毛竹GRF基因家族全基因组鉴定与表达分析

  目的  探究毛竹Phyllostachys edulis GRF基因家族的性质、结构特点以及在不同组织中的表达水平,为进一步研究GRF在毛竹生长发育中的分子作用机制奠定基础。  方法  采用生物信息学方法,对毛竹全基因组和转录组信息进行分析,筛选出13个毛竹GRF基因家族成员,并对GRF基因家族的理化性质、进化、基因结构、保守结构域、启动子、基因家族表达模式及三级结构进行分析。  结果  毛竹GRF基因家族成员按照其在scaffold上分布的位置,分别被命名为PeGRF01~PeGRF13;将含有3个内含子的PeGRF04和PeGRF12归为非ε组,其余为ε组。毛竹各GRF基因家族成员理化性质存在一定的差异,但是其结构域相对保守,均含有14/3/3结构域。毛竹GRF家族启动子区含有大量与光响应、低温响应、激素调控等相关的顺式作用元件。毛竹GRF存在基因复制扩增的现象,与水稻Oryza sativa的共线性关系明显高于拟南芥Arabidopsis thaliana。毛竹GRF在不同组织器官中均有表达,各家族成员的表达量存在差异;在毛竹花和根组织中的表达量略高于叶和鞭,同时家族成员间的表达量也存在一定差异。GRF蛋白质由2个单体构成,每个单体由9个α-螺旋构成,整体结构呈“W”型。  结论  毛竹GRF基因家族具有典型的14/3/3结构域,可能参与根、鞭、叶、花序及笋芽的生长发育过程。图6表1参39     

花楸树热激蛋白SpHSP70-3基因克隆与功能分析

  目的  探讨热激蛋白（HSP）在花楸树响应高温胁迫过程中的作用,以期为花楸树引种低海拔地区提供理论基础。  方法  以2 ~ 4年生花楸树实生苗为研究对象,进行了花楸树SpHSP70-3基因的克隆、系统进化分析、组织特异性表达模式以及响应高温胁迫的表达机制研究,并利用农杆菌介导法转化拟南芥,对SpHSP70-3基因在高温胁迫下的响应进行了异源验证。  结果  SpHSP70-3基因开放阅读框全长为2 088 bp,编码695个氨基酸;SpHSP70-3蛋白与蔷薇科梨属的白梨PbHSP70同源性最高。内源性表达分析显示:SpHSP70-3基因在叶片中表达量最高,在花蕾、初花、盛花时表达量偏低;42 ℃处理花楸树后,发现前6 h SpHSP70-3基因表达量没有显著变化,12 h时表达量增至对照组的12倍,24 h时表达倍数最高,为对照组的19倍。对3个转SpHSP70-3基因拟南芥纯合株系（OE1、OE2、OE3）和野生型拟南芥（WT）进行45 ℃高温处理后,OE1、OE2、OE3中的丙二醛（MDA）含量均高于WT,且过氧化氢酶（CAT）活性和过氧化物酶（POD）活性结果均低于WT。此外,SpHSP70-3在转基因株系中的表达量随着处理时间的增加而上升,并且其抑制了正调节因子AtHSP70、AtHSP18.2、AtHsfA1D和AtHsfA1A的表达,同时诱导了负调节因子AtHsfB2B的上调表达。  结论  SpHSP70-3在花楸树响应高温胁迫过程中起负调控作用,初步推测SpHSP70-3是花楸树引种低海拔地区响应高温响胁迫机制中的负调控因子。      

毛竹磷转运蛋白Ⅰ家族基因鉴定及表达模式

  目的  鉴定毛竹Phyllostachys edulis磷转运蛋白Ⅰ (phosphate transporter 1, PHTⅠ)家族基因,分析其表达模式。  方法  利用生物信息学方法,鉴定毛竹PHTⅠ家族成员,分析基因启动子调控元件、编码蛋白的理化性质、基因结构、氨基酸保守基序、基因在染色体的位置、组织表达特异性、基因适应性进化及系统进化等。  结果  毛竹中共鉴定出20个PHTⅠ家族基因 (PePHTs),分布在10条染色体上,均定位于细胞膜。每个基因都含有1~2个内含子,PePHTs启动子序列中包含干旱、低温等非生物胁迫以及赤霉素等激素类响应元件。毛竹PHTⅠ大部分为碱性蛋白质,分子量为48.61~76.37 kDa,理论等电点为6.84~9.30,疏水性值均大于0,都属于疏水蛋白。基因适应性进化分析显示:大多数PePHTs的选择压力值小于0,说明多数基因受到负选择压力。转录组表达图谱表明:PePHTs在不同组织中的表达存在差异性,说明该基因家族在毛竹生长发育过程中发挥着不同的作用。系统进化树表明:PePHTs都聚类在第Ⅰ亚家族,并且优先和水稻Oryza sativa聚类在同一支上。  结论  PHTⅠ家族在植物吸收和转运磷的过程中扮演了重要作用。本研究结果为深入研究毛竹PHTⅠ家族基因的功能奠定了理论基础。图5表1参45     

表达中国小麦花叶病毒（CWMV）外壳蛋白基因增强烟草对CWMV的抗病性

  目的  中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus,CWMV）是引起小麦黄花叶病的重要病原之一。获得表达CWMV外壳蛋白（coat protein,CP）的转基因烟草Nicotiana benthamiana（OECP）并分析其抗病性,为培育小麦抗病材料奠定工作基础。  方法  利用体外重组DNA技术构建含有CWMV外壳蛋白基因的表达载体,并通过农杆菌介导的转化方法,获得OECP。进一步利用Western Blot和PCR检测明确CWMV的外壳蛋白在OECP中能够正常的表达。  结果  部分转基因阳性植株出现矮化表型。此外,OECP阳性植株接种CWMV后7 d的定量分析表明,OECP中CWMV运动蛋白的表达量显著受到抑制。  结论  在烟草中表达CWMV的CP蛋白基因可显著增强烟草对CWMV的抗病性。     

欧洲千里光CYCLOIDEA(CYC)类SvRAY1基因的克隆及功能分析

  目的  揭示菊科Asteraceae欧洲千里光Senecio vulgaris CYC2类RAY1基因过表达使舌状花发生不同程度变宽现象的机制,进一步探究其产生原因。  方法  克隆欧洲千里光SvRAY1基因,利用生物信息学、实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR)、超表达载体构建、扫描电镜观察、转基因植株形态学观察与统计等方法与技术,进一步进行SvRAY1基因功能分析。  结果  qRT-PCR反应显示:SvRAY1基因主要在欧洲千里光舌状花及筒状花中表达,且生殖发育第S3和S4阶段舌状花中表达量最高;形态学观察表明转基因欧洲千里光SvRAY1超表达植株的舌状花比野生型长度较短、显著变宽。扫描电镜观察舌状花腹侧表皮细胞大小与形状,宽度显著变宽的株系中显示远轴端细胞排列紧密且细胞分裂旺盛,中轴端细胞形状由边缘弯曲变为平滑,细胞长度变短且分裂旺盛。  结论  欧洲千里光舌状花发育过程中,SvRAY1基因可能促进细胞横向分裂,进而舌状花细胞形态和排列发生不同程度的变化引起舌状花变宽。图6表2参28     

一个毛竹细胞色素P450基因的克隆与表达研究

从毛竹全长cDNA文库中分离到1个细胞色素P450基因,命名为PheCYP-1。相似性分析表明,其编码蛋白与拟南芥CYP706A亚家族蛋白相似性较高(42%~46%),属于CYP706家族;实时定量PCR结果表明,PheCYP-1在正在伸长的笋中表达丰度最高;将PheCYP-1构建到pBI121的多克隆位点,在拟南芥中过量表达,转基因拟南芥的次生木质部导管壁厚度显著增加,表明PheCYP-1基因可能与毛竹次生木质部的细胞壁发育有关。     

过表达毛白杨线粒体APX基因烟草提高抗逆能力的研究

  目的  为了研究毛白杨线粒体APX（PtomtAPX）在抗逆过程中的作用,本研究对过表达PtomtAPX的转基因烟草进行抗逆研究。  方法  对过表达PtomtAPX烟草和野生型烟草进行干旱、盐、氧化胁迫处理后,测量相对含水量、叶绿素含量、丙二醛含量、APX活性、AsA消耗量、NADP/NADPH比值和SOD活性。  结果  通过对比转基因烟草植株与野生型植株的生长差异发现,在氧化胁迫、盐胁迫和干旱胁迫下,转PtomtAPX基因烟草的APX活性、相对含水量、叶绿素含量、AsA消耗量、NADP/NADPH比值升高量均明显高于野生型,其中转PtomtAPX基因烟草的APX活性为野生型的1.77倍,平均相对含水量为野生型的1.15倍,叶绿素含量为野生型的1.6倍,AsA消耗量为野生型的1.11倍,NADP/NADPH值为野生型的1.18倍,表明过表达PtomtAPX转基因植株清除活性氧的能力更强。  结论  在非生物胁迫下,PtomtAPX能消除H₂O₂,防止细胞损伤,在植物抗逆中发挥重要作用。      

毛竹茎秆快速生长期类囊体膜蛋白复合物BN-PAGE分析

  目的  探讨毛竹Phyllostachys edulis笋竹茎秆的光合特性和光系统的发育情况。  方法  以当年生毛竹叶片和笋竹茎秆为材料,采用蓝绿温和胶电泳(BN-PAGE)分析茎秆和叶片类囊体膜蛋白,同时测定了光合色素含量和77 K低温荧光发射光谱。  结果  茎秆叶绿素和类胡萝卜素质量分数显著低于叶片(P＜0.01),随着茎秆发育,叶绿素和类胡萝卜素质量分数显著升高。茎秆和叶片类囊体膜PSⅡ核心复合物较完整,捕光色素较多;叶片和茎秆基部PSⅠ核心复合物分离主要得到PsaA/B和PsaD亚基,茎秆中部得到PsaA/B,茎秆顶部未发现PsaA/B。叶片和茎秆77 K低温荧光发射光谱在685和745 nm处有2个明显主峰,四阶导数光谱出现6个极大值,主要是PSⅡ和PSⅠ核心复合物的荧光发射峰以及由PSⅡ外周捕光天线(LHCⅡ)、PSⅡ内周捕光天线(CP47)、PSⅡ内周捕光天线(CP43)、PSⅠ反应中心复合体(RCI)、PSⅠ捕光天线(LHCⅠ)的发射荧光峰引起的肩峰,其中茎秆顶部LHCⅡ和PSⅡ核心复合体的特征发射峰与叶片相比有明显蓝移现象。  结论  毛竹茎秆中PSⅡ核心复合体已形成,随着茎秆发育,笋衣逐渐脱落,色素大量合成,内周天线蛋白CP47和CP43以及外周捕光天线蛋白逐渐形成;同时,茎秆受到光照后PSⅠ核心蛋白PsaA和PsaB开始形成,逐渐组装合成PSⅠ核心复合体。图4表2参45     

紫花苜蓿盐诱导类受体蛋白激酶基因MsSIK1的克隆及功能分析

【目的】对紫花苜蓿（Medicago sativa L. cv. Zhongmu-1）stress-induced protein kinase gene 1（MsSIK1）进行克隆与表达研究,了解该基因的分子机制及其应用。【方法】以紫花苜蓿叶片总RNA为模板,根据同源克隆设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得MsSIK1的编码序列。利用同源性比对进行序列分析。通过SMART网站（http://smart.embl-heidelberg.de/）模拟该基因的蛋白结构。构建MsSIK1的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将MsSIK1与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并观察其亚细胞定位荧光信号。通过Real time-PCR分析MsSIK1在NaCl、ABA和干旱处理条件下的表达特征。利用农杆菌侵染方法获得转基因拟南芥植株,通过RT-PCR对转基因植株进行表达鉴定,获得转基因植株后,利用转基因株系进行盐处理进而对成苗期转基因拟南芥性状鉴定。在盐胁迫处理下,测定野生型与转基因株系的叶绿素含量、MDA含量进而验证该基因的抗盐功能。【结果】获得MsSIK1编码序列2 478 bp,编码825个氨基酸。该蛋白C端与多种植物激酶具有相当高的同源性,模拟蛋白结构发现该基因具有类受体蛋白激酶高度保守的丝氨酸/苏氨酸结构域、跨膜结构域和富含亮氨酸重复序列的膜外结构域。Real time-PCR分析表明该基因在NaCl、ABA和干旱处理条件下上调表达,其中在盐处理条件下,MsSIK1表达先升高后降低,在处理4 h时达到最大值（约为对照值的7倍）。在干旱胁迫处理时,MsSIK1受诱导表达增强明显,当处理2 h时表达量达到最大值（约为对照值的6倍）;ABA处理时,MsSIK1被诱导表达明显,当处理3 h时表达量达到最大值,约为对照值的6.8倍。MsSIK1与GFP融合瞬时表达的洋葱表皮细胞中的荧光信号主要集中于质膜附近,转化空载体的洋葱表皮细胞中的荧光信号分布于细胞各个部位。转基因植株的RT-PCR鉴定表明,T₁代6个株系中所得到的MsSIK1条带明显、亮度高,且T₁-10中表达量最高;但在野生型中检测不到该条带,说明外源基因已经整合到拟南芥染色体中并能遗传到子代。成苗期转基因拟南芥盐处理后发现T₃-2、T₃-6、T₃-10转基因株系较野生型植株长势好,说明MsSIK1的转入提高了拟南芥的抗盐性。与对照相比,转MsSIK1拟南芥在NaCl处理下,叶绿素含量下降较少,其中,野生型叶绿素含量降低了77%,T₃-3降低了53%,T₃-6降低了44%,T₃-10降低了35%;同样盐胁迫下,3个转基因株系的MDA含量积累较少,其中,野生型MDA的含量是T₃-10株系的1.3倍。【结论】MsSIK1作为一个类受体蛋白激酶受多种逆境胁迫诱导,该基因的过量表达提高了拟南芥的抗盐性。     

2022 年 11 期目录

  目的  次生细胞壁的发育对于木材的形成至关重要,揭示林木次生壁形成的分子调控机制将为改良其木材品质提供理论依据。  方法  （1）本研究从速生型杨树NE19中克隆得到PdKNAT7基因,并构建表达载体,采用花序侵染法转化拟南芥,筛选得到过表达植株。（2）利用农杆菌介导的瞬时转化法侵染烟草,对PdKNAT7进行亚细胞定位。（3）通过徒手切片观察不同基因型拟南芥花薹基部的次生细胞壁厚度。（4）通过真空渗透的方法瞬时转化84K杨。（5）qRT-PCR分析不同品系杨树中PdKNAT7基因的表达情况,并揭示拟南芥和杨树中参与次生壁形成的相关基因的表达模式。  结果  （1）PdKNAT7定位于细胞核。（2）PdKNAT7主要在NE19杨茎中表达,且表达量高于107杨。（3）与野生型相比,过表达PdKNAT7的拟南芥花薹基部的束间纤维壁变薄,木质部纤维壁变厚,而突变体正好相反;另外,突变体的导管壁更厚。（4）过表达PdKNAT7的拟南芥植株中,4CL1、C4H1、CCR1、CesA8、IRX9和IRX10基因的表达量均下调,突变体中与之相反。（5）瞬时转化PdKNAT7基因的84K杨中,4CL3、C4H1、CCR1、CesA8、IRX9和IRX10基因的表达量也下调。  结论  PdKNAT7通过调控木质素和纤维素的积累来影响拟南芥次生细胞壁的厚度。      

拟南芥SGR2基因参与叶绿素降解和衰老过程

[目的]研究拟南芥SGR2基因参与叶绿素降解和衰老过程。[方法]购得SGR2(stay green rice,水稻滞绿基因)基因的T-DNA插入突变体,并进行叶绿素荧光分析、叶绿素含量和可溶性总糖测定、qRT-PCR等试验以及生物信息学分析。[结果]突变体叶绿素a含量较WT(colo-0野生型)降低;可溶性糖含量高于WT;RBCS(Rubisco,核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的小亚基)和CAB(Chl a binding protein,叶绿素a结合蛋白)基因表达下调。而突变体开花明显比野生型延迟。[结论]证明了SGR2基因参与了拟南芥叶绿素降解和衰老过程。     

毛竹叶片衰老特性及衰老相关基因的筛选和鉴定

收集野外定植3年的毛竹秆上具有明显衰老渐进特征的叶片簇,测量这些叶片的光合代谢效率(Fv/Fm)及叶绿素含量,建立毛竹不同衰老阶段叶片形态与其光合效率之间的关系.在此基础上,通过生物信息学方法(BLASTn)筛选出113个毛竹基因组中与水稻叶片衰老调控相关的同源基因,并检测这些基因在毛竹叶片发育和衰老过程中的表达趋势,鉴定一些与毛竹叶片衰老相关的标志基因.结果显示,毛竹叶片在衰老过程中其叶片的光合效率和叶绿素含量均出现显著下降;在筛选的113个基因中有86个基因在叶片中表达,其中32个基因在叶片衰老过程中没有变化,41个基因随着叶片衰老出现显著下调,13个基因出现明显上调.这些表达变化的基因与水稻中鉴定的同源基因在旗叶衰老过程中的表达模式基本一致,因此这些基因很可能在毛竹叶片衰老过程中也发挥同样的功能.     

4种醇类化合物在根部的施用对拟南芥生理特性和光合作用相关基因表达的影响

[目的]研究4种醇类化合物在根部的施用对拟南芥生理特性和光合作用相关基因表达的影响。[方法]分别用含3个不同浓度(2、4、6 mmol/L)甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇的MS培养基培养拟南芥幼苗,研究其对拟南芥生长的影响。[结果]2～4 mmol/L的醇类化合物对拟南芥幼苗的生长都有促进作用,其中促进作用最强的为2 mmol/L正丁醇,处理3周后植株鲜重与对照组相比增加了2.7倍以上,总蛋白和可溶性多糖含量也明显高于未经醇类化合物处理的植株,相较于对照组最多增加了78.5%和58.6%。光合色素含量也明显升高,且光合作用相关的一些基因的表达也在醇类化合物作用下明显上调。[结论]该研究为醇类化合物可促进拟南芥的生长这一理论提供了分子生物学方面的证据。     

观赏海棠叶片McmiR159a克隆及功能验证

【目的】为了验证观赏海棠叶片McmiR159a对花色苷代谢的调控作用。【方法】以观赏海棠红叶品种‘王族’为试验材料,确定McmiR159a前体基因序列并对其靶基因进行预测,构建McmiR159a过表达载体并瞬时转入‘王族’组培苗。其次通过高效液相色谱和qRT-PCR分析瞬时侵染植株中花色苷的含量及其合成途径中结构基因的表达量。【结果】结果表明,McmiR159a在观赏海棠中过表达下调其靶基因表达,上调花色苷代谢途径关键基因的表达,进而增加花色苷的含量。【结论】研究结果表明,观赏海棠中McmiR159a对花色苷的合成具有正调控作用。     

拟南芥高迁移率族蛋白B(HMGB)族基因的克隆及表达分析

[目的]为研究高等植物高迁移率族蛋白B家族的功能及作用模式。[方法]运用RT-PCR方法克隆出拟南芥HMGB蛋白家族中的3个基因：At2G34450、At5G23405、At5G23420,并运用SDS-PAGE、Northern检测及亚细胞定位等手段检测这3种蛋白在大肠杆菌及拟南芥中的表达。[结果]经鉴定,以上3种蛋白的分子量分别为17.5、17.0和27.5 kD,在拟南芥中表达量At5G23420〉At5G23405〉At2G34450,且这3种蛋白均定位于细胞核内。[结论]该研究结果为深入研究高等植物中HMGB家族蛋白的生物学功能奠定了基础。     

灰霉菌与其分泌毒素对拟南芥致病性比较

[目的]比较灰霉菌孢子悬浮液和灰霉菌分泌毒素对拟南芥的致病性差异。[方法]分别用灰霉菌孢子悬浮液和灰霉菌分泌毒素接种拟南芥叶片,然后观察二者对拟南芥叶片的发病情况。[结果]灰霉菌毒素对拟南芥有一定的致病力,且与孢子侵染有相似之处。灰霉菌在对拟南芥侵染的过程中分泌大量毒素,毒素能降解细胞壁,有利于菌丝的扩大生长。菌丝的扩大生长能分泌更多的毒素,因此两者相互配合杀死植物细胞。[结论]为灰霉菌毒素的分离、提纯、鉴定等研究奠定了基础。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450的表达及功能鉴定

[目的]研究高等真核生物细胞核中的高迁移率族蛋白B（HMGB）在植物胁迫反应的转录调控中的作用方式。[方法]克隆了拟南芥中编码HMGB蛋白的基因At2G33450,将其转化拟南芥并筛选出超表达的转基因植株,检测干旱、高盐等非生物胁迫对转基因拟南芥的影响。[结果]在盐或干旱胁迫下,过度表达At2G33450的转基因拟南芥与野生型相比,出现萌发及生长迟缓现象。[结论]HMGB蛋白家族中的At2G33450蛋白对各种胁迫条件下拟南芥的生长发育具有重要作用。     

不同pH对拟南芥生长发育的影响

[目的]探讨拟南芥生长的最适宜pH值。[方法]以模式植物拟南芥为材料,用人工控制pH值的方法,研究了不同pH值对拟南芥种子萌发及植株生长发育的影响。[结果]当pH值为6.5时,拟南芥种子萌发速度最快,叶片的叶绿素含量和株高最高,分别为53.04spad和24.5 cm;当pH值为5.5时,拟南芥主根相对伸长量最大,为6.2 cm。[结论]拟南芥生长的最适宜pH值为6.5,pH过高或过低均不利于拟南芥的生长。     

毛竹精油和正己烷提取物的GC-MS分析(英文)

[目的]分析毛竹精油和正己烷提取物的化学组分和得率,寻找潜在价值的活性化合物。[方法]水蒸气蒸馏和正己烷超声波辅助分别提取4个不同竹龄毛竹精油和正己烷提取物,并进行气相色谱/质谱(GC/MS)分析。[结果]结果表明柏木醇(46.39%)是7年毛竹中部精油的第一主要挥发性成分;邻苯二甲酸二丁酯(59.46%)是3年毛竹中部正己烷提取物的第一主要挥发性成分;毛竹正己烷提取物得率高于精油得率。[结论]柏木醇是一种具有潜在价值的活性化合物     

IP_3敏感的钙离子通透性通道参与茉莉酸诱导的钙动员

[目的]研究茉莉酸诱导的钙动员通往IP3敏感的钙离子通透性通道的作用。[方法]以低温导入法将钙离子荧光探针Fluo-3/AM导入拟南芥叶片细胞中,利用LASAF（Leica Application Suite-Advanced Fluorescence）软件记录肝素对茉莉酸（JA）诱导的胞内钙离子荧光强度的变化。[结果]经不同浓度的肝素预处理后,拟南芥叶细胞中胞内钙离子的荧光强度降低,再用100μmol/LJA处理时,其荧光强度升高,但仅与未经肝素处理的荧光强度相当。[结论]肝素预处理可抑制JA诱导的胞内钙离子浓度的升高。