应用电激法将外源基因导入小麦的研究

建立了以小麦成熟胚为植体的组织培养系统。应用电激仪ＨＰＥＳ－３，摸索了适合小麦种胚外源基因转化的电激条件，并以含有潮霉素磷酸转移酶基因的质粒ｐＬＣＮ１０５５ＤＮＡ直接对萌动的小麦种胚进行电激转化，在含有潮霉素的小麦愈伤组织培养基中培养，获得了假定的转基因愈伤组织。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交初步证明ＨＰＴ基因已整合至小麦愈伤组织的基因组中，将这些转基因愈伤组织培养成苗还在试验之中。     

转基因抗穗发芽小麦的获得

以易穗发芽小麦幼胚为受体,用基因枪法对TrxS反义基因(目的基因)和Bar基因(标记基因)进行了共转化;通过对轰击后的小麦幼胚进行愈伤组织诱导、胚性愈伤组织分化和生根培养,获得再生植株;经分子检测证实在3个受体材料上获得转基因再生植株和可遗传的转基因后代.通过培养皿籽粒发芽试验、离体整穗保湿发芽试验和温室模拟降雨穗发芽试验,均证明转基因后代材料具有延缓籽粒发芽和抗穗发芽的特性.     

小麦幼胚愈伤组织的诱导

为建立小麦(Triticum aestivum Linn.)幼胚的转化体系,获得转基因的小麦再生植株,对小麦幼胚进行愈伤组织诱导。以新春6号和新春9号小麦幼胚为试验材料,选择不同诱导培养基对幼胚进行愈伤组织诱导。结果表明,4种培养基诱导的愈伤组织质量和诱导率有明显的差异,其中MCIMA+KT高于其他3种培养基,新春6号和新春9号诱导率分别为53.80%和52.25%,愈伤组织的质量级别为A级,属于极适宜进行遗传转化状态。SD2培养基上诱导出的2个小麦品种愈伤组织分别为0.002%和0.59%,是不适宜进行遗传转化的培养基。新春6号和新春9号2个基因型诱导的愈伤组织数量和质量之间没有明显差异,适于进行遗传转化。     

基因枪法介导的转KN2基因小麦的获得及鉴定

【目的】获得转KN2基因的小麦植株,为研究KN2基因对提高转基因小麦抗寒性的作用,以及为利用基因工程提高小麦抗逆性奠定基础。【方法】以弱冬性小麦品种小偃22为供试材料,通过基因枪法,用含有KN2基因的植物表达载体和筛选标记基因bar共转化小麦幼胚愈伤组织,经过除草剂(Phosphinothricin,草丁膦)筛选和愈伤组织分化获得再生植株,并对得到的再生小麦植株进行PCR检测。【结果】采用基因枪法共轰击小偃22的幼胚愈伤组织1 680个,共获得再生植株17株,移栽到花盆中成活15株;根据目标基因序列设计特异引物,对成活的小麦植株进行PCR检测,结果表明获得含有bar基因和KN2基因的转基因阳性植株分别为6株和4株,转化率分别为0.36%和0.24%,bar和KN2的共转化率为0.24%。【结论】KN2基因成功地转入到小麦品种小偃22中。     

农杆菌介导的小麦转化体系的优化

为建立农杆菌介导的高效小麦遗传转化体系,分析比较了不同小麦栽培品种、不同培养处理条件下的愈伤诱导、分化及转化效率。结果表明:2个长江中下游主推小麦品种扬麦158和华麦13的幼胚愈伤诱导没有差异,但扬麦158形成的胚性愈伤多、分化率及转化率高于华麦13,是优良的农杆菌介导的遗传转化受体基因型。预培养20d的愈伤转化率最高,高渗处理可进一步提高转化率。获得的T0、T1代转基因植株,经PCR分析鉴定,表明外源基因已经整合到小麦基因组中。     

高亲和铵转运因子在春小麦中的遗传转化研究

为了培育可高效吸收利用铵态氮的小麦品种,将高亲和铵转运因子AtPRP3-AtAMT1;1融合基因导入优质强筋小麦品种龙辐18中,利用基因枪法对3 760个小麦幼胚愈伤组织进行了轰击。结果表明:经过筛选分化共获得69株抗性苗。用2对特异引物对转基因植株进行检测,成功获得4个转基因植株,转化率为0.11%,可作为选育高亲和铵转运因子小麦的原始材料。     

农杆菌介导转基因小麦植株的获得和检测

利用建立的遗传转化体系,以携带Npt II筛选标记基因和胰蛋白酶抑制剂基因的LBA4404/pRok2(农杆菌/质粒)对山农995604小麦愈伤组织进行遗传转化,获得了三株含有胰蛋白酶抑制剂基因的转基因小麦。通过PCR扩增和Southern杂交检测,证明了外源基因已整合到了三株转基因小麦基因组中。     

小麦遗传率中潮霉素适宜筛选浓度的研究

研究了潮霉素不同质量浓度对西农 1376和京花 1号小麦愈伤组织及种子的筛选效果。结果表明 ,潮霉素对小麦愈伤组织的适宜筛选质量浓度为 110 mg/L,对转基因小麦后代种子筛选以 14 0 mg/L 较为适宜 ;不同基因型材料对潮霉素的敏感性存在一定差异     

菜豆几丁质酶基因转化小麦的研究

利用农杆菌二元载体转化法和花粉管通道法 ,以菜豆几丁质酶基因转化小麦东农 774 2。农杆菌感染后的愈伤组织以 G4 183 0 mg· L-1筛选 5周 ,经 PCR和 PCR- Southern杂交检测 ,有0 .3 8%的愈伤获得转化。花粉管通道法转化小麦共操作小花 3 85朵 ,其中有 68.3 0 %的小花结实 ,经 PCR和 PCR- Southern杂交检测 ,获得转基因植株的转化频率为 0 .52 %。     

基因枪介导的转PYL5基因小麦的获得与鉴定

【目的】通过基因枪介导共转化,获得转拟南芥抗旱基因PYL5的小麦植株,为转基因小麦的抗旱功能研究奠定基础。【方法】以小麦品种西农889、绵阳19和宁春16为供试材料,通过基因枪介导法将诱导型启动子Rd29A启动的PYL5基因和筛选标记基因Bar共转化到小麦幼胚愈伤组织中,经过除草剂PPT(Phosphinothricin)筛选和愈伤组织分化,获得再生植株。根据目标基因PYL5和Bar基因序列分别设计特异引物,对移栽成活的小麦T0代再生植株进行基因特异性PCR检测。【结果】采用基因枪分别轰击西农889的1800个、绵阳19的800个和宁春16的800个幼胚愈伤组织,经过筛选和分化分别获得了9,5和14株小麦再生植株;对转基因小麦T0代再生植株的基因特异性PCR检测结果表明,西农889、绵阳19和宁春16 Bar基因的转化率分别为0.280%,0.500%和0.750%,PYL5基因的转化率分别为0.110%,0.125%和0.500%,Bar和PYL5基因的共转化率分别为0.110%,0.125%和0.500%。【结论】PYL5基因成功转入到了小麦品种西农889、绵阳19和宁春16中。     

小麦幼胚愈伤组织的遗传转化

将从水稻中提取的抗性调节转录因子OsDREB2.2基因,通过农杆菌介导进入小麦组织细胞内的方法,培育筛选稳定遗传的植株,使小麦中的一系列抗性基因得以表达,从而培育出抗逆性强的小麦新品种。采用河北农业大学自主培育的小麦新品种河农825、河农827、河农831等为试验材料,以各自幼胚为外植体,诱导的愈伤侵染农杆菌后,获得的抗性愈伤组织数平均为170.44、分化愈伤数平均为24.56、抗性芽与转化幼胚总数的比例平均为0.96%。表明本研究中采用的愈伤组织诱导、农杆菌侵染和植株再生条件是适宜的。     

小麦胚愈伤组织的诱导和植株再生

对3个小麦品种的成熟胚及幼胚进行培养，研究不同基因型、培养基对愈伤组织诱导及分化的影响。结果表明，不同培养基对小麦愈伤组织诱导有一定影响；不同基因型的小麦愈伤组织诱导、分化及生根的能力有一定差别。陕280愈伤组织诱导率及分化率最高。同一品种不同外植体经诱导后愈伤组织产生的能力有所不同，同一品种愈伤组织的诱导率幼胚比成熟胚愈伤组织的高。     

不同预处理对小麦成熟胚愈伤组织形成的影响

研究了低温、CaCl2 、PEG 3种预处理对 18个小麦品种成熟胚愈伤组织形成的影响 ,结果表明 :不同预处理对小麦成熟胚愈伤组织的形成有显著影响。PEG处理对小麦成熟胚愈伤组织的形成具有显著促进作用 ;低温和CaCl2 溶液处理对小麦成熟胚愈伤组织的影响和小麦品种关系密切 ,品种间差别较大。     

小麦幼穗愈伤组织诱导与植株再生的研究

以 3个小麦品种的幼穗为外植体 ,选用 9种培养基 ,研究了影响小麦幼穗愈伤组织诱导和分化的因素。结果表明 :小麦幼穗愈伤组织诱导和再分化都存在基因型效应 ;外源激素的种类和浓度也是影响小麦幼穗愈伤组织诱导和再分化的重要因素。在愈伤组织诱导中 ,较低的2 ,4-D浓度 ( 0 .5～ 1 .0mg/L)也能达到较好的诱导效果 ,但 2 ,4-D最适宜的使用浓度为2 .0mg/L ,细胞分裂素KT或 6-BA不利于愈伤组织的诱导。     

小麦幼胚胚性愈伤组织诱导和再分化研究

以4个小麦品种的幼胚为外植体,通过脱分化和再分化培养,研究了影响小麦幼胚愈伤组织诱导和再分化的因素。结果表明:小麦幼胚胚性愈伤组织的诱导和再分化主要受基因型的限制,同时也受培养基组成的影响;培养基中添加0.5mg/L的ABA不利于胚性愈伤组织的诱导和分化;胚性愈伤组织诱导率和幼苗分化率之间呈极显著正相关,提高胚性愈伤组织的诱导率和形成量是建立小麦植株再生体系的关键。     

小麦幼胚愈伤组织诱导影响因素的研究

小麦幼胚愈伤组织是目前小麦遗传转化中最常用的转化受体系统。以小麦幼胚为外植体,对愈伤组织诱导中的不同基因型、基本培养基、激素、碳源进行了研究。结果表明,不同基因型材料、不同基本培养基的幼胚愈伤组织诱导存在明显差异,其中西农1376和小偃22两个基因型小麦的组培特性较好,MS培养基适于作为小麦幼胚愈伤组织诱导的基本培养基。在MSD培养基中加入1.0mg/LABA或0.2mg/L6-BA能明显改善愈伤组织的生长状态,并以ABA的效果更为显著。将MSD培养基中的蔗糖浓度从30g/L降为15g/L,同时加入15g/L山梨醇,可显著提高愈伤组织的质量。选择适宜的基因型和合理的培养基构成是改良小麦幼胚愈伤组织诱导效果的关键。     

普通小麦基因转化中良好受体系统的建立

对影响小麦幼胚愈伤组织高频率再分化的条件进行了研究。结果表明,暗培养条件下诱导的小麦幼胚愈伤组织的再分化频率显著高于散光和2000lx光照条件;大田生长的小麦比温室盆栽小麦的幼胚脱分化和再分化频率高。小麦主茎穗部的幼胚组织脱分化和再分化特性显著高于小麦分蘖茎穗部的幼胚组织。不同年份、不同基因型小麦品种,及不同胚龄幼胚组织的脱分化和再分化特性有一定差异。通过诸多因素的优化和最适幼胚组织的选择,可建立小麦基因转化中不依赖于基因型的良好受体系统。     

小麦成熟胚愈伤组织诱导条件优化的研究

[目的]筛选小麦成熟胚愈伤组织诱导的最适培养条件。[方法]采用正交设计试验,以2个小麦品种扬辐2号和皖麦41的成熟胚为外植体,研究不同基本培养基和激素配比对愈伤组织诱导的影响。[结果]在MS、1/2 MS、N63种基本培养基中,1/2 MS对小麦成熟胚愈伤组织诱导效果最好。IAA对扬辐2号成熟胚愈伤组织诱导有一定的影响,KT对皖麦41成熟胚愈伤组织诱导作用显著。1/2 MS+2,4-D4.0 mg/L,愈伤组织质量最好。不同小麦品种成熟胚离体培养力存在着差异,皖麦41优于扬辐2号。[结论]该研究为小麦成熟胚离体培养提供了参考。     

农杆菌介导小麦花药遗传转化影响因素的研究

采用农杆菌介导法对小麦花药愈伤组织进行转化,并探讨了影响其转化的因素。结果表明：不同基因型的花药培养力存在显著差异,抗性愈伤组织诱导率、抗性芽分化率、抗性植株获得率在不同的基因型之间也存在着很大差异;除小麦品种石4185外,冀5265也是小麦花药农杆菌转化的良好受体基因型;侵染后的愈伤组织在无茵滤纸上共培养2d,效果最好。     

不同培养基及激素配比对小麦成熟胚离体培养的影响

[目的]建立适于优良小麦品种遗传转化的高效组织培养再生体系。[方法]以小麦品种豫麦18和豫麦70成熟胚为外植体,探讨了2种培养基和4种激素配比对小麦成熟胚离体培养的影响。[结果]L3培养基的平均愈伤组织诱导率和分化率都明显高于MS培养基,供试2个品种平均出愈率达91.0%以上,平均分化率达46.4%。不同激素及其配比均可诱导小麦成熟胚愈伤组织分化,但不同处理分化率差别很大(10.5%~50.0%);以L3为分化培养基,同时添加2,4-D 0.1mg/L,6-BA 1.5 mg/L的激素配比更有利于愈伤组织的分化,平均分化率达到50.0%。[结论]MS、L3两种基本培养基对小麦成熟胚愈伤组织诱导率均比较高,且差别不大。不同激素配比对小麦成熟胚愈伤组织分化率影响很大。