杜仲EuGT2基因的原核表达及蛋白纯化

本研究以克隆所得杜仲(Eucommia ulmoides)EuGT2基因为基础,利用基因重组技术构建原核表达载体pMCSG19-EuGT2。重组载体转化到E.coli Rosetta(DE3)中,用0.05 mmol/L异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃下诱导6 h。使用镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)亲和层析柱进行纯化,并用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳进行检测。研究结果表明,杜仲EuGT2基因在E.coli Rosetta(DE3)中得到成功表达,重组蛋白表达形式为部分包涵体、部分可溶性蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳检测,在相对分子质量约56 kD处有1条特异性蛋白条带,经质谱鉴定该特异性蛋白条带确为杜仲EuGT2蛋白。以上研究结果为后续研究杜仲糖基转移酶的功能提供了科学依据。     

甘蔗细胞壁蔗糖转化酶基因SoCIN2的克隆和表达分析

细胞壁蔗糖转化酶(CIN)主要参与韧皮部质外体的蔗糖卸载,在调控果实发育中起作用。为探究CIN在调控甘蔗糖分积累过程中的作用,本试验从低糖甘蔗品种B8中克隆到一个1个CIN基因,命名为SoCIN2基因。结果显示,SoCIN2基因全长为2 269 bp,其中开放阅读框为1 857 bp,编码618个氨基酸。So CIN2蛋白分子量为67.59 kD,理论等电点为5.25;定位于细胞壁上,不含信号肽序列;具有保守的NDPNG、FRDP和MWECP结构域,属于糖基转移酶GH32家族。系统进化分析表明,甘蔗SoCIN2蛋白与高粱SbCIN2遗传距离最近。荧光定量PCR结果表明,在甘蔗根、茎、叶和芽中SoCIN2基因均表达,其中在叶中基因表达量最高,茎中最低。甘蔗+1叶中SoCIN2基因表达量显著高于茎中。在伸长期和成熟期,茎中SoCIN2基因的表达模式相同,成熟茎中基因表达量显著高于未成熟茎中基因表达量,表明SoCIN2基因可能在调控甘蔗成熟茎中蔗糖积累中起作用。     

普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关基因PvCaM1的克隆及表达分析

钙调素蛋白(calmodulin,CaM)作为植物细胞内介导多种功能的Ca²⁺结合蛋白,在调节植物的生长发育和抗病性方面具有重要作用。利用普通菜豆(Phaseolus vulgaris L.)表达序列标签(EST)克隆了含有编码普通菜豆CaM基因的cDNA序列。序列分析表明,cDNA片段长713 bp,命名为PvCaM1,具有一个453 bp的开放阅读框(ORF),GenBank登录号为JN418801,该基因编码150个氨基酸,预测蛋白质分子质量为17.16 kD。蛋白质结构分析表明,PvCaM1蛋白含有4个Ca²⁺结合结构域(EF-hand)。同源分析结果显示,PvCaM1基因与百脉根、西瓜的CaM基因亲缘关系最近,分别达到77%和76%。荧光定量PCR分析表明,PvCaM1基因受尖孢镰孢菌菜豆专化型FOP-DM01菌株诱导表达,接种病原菌96 h,抗病品种260205根中PvCaM1基因的表达量达到最高,而感病品种BRB-130达到最低,260205叶中PvCaM1基因的表达量均高于BRB-130,而且叶中的表达量高于根和茎中的表达量。PvCaM1基因表达量也受外源植物激素脱落酸、茉莉酸甲酯和乙烯利诱导上调,在根、茎、叶中均有不同程度的表达。本研究表明PvCaM1基因可能通过脱落酸、茉莉酸和乙烯等信号途径参与菜豆对FOP-DM01菌株的防御反应,推测菜豆PvCaM1基因与镰孢菌枯萎病的抗病性有一定关联。     

日本蛇根草Oj5GT1的克隆与表达分析

类黄酮5-O-糖基转移酶在增加类黄酮水溶性与稳定性方面发挥重要作用。本研究基于转录组测序结果,利用RT-PCR方法从日本蛇根草中克隆获得Oj5GT1基因,对其序列进行生物信息学分析,并通过Real-time PCR分析Oj5GT1在根、茎、叶、花瓣、花葶、萼片及花朵4个不同发育时期的表达情况。结果显示,Oj5GT1开放阅读框长1 416 bp,编码471个氨基酸;蛋白理论等电点为5.14,为亲水性蛋白,不含信号肽,具有2个糖基化位点;系统进化分析表明,Oj5GT1与类黄酮5-O糖基转移酶归为一类。表达分析显示,Oj5GT1在日本蛇根草花葶和花瓣的表达量显著高于根和叶,且伴随花朵发育过程表达量呈先降低后升高趋势。本研究为解析Oj5GT1基因的生物学功能及其调控日本蛇根草花色素苷的生物合成研究提供了坚实的理论支撑。     

杜鹃红山茶CaCPI基因的克隆及过量表达提高烟草植株的抗虫性

绝大多数观赏山茶花属于设施栽培植物,因环境湿热易造成病虫害出现,导致观赏价值降低,影响种植效益。为了提高抗虫性,根据山茶同源序列设计特异性引物,利用同源克隆和3',5'-RACE技术,从杜鹃红山茶嫩叶组织中克隆出半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cysteine proteinase inhibitor,CPI)基因,命名为Ca CPI,基因全长579 bp,开放阅读框306 bp,编码101个氨基酸,分子量为11.078 k Da,等电点p I=6.72。利用实时荧光定量PCR方法对杜鹃红山茶根、茎、叶中该基因的表达特性进行分析,结果表明,Ca CPI基因在叶中的表达量较高,其次为茎,在根中表达量较低,比较显示叶的表达量分别约为茎的1.53倍,根的1.61倍。转基因烟草分析表明,过量表达Ca CPI基因后,转基因烟草中目的基因表达量提高了55.84~174.83倍,并且转基因植株抗蚜虫能力获得提高,接虫5 d后植株上的蚜虫绝大多数死亡,累积死亡率约为90.75%,高达野生型的5.14倍。     

金银花糖基转移酶基因LjUGT71E1的克隆及原核表达

糖基化广泛存在于生物体中,具有非常重要的作用,而糖基转移酶则是催化糖基化反应的关键酶。本研究根据转录组数据库,设计引物从金银花(Lonicera japonica Thunb.)中克隆得到一个糖基转移酶编码基因LjUGT71E1,序列分析表明该基因的CDS为1 503 bp,理论可编码氨基酸数目为501,等电点(p I)预测为5.09,理论分子量为55 579.71 Da。多重序列比对表明LjUGT71E1与其它植物UGT71家族成员在序列上保守性很高,并且其C端具有催化植物次生代谢产物糖基化的糖基转移酶所具有的保守的PSPG-box基序。系统发生分析表明LjUGT71E1与人参(Panax ginseng)和甜叶菊(Stevia rebaudiana)的UGT71E亚家族成员聚为一支。荧光定量PCR分析表明,该基因在金银花的五个花期均有表达,在幼蕾时期相对表达量达到峰值。进一步构建了LjUGT71E1基因的原核表达载体并且在大肠杆菌中诱导表达得到重组蛋白,为后续的功能研究提供了基础。     

毛竹中黄酮-C-糖基转移酶基因的克隆和生物信息学分析

糖基转移酶是催化黄酮糖苷形成的关键酶。黄酮糖苷类化合物具有抗氧化、清除自由基、调节血脂和血糖等生理作用。基于毛竹基因库测序的完成,本研究通过RT-PCR技术首次获得一条完整的毛竹黄酮-C-糖基转移酶基因开放阅读框,将其命名为PeCGT,其基因的序列长度是1342 bp。对其编码蛋白的理化性质、保守结构域以及二级结构和空间结构等进行了生物信息学分析。结果表明:PeCGT基因编码的蛋白含有447个氨基酸,分子量是47.76 kD,理论等电点为4.91,酸性氨基酸(Asp+Glu)个数为54,碱性氨基酸(Arg+Lys)个数为35。PeCGT蛋白是疏水型蛋白,不存在信号肽,存在于线粒体中。结构域预测分析结果表明,PeCGT编码的氨基酸序列具有明显的糖基转移酶特征的保守域结构PSPG。通过同源性分析,其与乌拉图小麦(Triticum urartu)、节节麦(Aegilops tauschii subsp.Tauschii)和二穗短柄草(Brachypodium distachyonhiihii)具有较高的同源性。实时荧光定量PCR结果表明:PeCGT基因在叶中的表达量最高,在根中几乎不表达,在茎中有部分表达。此研究结果为以后毛竹黄酮-C-糖基转移酶的表达和功能鉴定提供了一定的帮助。     

绞股蓝皂苷生物合成后修饰酶基因的cDNA克隆和组织表达特征

从绞股蓝转录组挖掘可能与绞股蓝皂苷生物合成相关修饰酶基因细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)及UDP-糖基转移酶(UDP-dependent glycosyltransferase,UGT)基因的cDNA进行克隆并开展了以下研究。根据课题组前期绞股蓝转录组数据,筛选CYP及UGT Unigenes,利用RT-PCR克隆ORF全长,并结合生物信息学对其编码蛋白进行功能分析,最后通过荧光定量PCR验证其在根、茎、叶的差异性表达。结果克隆得到两个ORF序列,分别命名为CYP94A1和UGT91A1;CYP94A1序列包含1509 bp的开放阅读框架,编码一条含503个氨基酸残基的肽链,具有CYP保守结构域;UGT91A1序列包含1383 bp的开放阅读框架,编码一条含461个氨基酸残基的肽链,具有UGT保守结构域。这两个基因的转录表达均具有组织特异性,在叶或茎中的表达均高于根。CYP94A1和UGT91A1的克隆、转录表达及生物信息学分析为进一步挖掘绞股蓝中CYPs、UGTs及功能验证提供了帮助,增加对CYP和UGT两个超基因家族的认识。     

蓖麻类钙调蛋白基因RcCML42克隆与表达载体构建

为了探究类钙调蛋白基因家族成员在蓖麻体内的作用及表达模式，在蓖麻体内挖掘家族基因CML42,并对其进行克隆与表达分析。以哲蓖三号植株为试验材料，克隆获得RcCML42完整编码区序列(CDS),利用生物信息学方法对RcCML42基因序列进行分析，包括编码氨基酸、蛋白分子量及等电点、跨膜结构域、氨基酸序列一致性等内容。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术，检测RcCML42基因在蓖麻植株根、茎、叶位置不同时间点的特异性表达情况。结果显示，RcCML42 CDS长度为597 bp,编码198个氨基酸，含有3个EF-hand钙结合结构域。蛋白分子量为22.27 ku,等电点为4.55,不存在跨膜结构域。氨基酸序列一致性分析表明，RcCML42与巴西橡胶树一致性最高，达86.84%。qRT-PCR结果显示，RcCML42基因在蓖麻根、茎、叶组织中均有表达，在经NaCl处理后，RcCML42在根中的表达量呈现先下降后上升的趋势。RcCML42在茎中12 h高度表达，在叶中为8 h高度表达。且在茎中的表达量显著高于其在根、叶中的表达。CML是植物体内最重要的一类钙感受器，通过与钙调素结合蛋白结合...     

马铃薯StGS基因克隆及镉胁迫下的表达分析

谷胱甘肽(glutathione, GSH)是植物体内重要的抗氧化剂,能有效清除活性氧自由基对细胞造成的损伤。为研究镉胁迫对马铃薯(Solanum tuberosum)谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase, GS)编码基因表达的影响,本研究以马铃薯‘威芋7号’为试验材料,采用同源克隆的方法从cDNA中克隆到StGS基因。序列分析表明,该基因ORF全长为1 644 bp,可编码344个氨基酸;在所选的物种中,蛋白序列同源性分析显示,马铃薯GS蛋白与潘那利番茄(Solanum pennellii)的亲缘关系最近,相似度为93.98%,与枸杞(Lycium barbarum)亲缘关系最远。另外,实时荧光定量PCR分析表明,镉胁迫24 h与4 h相比,马铃薯根和叶中GS相对表达量均达到极显著水平,分别为胁迫4 h的15倍和13倍;而在茎中GS相对表达量呈现出下降趋势。镉胁迫4 h时GS相对表达量为24 h的6倍,暗示StGS不仅是一个镉应答的基因,而且马铃薯植株不同器官应在应答镉胁迫时GS的表达存在一定差异。本研究结果为进一步探究StGS基因介导的镉胁迫响应机制提供前期基础。     

玉米分子伴侣基因ZmBiP2在逆境下的功能分析

BiP(binding protein)基因编码的蛋白是一类重要的分子伴侣,在动植物的逆境胁迫响应过程中具有重要的作用。从玉米抗旱自交系旱21中分离到分子伴侣基因ZmBiP2,序列分析结果显示,该基因开放阅读框长1989 bp,编码含663个氨基酸的蛋白,包含热激蛋白家族特有的TVIGIDLGTTYSC保守结构域和ATP结合位点。实时荧光定量PCR结果显示,Zm Bi P2基因在玉米的雄穗和子房中表达量最高;在盐、甘露醇胁迫条件下,该基因在植株的地上部分上调表达。过量表达Zm Bi P2基因的拟南芥转基因株系在种子萌发时期对盐和甘露醇胁迫的耐受能力减弱,在苗期对盐胁迫敏感。推测在植物响应非生物胁迫的过程中,过量表达的ZmBiP2蛋白可能发挥负调节蛋白的功能。     

玉米光周期敏感类Hd6基因的克隆和实时定量表达分析

水稻Hd6基因在调节水稻光周期敏感中起重要作用。本研究以热带玉米自交系CML288为材料, 利用同源基因克隆法结合3¢RACE技术克隆了与水稻Hd6基因同源的玉米类Hd6基因。该基因序列中999 bp的开放阅读框可编码332个氨基酸。BLAST分析发现, 该基因与玉米中编码蛋白激酶CK2的一个基因高度同源, 所推测的氨基酸序列包含2个CK2活性区域, 1个N末端区域, 1个ATP结合位点和1个丝氨酸/ 苏氨酸蛋白质激酶活性位点,与玉米、小麦、水稻和拟南芥的CK2氨基酸序列也有较高的同源性。建立了SYBR GREEN法实时荧光定量RT-PCR表达分析系统, 研究了不同光周期处理下类Hd6基因在光周期敏感自交系CML288茎尖和叶片中的表达。结果发现, 该基因在茎尖和叶片中均有表达。在短日条件下, 该基因在6~8叶期茎尖中的表达量存在明显差异, 在光周期敏感的7叶期出现表达高峰, 在叶片中的表达量均低于茎尖。在长日条件下, 该基因在茎尖中6叶期表达量较低, 在光周期敏感的9叶期在叶片中高量表达。由此可推测, 该基因与玉米光周期敏感密切相关, 可能在光周期敏感调节过程中发挥一定的作用。     

水稻斑点叶突变体spl~(Z97)的生理特性及其基因定位

通过EMS诱变籼稻恢复系珍97获得一个稳定遗传的褐色斑点叶突变体spl~(Z97)(spotted leaf Z97,spl~(Z97))。大田条件下,突变体spl~(Z97)的斑点叶性状始于分蘖期,此后由叶缘向叶中下部迅速扩散,直至整个叶片,严重时叶片部分或整体枯死,从而致使突变体株高、每穗粒数及结实率极显著低于野生型对照。生理分析表明,与野生型珍97相比,孕穗期突变体spl~(Z97)剑叶、倒二叶和倒三叶的叶绿素含量极显著降低,而POD(peroxidase,POD)活性、O_2?~含量及MDA(malondialdehyde,MDA)含量升高;突变体spl~(Z97)倒二叶和倒三叶的CAT(catalase,CAT)活性和可溶性蛋白含量极显著降低,而SOD(superoxide dismutase,SOD)活性则极显著增加。组织化学分析进一步证实,突变体spl~(Z97)的叶片明显累积O_2?~。此外,突变体spl~(Z97)苗期经盐胁迫处理后,其株高及根长明显受到抑制。遗传分析表明,突变体spl~(Z97)的斑点叶性状受一对隐性核基因控制,借助图位克隆技术将该基因定位于第12染色体长臂的RM28466与RM28485两个SSR标记之间,物理距离为189 kb,该结果为进一步克隆SPL~(Z97)基因并研究其功能奠定了基础。     

津田芜菁BrSIZ1基因克隆、定位及表达

SIZ1是植物细胞蛋白质翻译后修饰SUMO化的E3连接酶,参与植物蛋白相互作用、定位和抗逆反应等。为研究BrSIZ1在津田芜菁中的表达特性,本研究克隆了津田芜菁SIZ1基因全长cDNA序列,命名为BrSIZ1 (GenBank登录号为KY441465),该基因全长2754 bp,其ORF全长2571 bp,编码856个氨基酸残基的多肽。构建了BrSIZ1-GFP表达载体进行亚细胞定位研究,结果显示BrSIZ1-GFP定位于细胞核内,可能在细胞核中发挥其功能。利用荧光定量PCR检测表明,该基因表达量在叶子中最高,幼苗和红色根皮中次之,表达具有组织特异性。而且BrSIZ1在芜菁根皮中的表达受长波紫外线(UV-A)诱导,在4°C、37°C胁迫的幼苗中,表达量增加。     

水稻叶片灰白转黄突变体pyr1的鉴定与基因定位

鉴定和克隆叶色突变基因对于深入了解叶绿素合成、降解途径的关系以及植物的光合作用有着重要的作用。从EMS诱变恢复系缙恢10号后代中鉴定出1个灰白转黄突变体pyr1,该突变体在苗期部分死亡,整张叶片呈现灰白色,在不同的生育时期叶片呈现不同的颜色,直到孕穗期叶片上部和叶缘表现黄色。苗期到抽穗期突变体叶绿素含量比野生型显著或极显著降低。透射电镜观察表明,突变体与野生型细胞结构无明显差异,但叶绿体发育异常,内部大量降解,基质片层退化。遗传分析表明该性状受1对隐性基因控制,利用326株F₂隐性定位群体将PYR1基因定位在第1染色体长臂上,位于标记RM11722和Ind1之间,物理距离约92 kb,本研究为PYR1基因的图位克隆奠定了基础。     

Development of a seedling screening test for predicting relative grain protein content in oats

Summary Growth room experiments were conducted to study associations of grain protein content with properties of seedling leaf sections of oats (Avena sativa L.) using (1) 10 cultivars differing genetically in grain % protein, and (2) 10 populations of a single high protien cultivar (Hinoat) differing phenotypically in grain % protein. These populations, which were derived from a nitrogen fertilizer experiment, had grain protein concentrations which varied over the whole range displayed by the high and low protein cultivars when the latter were tested in a conventional field trial.Seedling leaf % protein was closely associated with grain % protein in both (1) and (2). Chlorophyll content per unit leaf area and leaf dry weight per unit leaf area were significantly higher in the high than in the low protein cultivars, and were significantly higher in all the Hinoat populations than in the low protein cultivars.Excised seedling leaf sections were placed on filter paper moistened with 1 ppm kinetin solution and kept in the dark at 25°C. After 96 h chlorophyll content per unit leaf area was again significantly higher in the high protein cultivars and in all the Hinoat populations than in the low protein cultivars, and the consequent differences in leaf colour were then readily visible. Absolute amounts of chlorophyll lost per unit leaf area were similar in all cultivars and populations, but the low protein cultivars showed a greater proportional loss (as % of initial content). A colour scale was used to visually rate the senesced leaf sections. The visual rating allowed the rapid separation of the high and low protein cultivars, and there was no significant variation in the ratings of the Hinoat populations.It is suggested that this procedure may be useful in the early selection phases of protein breeding programs for screening large populations rapidly at the seedling stage to detect genetic differences in potential grain protein content.Contribution No. 438 from Ottawa Research Station.     

水稻早衰突变体esl2的遗传分析和基因定位

利用EMS诱变水稻籼型恢复系缙恢10号, 从其后代中鉴定出一个早衰突变体esl2, 苗期正常, 孕穗期开始叶尖和叶缘黄化衰老。与野生型相比, 孕穗期和抽穗期光合色素含量均显著下降, 抽穗期倒一叶的超氧化酶歧化酶(SOD)活性、可溶性蛋白(SP)含量降低, 活性氧(ROS)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)和脯氨酸(PRO)含量或活性增加。超微结构观察表明, esl2衰老部位的细胞多中空且形状不规则, 伴随细胞裂解、细胞质溶解等特征; 同时, 叶绿体结构异常, 叶绿体膜溶解、基粒模糊, 基质片层疏松, 类囊体发育异常。遗传分析表明, 该突变体受一对隐性核基因调控。利用1 005株西农1A/esl2的F₂隐性定位群体, 最终将Esl2定位在第4染色体SSR标记RM17122和swu4-13之间, 物理距离约244 kb, 这为Esl2基因的克隆和功能研究奠定了基础。     

乐都紫皮大蒜叶片生长发育与果聚糖代谢的关系

为了探讨高原大蒜生长特性及其果聚糖代谢规律,分析叶片生长发育与果聚糖代谢的关系,本研究以"乐都紫皮大蒜"为材料,对不同发育期的大蒜叶片生长情况、生理指标及其果聚糖代谢关键基因的表达特征进行了解析。结果表明:随着生育期的延续,大蒜植株的最大叶长、最大叶宽和单株叶片数均稳步增加。叶片生理指标呈现先升高后降低的趋势,总叶绿素含量在花芽分化之前快速上升,在抽薹期达到最大值2.32 mg/g FW;组织含水量在鳞茎膨大初期达到最大值89.06%,随后急剧降低。在整个发育过程中,大蒜叶片蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶基因(1-SST)和果聚糖外切水解酶基因(1-FEH)表达量存在显著差异,从幼苗期至鳞茎膨大初期,1-SST基因表达量显著高于1-FEH。1-SST的表达在全生育期表现为"升高-降低"的趋势,在抽薹期,1-SST的表达量达到峰值,比幼苗期提高了17.51倍;1-FEH在全生育期的表达量均较低,呈现起伏波动的趋势,在收获期表达量最高,是苗期的2.41倍。综合分析说明,大蒜叶片叶绿素和果聚糖的合成高峰主要在抽薹期,抽薹期是大蒜叶片生长发育和果聚糖代谢的关键时期,大蒜可通过叶绿素的合成以及1-SST和1-FEH的差异表达进一步影响鳞茎果聚糖的累积。     

陆地棉GhERF8基因的克隆与表达分析

 乙烯响应元件结合因子（Ethylene-responsive element-binding factor,ERF）是植物中最大的转录因子家族之一。本研究以棉花叶片cDNA文库为基础,从陆地棉中棉所10号中克隆得到一个新的ERF基因,命名为GhERF8（GenBank：JN656957）。该基因编码265个氨基酸,蛋白序列中包含一个AP2保守结构域。采用荧光定量PCR（RT-PCR）的方法,对GhERF8基因在棉株不同生育时期叶片和不同组织中的表达水平进行了定量分析。结果表明,GhERF8基因在各组织中均有表达,但在成熟后期的叶片中表达量最高。GhERF8表达量与叶片衰老过程中叶绿素含量出现相反的变化趋势,推测GhERF8可能与叶片衰老有一定关系。在乙烯利和茉莉酸处理下GhERF8基因在叶片中上调表达,而在脱落酸处理下GhERF8表达量无显著变化,推测GhERF8可能处于乙烯和茉莉酸信号转导网络中,且表达途径为非ABA依赖途径。