛋黄中的IgY含量达到稳定,半年后IgY含量降低,并且缓慢降至免疫前的含量.本研究采用改进水稀释法提取蛋黄免疫球蛋白的工艺为:稀释倍数为7倍、pH调节至5.1.IgY含量可达10.02mg/ml,为以后IgY的提取和应用打下基础.     

抗CP型、NCP型牛病毒性腹泻病毒高免卵黄抗体的制备

本研究采用致细胞病变（cytopathic,CP）型牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）标准毒和非致细胞病变（noncytopathic,NCP）型新疆优势毒株免疫产蛋鸡,用改良PEG法提取卵黄抗体(IgY),并对提取的IgY采用SDS-PAGE检测纯度,间接ELISA检测免疫后每隔7 d的抗体效价,并测定所得抗体对NCP型BVDV的中和效价。结果表明,用该法提取的IgY纯度较高;间接ELISA结果证明,经过4次免疫后,抗CP型BVDV的效价达到1∶32000,抗NCP型BVDV的效价达到1∶40000,3个月后再次检测,卵黄抗体效价未见明显下降。最后一次免疫14 d的抗体对NCP型BVDV的中和效价达到1×10_^-3。     

抗犬细小病毒IgY的制备及其特性

用犬细小病毒(CPV)灭活抗原4次免疫SPF产蛋鸡,PEG沉淀法制备蛋黄抗体(IgY),IgY产量达到56mg/枚鸡蛋,纯度达到88%。Western blot分析表明,IgY抗体与CPV主要蛋白均发生反应。首次免疫后7周,IgY的ELISA抗体滴度达到1∶512 000,中和效价达到1∶6 400,稳定的抗体水平可持续到43周。本研究为IgY应用于犬细小病毒病的免疫治疗和诊断奠定了基础。     

抗CDV、CAV卵黄抗体的制备

本研究用CDV、CAV分别免疫产蛋鸡，收集鸡蛋，用海藻酸钠—硫酸铵法提取卵黄抗体(IgY)，并对提取的IgY采用了SDS-PAGE和低压层析检测纯度，结果表明用该法提取的IgY纯度较高。用间接BUSA测定提取的IgY活性，结果证明提取的抗CAV IgY的活性较高，而抗CDV IgY的活性损失较大。     

抗新型鸭细小病毒卵黄抗体的制备、纯化及效价测定

为了制备抗新型鸭细小病毒卵黄抗体并改良其制备工艺,试验采用新型鸭细小病毒SD株尿囊液制备的油乳剂灭活苗免疫产蛋鸡,收取高免蛋分别用氯仿法、辛酸法和水稀释-硫酸铵二次沉淀法对其中的卵黄抗体进行提纯,比较提纯效果,然后采用SDS-PAGE和Western-blot法对制备效果进行评价,采用鸭细小病毒抗体酶联免疫检测试剂盒进行效价测定,分析卵黄抗体的消长规律。结果表明:氯仿法提取的卵黄抗体浓度为4.512 mg/mL,透明,呈浅黄色;辛酸法提取的卵黄抗体液浓度为3.422 mg/mL,半透明,呈浅白色;水稀释-硫酸铵二次沉淀法提取的卵黄抗体浓度为3.837 mg/mL,透明,澄清。SDS-PAGE结果显示卵黄抗体有两条特异性条带,一条重链(约为65 ku)和一条轻链(约为33 ku)。制备的卵黄抗体具有特异性。试剂盒测定卵黄抗体效价,氯仿法为1∶6 000;辛酸法为1∶8 000;水稀释-硫酸铵二次沉淀法最高,为1∶10 000,其中水稀释-硫酸铵二次沉淀法效果较优。说明本试验成功制备了新型鸭细小病毒的卵黄抗体。     

不同方法提取卵黄抗体效果的比较

为了优化卵黄抗体提取工艺以及产业化生产提供技术参考,从众多方法中初步筛选了较为适宜的水稀释法、辛酸法、乙酸-乙酸钠法、酚沉淀法和海藻酸钠法,并比较了5种方法的提取工艺、生产成本、卵黄抗体提取量及其效价。试验结果表明,辛酸法的提取液体回收率最高,达到171％;辛酸法提取蛋白的浓度最高,为6．6mg／mL;辛酸法和海藻酸钠法提取卵黄抗体的凝集价最高,为1：128。综合各种因素考虑,辛酸法是提取卵黄抗体较为理想的方法。     

利用水稀释反复冻溶法、氯仿萃取法与冷乙醇沉淀法相结合进行鸡新城疫卵黄抗体提取的试验研究

本研究采用免疫学技术和物理化学方法,通过优化提取条件,改良提取工艺,建立了一种用水稀释反复冻溶法、氯仿萃取法与冷乙醇沉淀法相互结合提取鸡卵黄抗体的方法。结果显示：用5倍体积、pH5．0的稀释液稀释蛋黄,在-20℃经三次反复冻融、上清液再用同等剂量的氯仿萃取、40％的冷乙醇沉淀,提取的鸡新城疫卵黄抗体具有液体清亮,杂质含量少,抗体效价高的特点。     

不同除脂条件对卵黄液除脂率及卵黄抗体纯度的影响

为研究提高卵黄液除脂率和卵黄抗体的纯度,建立适合大量生产卵黄抗体的工艺,比较了不同除脂条件对卵黄液除脂率及卵黄抗体纯度的影响。最终确定卵黄液与醋酸盐体积比为1：8、pH值调至5．2、2～8℃沉淀15h（过夜）时,除脂的效果最理想,且蛋白的纯度高,适合大量提取卵黄抗体。     

HPLC法检测家兔血浆中地克珠利含量

建立了快速、稳定的家兔血浆中地克珠利提取方法,为进一步研究家兔组织中地克珠利的残留量提供基础。采用HPLC法以妥曲珠利为内标,N,N-2甲基甲酰胺及乙腈联合沉淀法提取家兔血浆中地克珠利,色谱柱为Hypersil ODS（2.5μm,250 mm×4.6 mm）,流动相为乙腈∶水∶三乙胺∶冰乙酸=55∶45∶0.2∶0....     

鸡传染性法氏囊高免卵黄IgY抗体不同提取方法的比较

本试验旨在提高鸡传染性法氏囊卵黄抗体防制鸡传染性法氏囊的效果,比较不同提纯方法对鸡传染性法氏囊高免卵黄抗体效价的影响。制备高免蛋并测定其效价,在实验室通过直接离心法、酸化水提取法、氯仿提取法、聚乙二醇法4种方法分别对高免卵黄抗体提取及抗体效价检测。试验结果表明,自制卵黄抗体效价为1:64;直接离心法的抗体效价为1:128,酸化水提取法的抗体效价为1:16,氯仿提取法抗体效价为1:256,聚乙二醇法的抗体效价是1:32。试验结果显示,使用氯仿提取法后检测的抗体效价最高,是临床提取抗体的常用方法。     

抗牛多杀性巴氏杆菌高免卵黄抗体IgY的制备及间接血凝检测方法的建立

本研究通过自制牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌灭活菌苗免疫产蛋鸡,采用卡拉胶结合硫酸铵沉淀法提取卵黄抗体IgY,并采用间接血凝方法检测抗体效价。结果表明,抗原致敏红细胞的最佳浓度是800μg/mL,免疫后第7周抗体效价达到高峰,效价为1：1024,高效价持续5周开始下降,测定提取的IgY浓度为8.258mg/mL,无菌检测及动物安全性实验表明制备的卵黄抗体安全可靠。本研究制备了抗牛多杀性巴氏杆菌卵黄抗体,为防治由荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌所致的犊牛肺炎提供了新的手段。     

模拟降水和不同载畜率对荒漠草原生态系统碳交换的影响

[目的] 探究不同降水梯度和不同载畜率对生态系统碳交换的影响。[方法] 试验依托内蒙古乌兰察布市四子王旗短花针茅荒漠草原不同载畜率（对照、低载畜率、中载畜率、高载畜率）平台,增设模拟降水试验（减水50%、自然降水、增水50%、增水100%）。在2017年植物生长季,采用Li-6400便携式光合仪和密闭式箱法测定生态系统净碳交换（net ecosystem carbon exchange,NEE）、生态系统呼吸（ecosystem respiration,ER）和生态系统总初级生产力（gross ecosystem productivity,GEP）对不同降水梯度和不同载畜率的响应。[结果] ①降水单因素处理对NEE、ER、GEP均产生极显著（P<0.001）影响。②高载畜率处理的ER显著（P<0.05）低于对照处理。③降水与载畜率的交互作用只对GEP产生显著（P<0.05）影响。相同载畜率处理下,降水量的增加对NEE、ER、GEP均有促进作用;相同降水处理下,对照区的ER、GEP显著（P<0.05）高于高载畜率区。ER、GEP在低载畜率条件下与土壤体积含水量的线性回归模型斜率的绝对值最大。[结论] 随着土壤含水量的增加,NEE、ER、GEP呈显著增加的趋势;随着载畜率的增加,ER显著降低,降水与载畜率的交互作用只对GEP产生显著影响,尽管水分的增加促进生态系统碳交换,但中、高载畜率条件下荒漠草原生态系统碳交换对土壤水分变化的敏感性减少。     

当归总黄酮提取工艺及体外抗氧化性研究

目的：探讨当归中总黄酮的提取工艺及抗氧化性。方法：在单因素实验的基础上,采用L9（34）正交试验,通过亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法测定当归总黄酮的含量,并对提取液采用Feton体系、邻苯三酚自氧化体系、普鲁士兰法进行体外抗氧化活性研究。结果：当归中总黄酮的最佳提取工艺：提取温度为80℃,乙醇浓度为75%,提取时间为3.5 h,料液比为1∶30。在最佳提取工艺条件下,当归中总黄酮提取量为9.4642 mg/g。所得提取液总黄酮浓度为0.068 mg/mL时,对羟基自由基清除率可达到74.02%;浓度为0.034 mg/mL时,对超氧阴离子抑制率可达51.79%。结论：采用该方法提取当归总黄酮,回收率高,精密度好,加标回收率99.51%,相对标准偏差RSD 4.04%（n=5）。所得提取液对羟基自由基、超氧阴离子均有较强的清除效果,且清除效果与提取液总黄酮浓度呈明显量效关系。     

鸡新城疫卵黄抗体IgY的分离提纯研究

本文对母鸡经鸡新城疫疫苗免疫接种后产生并富集在卵黄中的抗体IgY的提取纯化工艺条件进行了研究与优化，确定了去脂、提取抗体最佳工艺为：卵黄液用0．05mol／L,pH5.0的乙酸一乙酸钠缓冲液1：9倍稀释，搅拌15min，4℃静置10小时，抗体回收率为90％，去脂率为99％；该提取液用40％饱和度的硫酸铵盐析，得到的盐析液抗体回收率为82％，纯度达到69％。盐析液经截留分子量为100KD的有机陶瓷膜超滤后，截留液抗体回收率达到92％。纯度为85％。