奶牛小肠上皮细胞的原代培养和鉴定

为研究小肽转运蛋白对小肽转运和吸收机制提供细胞模型,在体外建立原代奶牛小肠上皮细胞分离的方法,采用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶混合消化液对奶牛小肠组织进行消化,通过2%山梨醇进行密度梯度离心以去除单核细胞、淋巴细胞和肌细胞;用刮除法、相差消化法和96孔板单克隆方法来纯化奶牛小肠上皮细胞,从细胞形态学、细胞角蛋白18免疫荧光染色和小肠上皮细胞特异性标志蛋白来鉴定奶牛肠上皮细胞。结果表明:1)采用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶联合消化奶牛小肠组织,通过2%山梨醇密度梯度离心可以获得大量的细胞团且48h发生贴壁,但是细胞贴壁不牢。2)48h之后细胞团进一步向外辐射生长出细胞,细胞形态呈现典型的上皮细胞和铺路石形态。5~7d细胞处于对数生长期,细胞大量增值,一部分成纤维细胞与小肠上皮细胞夹杂生长。3)通过96孔板能够单克隆奶牛小肠上皮细胞,细胞呈现均一的铺路石形态。4)奶牛小肠上皮细胞角蛋白18鉴定为阳性,荧光显微镜下能够发出绿色荧光。5)通过RT-PCR能够检测到奶牛小肠上皮细胞特异性标志蛋白E-钙黏蛋白、碱性磷酸酶和肠肽酶的表达,成功建立了奶牛小肠上皮细胞的分离和培养方法。     

兔小肠上皮细胞体外分离培养

选用新生未哺乳仔兔,应用胶原酶Ⅳ消化法对小肠上皮进行分离培养,得到兔小肠上皮细胞后,联合应用相差消化法和相差贴壁法对兔小肠上皮细胞进行纯化。通过形态学观察及细胞免疫组织化学方法对所得到的纯化兔小肠上皮细胞进行鉴定。结果表明：应用胶原酶Ⅳ消化法得到的兔小肠上皮细胞生长状况良好,纯化后得到95％以上纯度的兔小肠上皮细胞,纯...     

仔猪小肠黏膜上皮细胞体外分离培养及鉴定

 【目的】阐明产肠毒素大肠杆菌F18（ETEC F18）引发仔猪腹泻的机理,针对其候选基因FUT1 的CDS区第307位点处的突变（G→A）,建立3个仔猪小肠黏膜上皮细胞系（GG、GA和AA）。【方法】首先以胎鼠和仔猪为试验材料,确定小肠上皮细胞的最佳分离方法。采用XI型胶原酶和I型中性蛋白酶的联酶混合液,将胎鼠小肠组织机械剪碎后用联酶进行消化和直接将联酶灌注到仔猪小肠腔内消化的两种方法进行比较。针对仔猪小肠黏膜上皮细胞体外培养过程中成纤维细胞污染难以消除的问题,本研究采用局部画圈法逐步去除成纤维细胞。最后,用电镜和CK18免疫荧光染色对纯化后的原代仔猪小肠黏膜上皮细胞进行鉴定。【结果】两种小肠上皮细胞分离效率对比表明,后一种消化方式更为有效。进而取出生12 h内未吃初乳的大白仔猪,剖腹剪取其小肠段,使用联酶混合液灌注消化分离得到形态完整、容易贴壁生长的小肠绒毛细胞团。电镜和CK18免疫荧光染色结果均显示,小肠黏膜上皮细胞纯度达90%以上。经纯化处理,最后获得了FUT1基因型为GG和GA的两种小肠黏膜上皮细胞。仔猪原代小肠黏膜上皮细胞培养周期显示,7代前细胞生长状况良好,形态为典型的上皮细胞样,单层细胞呈铺路石排列,培养至第9代,细胞出现生长停滞、胞体空泡化等现象。【结论】最终获得了FUT1基因型为GG和GA的仔猪原代小肠黏膜上皮细胞。建立了仔猪小肠黏膜上皮细胞分离及培养方法,为后续的细胞建系工作奠定了良好的基础。     

新生仔猪小肠上皮细胞体外培养的研究

采用灌肠消化、组织块消化、机械刮取+胰蛋白酶消化和机械刮取+胶原酶消化等4种方法对仔猪小肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cell, IEC)的体外分离培养进行了比较.结果表明,使用机械刮取+胶原酶消化法分离IEC,可简便快速地获得数量大、活性高的小肠上皮细胞,其中原代培养细胞24 h出现贴壁,7～8 d明显增殖,10～12 d贴壁细胞汇合成片,18～21 d细胞呈"铺路石"状;传代培养细胞3 h出现贴壁,3～4 d快速增殖.采用碱性磷酸酶显色反应检测,90%以上的贴壁细胞呈阳性反应.     

仔猪肠黏膜上皮细胞体外培养及其对小檗碱适应性的研究

为了体外分离培养和鉴定仔猪肠粘膜上皮细胞,探讨小檗碱对体外培养的仔猪肠粘膜上皮细胞的安全剂量。本试验取刚出生未吃初乳的仔猪小肠的回肠段,用胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ进行消化处理,获得原代仔猪肠粘膜上皮细胞,用免疫组化法对培养的仔猪肠粘膜细胞进行鉴定,用MTT检测法测定硫酸小檗碱对仔猪肠粘膜上皮细胞的安全浓度。结果表明:免疫组化法分离培养的细胞膜呈棕黄色,为粘膜上皮细胞。硫酸小檗碱对体外培养的仔猪肠粘膜上皮细胞的安全浓度为20μmol/L。     

鸡小肠上皮细胞表面大豆凝集素受体的标记

以0日龄海蓝褐蛋鸡为材料,用胶原酶结合组织块培养的方法分离培养了鸡小肠上皮细胞,通过抗角蛋白单克隆抗体对分离的细胞进行纯度鉴定,并用荧光标记大豆凝集素对已鉴定的细胞大豆凝集素结合位点进行了标记.结果表明:试验获得了鸡小肠上皮细胞原代培养物纯度＞90%,可用于后续试验,荧光标记表明细胞表面存在大量的大豆凝集素受体.     

4种小鼠肠上皮细胞分离培养方法的比较

【目的】比较4种小鼠肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)分离方法的分离效果,建立小鼠IECs的有效分离培养方法,获得小鼠IECs原代细胞,为后续研究做准备。【方法】分别采用组织块培养法、嗜热菌蛋白酶消化法、胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法以及胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法共4种方法分离小鼠IECs并培养,通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的IECs进行细胞特异性鉴定,比较4种方法的分离效果。【结果】组织块培养法所获IECs活力好,增殖能力强,但成纤维细胞污染较严重,细胞纯度低;胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ分离法获得的IECs数量少且细胞增殖能力弱;嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法所获得的小鼠IECs纯度较高,原代培养时增殖能力稍弱于组织块培养法,但传代后增殖能力趋于稳定。通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的细胞进行鉴定,结果表明,分离的细胞多数为小鼠IECs。【结论】嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法均适合肠道上皮细胞的分离和培养。     

奶牛瘤胃上皮细胞分离培养与鉴定

在体外分离培养奶牛瘤胃上皮细胞,可为奶牛瘤胃生理功能和吸收机制研究和永生化奶牛瘤胃上皮细胞奠定基础。通过胰蛋白酶消化法从奶牛瘤胃组织中分离出瘤胃上皮细胞,并通过免疫细胞化学的方法检测细胞角蛋白,CCK-8检测细胞生长曲线,β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞的衰老以及细胞染色体核型分析来鉴定瘤胃上皮细胞。结果表明:1)利用胰蛋白酶消化法可以稳定的培养出瘤胃上皮细胞并且能够在体外传代大约5代;2)通过在显微镜下进行细胞形态的观察呈单层"岛屿状";3)在荧光显微镜下细胞角蛋白抗原能够发出绿色荧光;4)奶牛瘤胃上皮细胞传至第5代,β-半乳糖苷酶被染成蓝色,同时,细胞出现衰老和停滞生长;5)染色体核型分析表明奶牛瘤胃上皮细胞的染色体数为60条。研究发现通过酶消化奶牛瘤胃组织能够获得奶牛瘤胃上皮细胞,但只能传至5代。     

消化法培养山羊乳腺上皮细胞

为了寻找更加有效的山羊乳腺上皮细胞分离纯化方法。用2 g/L胶原酶和0.5 g/L胰蛋白酶相结合的消化法培养山羊乳腺上皮细胞,2~3 d细胞铺满单层,形态如铺路石。所得细胞再经0.5 g/L胰蛋白酶/0.2 g/L EDTA纯化3~4次,得到比较纯净的山羊乳腺上皮细胞。细胞鉴定结果表明,所得到的细胞角蛋白染色呈阳性,阳性率大于90%,波形蛋白染色呈阴性,具有典型的上皮细胞特性。消化法适用于山羊乳腺上皮细胞的体外培养。     

山羊小肠上皮细胞分离培养与鉴定

为研究山羊小肠上皮细胞营养吸收调控及其与肠道微生物之间的关系,提供原代细胞培养模型,采用组织块接种来获得山羊小肠上皮细胞,利用有限稀释法来克隆山羊小肠上皮细胞,并通过细胞形态学以及细胞角蛋白18、波形蛋白、肌间线蛋白和细胞生长曲线来鉴定山羊小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块接种能够分离纯化得到山羊小肠上皮细胞并稳定传至大约10代;2)RT-PCR检测发现山羊小肠上皮细胞不能够表达波形蛋白和肌间线蛋白;3)在正置显微镜下观察到山羊小肠上皮细胞能够产生细胞角蛋白18绿色荧光。研究发现,培养至第8代的山羊小肠上皮细胞仍然保持着上皮细胞的特征,至10代山羊小肠上皮细胞质变大,细胞几乎无法增殖,细胞开始凋亡。综上所述,采用组织块接种能够获得山羊小肠上皮细胞并正常传至第10代,可为研究山羊小肠上皮细胞营养物质吸收和调控机理提供细胞素材。     

鸽骨骼肌卫星细胞的分离、培养及成肌特性

【目的】探讨白羽王鸽Columba livia骨骼肌卫星细胞的分离、培养和鉴定的方法,建立完整的家鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系。【方法】选择孵化16 d的鸽胚作为试验材料,采用组织块贴壁法和胶原酶消化法分离胸肌的骨骼肌卫星细胞并绘制其生长曲线。待卫星细胞分化出肌管后,采用免疫荧光法检测肌球蛋白重链(MyHC)的表达;在细胞分化出肌管前、后分别提取总RNA,采用RT-qPCR方法检测Desmin、Pax7、MyoG和MyoD1基因在细胞分化出肌管前、后的相对表达量。【结果】组织块贴壁法和胶原酶法均能成功地分离出骨骼肌卫星细胞,其生长曲线呈"S"型;该细胞经含体积分数为20%FBS的DMEM高糖培养液培养7 d后视野中出现大量明显可见的肌管,成肌特异性标志MyHC表达呈阳性。RT-qPCR结果表明,Desmin和MyoG基因分化后的相对表达量分别是分化前的5.68和10.38倍,而Pax7和MyoD1基因分化前的相对表达量分别是分化后的7.01和5.51倍。【结论】建立了鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系,为今后进行家鸽肌肉发育的研究提供细胞模型。     

水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离·培养和生物学特性研究

[目的]建立一种高效的水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞分离培养方法,为胚胎着床和子宫内膜相关疾病的分子生物学机制研究奠定基础。[方法]采用酶消化、刮取、系列过滤和差速贴壁相结合的方法分离水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,用免疫细胞化学法和台盼兰染色法检测分离细胞的纯度和活率。[结果]成功分离培养出子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞;免疫荧光染色和细胞计数表明上皮细胞和基质细胞的纯度均达90％以上;台盼兰染色结果显示,上皮细胞的活率为91％,基质细胞的活率为78％。[结论]采用酶消化、刮取、过滤和差速贴壁相结合的方法可分离出高纯度的永牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。     

水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离·培养和生物学特性研究

1材料与方法1．1材料1．1．1取材。孕早期成年水牛子宫由南宁某屠宰场提供。1．1．2试剂。一次性细胞培养皿地幻自美同BD公司;新生牛血清购A杭州四季青公司;雌二醇购自宁波市激素制品有限公司;离糖型DMEM细胞培养液粉剂、DPBS粉剂和胶原酶I购自美因GIBCO公司;细胞角蛋白单抗和：二抗购白广州深达生物制品公司。另外,青霉素、链霉素、胰蛋门酶、表皮生氐因子（EGF）、     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养

【目的】探索一种简单且高效的原代奶牛乳腺上皮细胞的培养方法。【方法】采用组织块培养法、酶消化法培养奶牛乳腺上皮细胞;通过MTT法检测吸光度绘制细胞生长曲线;通过免疫组化法鉴定角蛋白-18的表达。【结果】酶消化法相比组织块培养法获得的细胞具有耗时短,获得量高等优点,MTT法绘制的生长曲线符合一般生物学特性,呈"S"型,奶牛乳腺上皮细胞中角蛋白-18阳性表达。【结论】酶消化法是一种简单且高效的培养原代奶牛乳腺上皮细胞的方法。     

牦牛子宫内膜腺上皮细胞分离培养方法比较

[目的]建立牦牛子宫内膜腺上皮细胞体外分离培养方法。[方法]分别采用组织块培养法和消化培养法分离、纯化牦牛子宫内膜腺上皮细胞。[结果]组织块培养约8d细胞可汇合成片,经胰蛋白酶分次消化,可得到纯化的子宫内膜上皮细胞;使用2g／L的胶原酶Ⅱ消化2．5h,更换新鲜消化液继续消化2．5h,消化悬液经74斗“滤网过滤,400r／rain离心5min,收集沉淀,重悬后自然沉降,可得到纯净的腺细胞团。免疫细胞化学显示所得细胞角蛋白染色阳性,阳性率达到95％以上。[结论]2种方法均可得到纯净的牦牛子宫内膜上皮细胞。     

单细胞测序对绒山羊毛乳头细胞的鉴定

【目的】 基于单细胞测序技术探究绒山羊毛乳头细胞标记基因,优化毛乳头细胞体外鉴定的方法,为研究绒山羊毛囊发生发育提供良好的细胞模型。【方法】 运用Seurat单细胞分析法分析陕北白绒山羊胚胎期60、90、120 d皮肤组织的单细胞测序数据。原始数据经质控、过滤、标准化后,采用UMAP方法进行数据降维与聚类分析。通过对比已报道的毛囊相关标记基因,获得完整绒山羊毛囊细胞类群谱系信息。通过基因差异表达分析,筛选绒山羊毛乳头细胞特异性标记基因。利用免疫荧光试验鉴定标记蛋白在绒山羊皮肤组织中的表达与分布情况,进一步筛选毛乳头区域特异性表达蛋白。体视镜下机械分离完整绒山羊毛囊,采用酶消化法分离绒山羊毛乳头区域并在体外培养至细胞分离,最终通过差速贴壁法纯化细胞。待毛乳头细胞纯度较高时,利用免疫荧光试验验证候选标记蛋白在分离细胞中的表达情况。【结果】 从单细胞水平分析了绒山羊毛囊发生过程中涉及的关键细胞转录信息,成功获得绒山羊皮肤中的17个主要细胞类群信息,鉴定出包括真皮细胞谱系、表皮细胞谱系、毛乳头细胞、毛干细胞、内根鞘细胞等绒山羊皮肤结构关键细胞类群,以及周皮细胞、巨噬细胞、肌肉细胞等其他功能细胞类群。筛选获得毛乳头细胞特异性基因427个,包括SOX2、FGF7、APOD、BMP3、HHIP、HEY2和SPON1等,这些基因在绒山羊毛乳头细胞中的表达丰度远高于其他细胞类型,被认为是毛乳头细胞特异性标记基因。组织免疫荧光试验进一步证明SOX2、FGF7与APOD等蛋白在绒山羊毛乳头区域内特异性表达,可用于皮肤组织中绒山羊毛乳头细胞的定位。此外,本研究在成功分离单根绒山羊次级毛囊的基础上,实现了绒山羊毛乳头区域的贴壁培养,成功观测到大量细胞从毛乳头区域逐步迁移分离的过程。细胞免疫荧光试验结果显示SOX2、FGF7与APOD均在绒山羊毛乳头细胞中表达,且SOX2阳性细胞约占毛乳头细胞总量的76%左右,而FGF7和APOD阳性细胞则占98%以上。结合绒山羊皮肤组织免疫荧光定位结果,SOX2、FGF7与APOD等标记可用于鉴定体外分离培养的绒山羊毛乳头细胞。【结论】 利用单细胞测序技术描述了绒山羊主要皮肤细胞的转录组信息,筛选出毛乳头细胞特异性表达基因。经免疫荧光试验证实,单细胞测序鉴定标记基因的方法简单高效,且具备较高准确率。筛选的SOX2、FGF7与APOD不仅为绒山羊毛乳头细胞体内定位提供了有效的标记,而且为多标记鉴定毛乳头细胞提供可能,更为进一步研究毛囊发育相关基因的功能及调控机制奠定重要基础。     

绵羊瘤胃上皮细胞的体外分离培养、冻存及复苏方法

本研究旨在建立绵羊瘤胃上皮细胞(Ovine rumen epithelial cells,ORECs)的分离培养、冻存和复苏方法,为反刍动物瘤胃功能的研究和相关瘤胃疾病的发病机制研究提供功能性的细胞模型。以绵羊瘤胃为研究对象,采用胰蛋白酶连续消化法对瘤胃组织进行不同时间(40、30、20、10、10、8和5 min)的消化,并对每次消化后的瘤胃组织和消化液分别进行H.E染色分析和显微镜观察,以确定细胞开始收集及终止消化的时间,最后将收集的瘤胃上皮细胞进行原代培养。在传代培养时,运用差时消化法和差速贴壁法对ORECs进行纯化,并从细胞形态学、细胞生长曲线、角蛋白18(CK-18)免疫荧光染色和上皮细胞标志物E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶基因表达等方面对ORECs进行鉴定。然后设置不同体积配方的冻存液,将传代细胞进行冻存,通过检测复苏后的细胞活力和24 h贴壁率确定最佳冻存液配方。结果表明:第4次消化后就基本消化到瘤胃组织的棘层,此时即可开始收集细胞;第7次消化完后瘤胃上皮的基底层细胞基本被消化掉,此时即可终止消化细胞。经纯化后传代的细胞呈现均一的"铺路石"形态,生长曲线明显呈"S"形,且经CK-18免疫荧光染色后鉴定为阳性,同时PCR检测到上皮细胞特异性标志蛋白E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶均有表达。此外,ORECs经不同体积配方冻存液冻存复苏后发现,冻存液配方为V_(FBS)∶V_(DMEM)∶V_(DMSO)=9∶0∶1时ORECs的细胞活力及贴壁率最高,且传代后的细胞生长状况良好。因此本试验成功建立了ORECs的体外分离培养、冻存和复苏方法。     

固始鸡脐带间充质干细胞原代培养及其诱导分化潜能研究

为了研究固始鸡脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs）的生物学特性和诱导分化,对其进行原代培养及定向诱导分化研究。选取14日龄固始鸡鸡胚的脐带组织,剥离脐带动、静脉,将华通胶部分剪成1 mm³大小,采用胶原酶消化法分离细胞并进行原代培养,观察细胞形态,绘制P3、P9、P15代生长曲线并测定群体倍增时间及克隆形成能力。结果表明,固始鸡UCMSCs形态为长梭形,生长趋势符合Logistic生长曲线规律,呈典型的S形;免疫荧光和RT-PCR结果显示,固始鸡UCMSCs表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD166等间充质干细胞表面标记物基因,但不表达原始造血祖细胞标志物CD34和泛白细胞标志物CD45;经特异性染色和RT-PCR表明,体外诱导固始鸡UCMSCs可分化为脂肪、成骨和成软骨细胞。从固始鸡脐带华通胶中分离所获得的UCMSCs具有良好的体外增殖能力和分化潜能,与从其他物种体内分离的UCMSCs具有相似的生物学特征,它们的多项分化能力预示着细胞移植的应用前景,可为再生医学和组织工程学提供新的潜在种子细胞。