水稻抽穗期基因OsDof6功能的初步研究

【目的】以前期通过穗发育芯片筛选到一个水稻Dof家族转录因子OsDof6为研究对象,进一步探究OsDof6的表达模式与生物学功能。【方法】对OsDof6的基因、蛋白及启动子序列进行生物信息学分析,利用CRISPR/Cas9技术对该基因进行定点编辑,通过实时定量PCR和亚细胞定位技术分析该基因的表达模式。【结果】对该基因的启动子序列分析表明,该基因启动子中存在大量与光响应、激素响应及胁迫响应相关的顺式调控元件。利用CRISPR/Cas9技术获得了2种不同突变类型的功能缺失突变体9522^Dof6-3和9522^Dof6-4。对突变体T₁株系进行表型观察发现,相较于对照,两种突变体在营养生长阶段分蘖数明显降低,转入生殖生长阶段后,两种突变体的抽穗时间推迟约3 d。实时定量PCR结果显示OsDof6在水稻根、茎、叶和穗中均有不同程度的表达,在穗发育后期相对表达量明显提高;通过亚细胞定位分析发现OsDof6定位于细胞核。【结论】初步判断OsDof6基因会影响水稻分蘖数与抽穗期。     

水稻蔗糖转运蛋白OsSUT4参与蔗糖转运的功能研究

目的植物蔗糖的跨膜运输主要借助蔗糖转运蛋白（sucrose transporter,SUT）进行。在已鉴定出的5个水稻SUT编码基因中,OsSUT4的作用尚不清楚。方法采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建ossut4缺失变体,出现株高降低、分蘖数增加及产量下降等表型。结果通过进一步分析,发现ossut4突变体水稻叶片蔗糖、淀粉积累,反馈抑制光合速率;因源端光合同化物装载受阻,导致库端籽粒蔗糖供应不足,灌浆延迟。对OsSUT4进行亚细胞和组织化学定位,发现OsSUT4在细胞质膜上,且在萌发种子的胚、胚芽鞘的维管束、小穗颖壳、花药、颖果的糊粉层中都有表达,该现象表明OsSUT4具备转运蔗糖的特征。结论综上所述,OsSUT4在水稻蔗糖源端装载以及籽粒库端卸载等生理过程发挥重要作用。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除水稻NRR基因促进根系生长的研究

水稻营养应答和根生长基因NRR(Nutrition response and root growth)是一个多效基因,负调控水稻根系生长并参与调控营养组织淀粉合成。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻品种空育131的NRR基因进行编辑,获得2个NRR基因敲除的非转基因纯合突变体。突变体植株在各种营养条件下(有氮磷钾、无氮、无磷、无钾、无氮磷以及无氮磷钾)其幼苗主根长度、单株根数和根鲜重都显著高于野生型,这说明敲除NRR基因能够显著改良水稻的根系生长,为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术快速改良水稻品种的根系生长提供了一种有效策略。     

水稻株高基因对GA3敏感性及与酶的关系

 用3对水稻植株高度近等基因对，研究了株高基因对GA₃ 敏感性和酶的影响。结果表明，株高基因在苗期对GA₃ 敏感性强弱顺序为eui>sd1>Sd1>sds(t)；其中梗稻的Sd1敏感性强于籼稻的。 用胚乳培养法快速鉴别水稻株高基因对GA₃敏感性的结果与幼苗鉴定的一致，说明这种方法是有效的。 在酶活性方面，4 d的幼苗中高秆品系的过氧化物酶活力比矮秆品系的高， 而8 d的幼苗中矮秆的活力反而比高秆的强。经GA₃处理4 d和8 d后，对GA₃敏感的品系过氧化物酶活力较低， 过氧化物酶同工酶带8和酯酶同工酶带7与株高对GA₃的敏感性有关。     

利用CRISPR/Cas9系统定向编辑水稻SD1基因

【目的】半矮秆水稻品种的选育和应用是水稻育种的最重大成果之一。半矮秆品种大多是半矮秆基因SD1(semi-dwarf1)功能缺失突变体,为了获得sd1突变体,本研究对SD1基因进行了定向编辑。【方法】利用CRISPR/Cas9系统,以SD1基因为靶基因,构建基因编辑载体CRISPR-SD1,用农杆菌介导的方法转化水稻恢复系申繁17和申繁24。【结果】在2个转化受体的T₀代均获得了纯合的sd1突变体,并且在T₁代株系中分离出了不含转基因序列的植株。2个品种的sd1突变体与各自的野生型相比,株高分别下降了25%左右。【结论】利用CRISPR/Cas9系统可以有效地对目的基因进行编辑,在水稻分子育种领域具有巨大的应用价值。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑AFP1基因提高水稻耐逆性

[目的]为鉴定水稻AFP1在非生物胁迫响应中的作用,创制非生物胁迫抗性的水稻新材料.[方法]以优异籼稻恢复系华占为转化受体,利用CRISPR/Cas9技术创制afp1突变体,并对afp1突变体的耐逆性进行初步鉴定.[结果]AFP1靶点1和靶点2的编辑效率分别为66.67％和75.00％.所有突变株系中,突变类型仅有插入...     

利用CRISPR/Cas9技术编辑AFP1基因提高水稻耐逆性

目的 为鉴定水稻AFP1在非生物胁迫响应中的作用,创制非生物胁迫抗性的水稻新材料。方法 以优异籼稻恢复系华占为转化受体,利用CRISPR/Cas9技术创制afp1突变体,并对afp1突变体的耐逆性进行初步鉴定。结果 AFP1靶点1和靶点2的编辑效率分别为66.67%和75.00%。所有突变株系中,突变类型仅有插入和缺失突变,90%突变株系的突变长度为小片段突变（<5bp）。获得了6种无转基因成分的afp1纯合突变体。正常条件下,afp1突变体株高和结实率降低,有效分蘖增加,穗长显著升高,单株产量在-4.06%和11.75%之间变化。和野生型相比,afp1突变体的ABA敏感性和叶片水分散失率降低,耐干旱、热和渗透胁迫能力提高。结论 编辑AFP1基因可提高水稻多种非生物胁迫抗性。     

抗除草剂水稻种质资源研究进展

概述了除草剂的常见类型及其作用机制,综述了抗除草剂水稻育种的研究进展,展望了CRISPR/Cas9基因编辑技术在抗除草剂水稻育种研究中的应用与发展前景。     

CRISPR/Cas9系统编辑水稻Wx基因

【目的】 直链淀粉含量与稻米品质密切相关。Wx基因是控制水稻直链淀粉合成的主效基因,通过对Wx基因定点编辑以获得稳定遗传、直链淀粉含量适宜的突变体。【方法】 构建CRISPR/Cas9表达载体pGK03-Wx-gRNA (靶点1和2分别在Wx基因第1和第2外显子),利用工程菌EHA105遗传转化超级稻楚粳27,潮霉素筛选获得转化株系,对转化株系及其后代进行分子检测、测序、基因表达和遗传稳定性分析以及直链淀粉含量测定。【结果】 获得9个独立的T₀代转化株系,靶点1(L1~L5) 5个株系,突变频率100%,靶点2(L6~L9) 4个株系,突变频率75%。由T₀代突变体衍生出T₁和T₂代株系,测序发现T₀、T₁和T₂代株系出现缺失(单、双、多碱基缺失)和单碱基插入两种突变类型;T₀至T₁代部分株系(L1、L2、L3和L6)发生再编辑,T₁至T₂代遗传稳定。与野生型相比,突变株系RNA水平Wx基因表达量显著下降(P<0.01),稻米直链淀粉含量显著降低(P<0.01),从17.5%降到1.93%。【结论】 利用CRISPR/Cas9系统成功编辑水稻Wx基因,获得了稳定遗传、低直链淀粉含量的突变体,为稻米品质改良提供了材料。     

CRISPR/Cas9定点编辑水稻穗发育Osa1基因

CRISPR/Cas9是一种快速发展的基因组定点编辑技术。利用该技术对水稻穗发育基因Osa1进行定点编辑,精准敲除Osa1基因,获得Osa1功能缺失突变体,为Osa1基因功能的深入研究提供了准确可靠的突变体材料。     

Effect of Dominant Semi-Dwarf Gene on Plant Height and Its Related Traits and Sensitivity to Gibberellic Acid in Rice

The semi-dwarfness is one of the basiccharacteristic deployed in rice breeding due to itsadvantageous effects on plant fertilizer response,lodging resistance and yield potential [1-2]. Althoughmany new semidwarfing genes have been identified,sd-1 still remained the predominant semidwarfinggene presented in current rice cultivars [3-4]. Manystudies have been done on genetics of recessive dwarfand semi-dwarf rice genes and lots of new sd1non-allelic recessive dwarfing genes was discoveredas the …     

利用CRISPR/Cas9技术敲除水稻Pi21基因的效率分析

利用CRISPR/Cas9技术,针对Pi21基因的两个靶位点(靶位1和靶位2),构建基因敲除载体,转化水稻品种南粳9108。经PCR鉴定,获得了28株T0代阳性转基因植株。对靶位点酶切检测发现,靶位1突变效率为78.57%,靶位2突变效率为92.86%;靶位1和靶位2同时突变的效率为78.57%,突变效率较高。通过对靶位点进行测序,发现靶位点突变类型较多,包括碱基缺失、碱基插入、碱基缺失后插入其他碱基和大片段DNA缺失等类型。对突变株系进行氨基酸预测,发现大部分株系都存在移码突变现象而使基因突变彻底,少数株系表现为部分氨基酸的缺失或变异。成功敲除了水稻Pi21基因,并对突变效率和类型进行了分析,为进一步验证Pi21基因功能、培育广谱抗稻瘟病的水稻新品系奠定了基础。     

Function Analysis of Sucrose Transporter OsSUT4 in Sucrose Transport in Rice

【Objective】The transmembrane transport of sucrose is mainly mediated by sucrose transporters, among which five SUT coding genes have been identified in rice. However, the role of OsSUT4 in the sucrose transport is unclear. 【Method】CRISPR/Cas9 techniques were used to construct ossut4-deleted mutants. The ossut4 mutant was featured by lower plant height and grain yield as well as higher tiller number as compared with wild type plants.【Result】Sucrose and starch accumulation in the leaf of the ossut4 mutants lead to slower net photosynthetic rate; insufficient sugar supply results in the postpone of grain filling. Base on the subcellular and histochemical localization, OsSUT4 was located on the cytoplasmic membrane. Tissue localization showed that OsSUT4 was expressed in the embryo of germinating seed, vascular bundles of coleoptile, glume shell, anthers at flowering stage and aleurone layer of caryopsis at filling stage. 【Conclusion】OsSUT4 plays an important role in sucrose transport.     

敲除TMS5基因获得温敏不育粳稻新材料

【目的】水稻温敏不育系的选育是两系杂交稻育种工作中的关键环节。TMS5是控制温敏不育的重要基因，在生产上也应用较广。为了加快水稻温敏不育系的选育进程，【方法】利用CRISPR/Cas9技术，在武运粳7号背景下对TMS5基因进行编辑。【结果】通过测序从22株T0代中筛选获得6株纯合的突变体，分析发现6个纯合的突变体产生了相同的遗传变异，都在TMS5基因第2外显子44 bp和45 bp之间插入碱基“A”，导致翻译提前终止。通过细胞学观察和人工辅助授粉证实获得的株系花粉败育而雌配子正常发育。【结论】这些结果表明对温敏不育基因TMS5基因进行编辑可以快速获得粳型温敏雄性不育系。     

敲除TMS5基因获得温敏不育粳稻新材料

【目的】水稻温敏不育系的选育是两系杂交稻育种工作中的关键环节。TMS5是控制温敏不育的重要基因,在生产上也应用较广。为了加快水稻温敏不育系的选育进程,【方法】利用CRISPR/Cas9技术,在武运粳7号背景下对TMS5基因进行编辑。【结果】通过测序从22株T0代中筛选获得6株纯合的突变体,分析发现6个纯合的突变体产生了相同的遗传变异,都在TMS5基因第2外显子44 bp和45 bp之间插入碱基"A",导致翻译提前终止。通过细胞学观察和人工辅助授粉证实获得的株系花粉败育而雌配子正常发育。【结论】这些结果表明对温敏不育基因TMS5基因进行编辑可以快速获得粳型温敏雄性不育系。