桂花OfFCA基因的克隆及在花芽分化时期的表达分析

  目的  桂花Osmanthus fragrans是著名的香化植物，其花芽分化受到环境温度影响。研究环境温度对桂花花芽分化的影响对桂花的花期调控具有重要的指导意义。  方法  以桂花品种‘堰虹桂’O.fragrans ‘Yanhonggui’为材料，采用石蜡切片观察其花芽分化进程，运用聚合酶链式反应和实时荧光定量技术对影响温度FCA（FLOWERING LOCUS CA）基因分别进行克隆及表达特异性分析。  结果  克隆得到OfFCA cDNA序列长为1 319 bp，其开放阅读框为864 bp，编码287个氨基酸。序列比对及进化分析发现:OfFCA与木犀科Oleaceae油橄榄Olea europaea和胡麻科Pedaliaceae芝麻Sesamum indicum的FCA相似度较高，同源性可达68%以上。在桂花花芽分化的不同时期，无论叶还是花芽中，19℃环境低温下OfFCA基因的表达水平均显著高于25℃常温生长条件下的表达水平。  结论  桂花OfFCA基因响应环境相对低温的变化，参与桂花的花芽分化，使桂花的花期提前。     

桂花组织基因表达中荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选桂花Osmanthus fragrans不同组织基因表达分析中适合的内参基因,以桂花‘堰虹桂’O. fragrans‘Yanhong Gui’花蕾、盛开花序、嫩叶、成熟叶和1年生茎等5个不同组织为材料,利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测7个候选内参基因的表达水平,并利用geNorm,NormFinder和BestKeeper软件对各候选内参基因的表达稳定性进行评价,最后利用桂花不同组织中OfCRTISO1基因相对表达水平验证筛选的内参基因的可靠性。结果表明:综合3个软件的评价排序,确定不同组织中最佳内参基因为OfRAN1和OfUBC2,而Of18S是最差内参基因。OfCRTISO1基因相对表达水平分析证实,不同组织中qRT-PCR分析使用OfRAN1和OfUBC2等2个表达最稳定的基因组合,即可获得更为精确的基因表达结果。旨在为桂花组织间重要基因的定量表达分析提供科学依据。图 4 表 4 参34     

桂花OfNAC转录因子鉴定及在花开放阶段的表达分析

  目的  研究OfNAC基因对桂花Osmanthus fragrans花开放的调控作用。  方法  从桂花品种‘堰虹桂’O. fragrans ‘Yanhonggui’转录组数据中,筛选获得相关OfNAC基因序列,分析预测其理化性质和结构,运用实时荧光定量PCR技术分析花开放过程的表达特性。  结果  筛选得到22条OfNAC序列。生物信息学分析发现:22条OfNAC转录因子均含有NAM结构域,氨基酸序列含有5个保守的亚结构域(A~E),其保守性由强到弱依次为C、A、D、B、E;二级结构中不同结构的占比由大到小表现为无规则卷曲、α-螺旋、延伸链、β-折叠;亚细胞定位及跨膜结构预测表明:OfNAC17、OfNAC17-X2、OfNAC53、OfNAC91、OfNTM1-9是膜结合转录因子,且大多数OfNAC定位在细胞核。在桂花花开放进程中,OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73相对表达量在铃梗期(S₄)到达顶峰,在此之后相对表达降低;OfNAC43在铃梗期(S₄)骤然升高,并且在此时期相对表达最大;OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22从起始期(S₁)呈缓慢上升趋势,在顶壳期 (S₃) 到达最高,随后整体呈现下降趋势;OfNAC29-2在圆珠期(S₂)相对表达量陡然上升,在铃梗期(S₄)相对表达最低。  结论  推测OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73、OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22、OfNAC29-2等成员极有可能参与调控桂花的花开放。图6表3参33     

桂花OfPSY、OfPDS和OfHYB基因启动子克隆及表达特性分析

【目的】探究高温和外源脱落酸对桂花Osmanthus fragrans类胡萝卜素生物合成的3个相关基因,包括八氢番茄红素合成酶基因(PSY)、八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)、β-胡萝卜素羟化酶基因(HYB)的调控作用,为阐释桂花类胡萝卜素代谢调控的机制提供研究基础。【方法】根据桂花基因组数据库的序列,从桂花品种‘堰虹桂’‘Yanhong Gui’中克隆OfPSY、OfPDS、OfHYB基因的启动子序列,并进行生物信息学分析,再构建PCAMBIA3301-LUC载体在烟草Nicotiana benthamiana中瞬时表达,结合高温(37℃)和200 mg·L^-1脱落酸处理,分析启动子活性。【结果】获得OfPSY、OfPDS、OfHYB基因的部分启动子,其长度分别为1 908、1 521及1 830 bp。作用元件分析表明：3个启动子中均存在TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件、光响应元件、脱落酸响应元件以及MYB和MYC结合位点。此外,在OfPSY启动子中,存在赤霉素响应元件;在OfPDS启动子中,存在茉莉酸甲酯响应元件、赤霉素响应元件、厌氧诱导型...     

桂花OfCCD1基因启动子克隆与表达特性

类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCDs）参与植物中多种类胡萝卜素的代谢,在桂花Osmanthus fragrans中类胡萝卜素裂解双加氧酶基因1（OfCCD1）对花香物质的合成具有重要作用。根据前期获得的桂花‘堰虹桂’O.fragrans ‘Yanhong Gui’转录组数据库中OfCCD1的序列和前人已发表的OfCCD1序列设计引物,利用染色体步移技术从桂花基因组DNA中扩增获得OfCCD1基因2个拷贝的启动子序列OfCCD1P-L和OfCCD1P-S,其长度分别为2 747 bp和981 bp。2个启动子序列中均含有参与光响应的元件,热激响应元件（HSE）,脱落酸（ABA）响应元件（ABRE）和乙烯响应元件;此外,2个启动子中均含有4个ACGT序列。将2个启动子序列分别替代pBI121上的35 S启动子,将构建的载体通过农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导转化烟草Nicotiana tabacum叶片进行瞬时表达,发现2个启动子都具有驱动GUS报告基因表达的功能。     

桂花β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

为揭示桂花不同品种β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase,HYB)基因的序列差异,利用已构建的桂花花瓣转录组数据库中Unigene序列信息,结合RT-PCR技术对桂花品种玉玲珑、金球桂、堰虹桂和日香桂中2个β-胡萝卜素羟化酶基因(HYB1和HYB2)的最大阅读框进行扩增,并测序验证。生物信息学分析结果表明,4个桂花品种HYB1基因均含有长为909 bp的开放阅读框,编码302个氨基酸残基; HYB2基因均含有长为915 bp的开放阅读框,编码304个氨基酸残基。4个桂花品种HYB1和HYB2推导的氨基酸序列均具备保守的组氨酸结构域。HYB1基因核苷酸序列存在27个变异位点,其氨基酸序列存在8个变异位点; HYB2基因核苷酸序列存在12个变异位点,其氨基酸序列存在3个变异位点。进化树分析结果发现,4个桂花品种的HYB1和HYB2蛋白与茄科植物番茄和辣椒HYB蛋白亲缘性最高。     

桂花OfACOs基因家族鉴定及表达分析

【目的】对桂花Osmanthus fragrans乙烯合成路径氨基环丙烷羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carbox-ylate oxidase, ACO)基因家族进行了全基因组鉴定及表达分析,以探索参与桂花花瓣乙烯合成的关键ACO家族成员。【方法】以桂花品种‘柳叶金桂’O. fragrans‘Liuye Jingui’为参考基因组,对桂花OfACOs家族进行鉴定、进化分析、基因结构分析以及根、茎、叶、芽和不同开花阶段的表达模式分析。【结果】通过蛋白保守结构域(protein families,pfam)分析,从桂花基因组中共鉴定出了122个OfACOs成员,分布于22条染色体上;保守基序分析表明：大多数OfACOs基因同时包含Motif 1、 Motif 2、Motif 3、Motif 4和Motif 7这5个保守基序,它们共同组成OfACOs保守结构域;共线性分析结果表明：与拟南芥Arabidopsis thaliana基因为共线性对的基因可能具有相似的功能。结合swiss-prot同源序列对比分析,筛选出27个成员作为候选研究对象,进行不同组织部位根、茎、...     

桂花花冠裂片表面的超微结构观察

应用扫描电镜比较观察了早银桂Osmanthus fragrans‘Zaoyingui’,晚银桂Osmanthusfragrans‘Wanyingui’,早黄Osmanthus fragrans‘Zaohuang’,金桂Osmanthus fragrans‘Jingui’,硬叶丹桂Osmanthus fragrans‘Yingyedangui’,败育丹桂Osmanthus fragrans‘Baiyudangui’,四季桂Osmanthus fragrans‘Sijigui’,大叶佛顶珠Osmanthus fragrans‘Dayefodingzhu’等8个桂花品种花冠裂片的超微结构。结果表明:桂花花冠裂片上表皮细胞表面布满规则的突起条棱,气孔散乱地分布在花冠裂片基部。不同品种花冠裂片上表皮细胞的形态结构差异明显,主要表现在细胞形态大小和表面突起条棱疏密程度的差异。这些差异与不同桂花品种散发香气的浓淡有一定的相关性。图3参11     

桂花OfAP1基因的克隆及表达分析

AP1（APETALA1）基因在植物花分生组织及花器官形成过程中发挥着重要作用。以桂花品种‘堰虹桂’Osmanthus fragrans‘Yanhonggui’为材料,根据前期获得的转录组数据中AP1的序列设计引物,利用PCR技术,克隆得到约750 bp桂花AP1 cDNA序列,即OfAP1基因,其中开放阅读框长为720 bp（注册号为MH593222）。氨基酸序列比对发现,与其他物种的AP1基因的同源性高达69%~88%。荧光定量PCR结果表明:在不同组织中,桂花的OfAP1基因在花芽中的表达量显著高于其他组织,根中几乎不表达;在花芽分化过程中,OfAP1在成花转变及花芽分化初期（花瓣、花萼分化期）表达量较高,随后呈下降趋势。这说明OfAP1具有组织表达特异性,同时在桂花成花转变、花芽分化和发育中有重要作用。     

桃PpCBF2基因克隆及其响应低温表达特性研究

为探讨桃品种间抗寒差异的分子基础,以野生毛桃(Prunus persica)和17个桃品种和品系为试验材料,通过PCR与RT-PCR克隆PpCBF2基因;并利用qRT-PCR分析‘早红霞’和‘大久保’叶片中PpCBF2在低温下的表达特性。结果表明:1)毛桃PpCBF2基因的DNA和cDNA全长序列均为894bp,开放阅读框为690bp,编码229个氨基酸并且含有CBF家族的AP2/EREBP功能域;2)供试的17个桃品种和品系的PpCBF2基因核苷酸序列全长和编码氨基酸数目与毛桃相同,但有9个品种发生1～2个氨基酸位点突变:其中‘白芒蟠桃’、‘81715’和‘大久保’的突变发生在N-豆蔻酰化位点或酪蛋白激酶II磷酸化位点;‘Italia 3’、‘寒露’和‘B6832’的突变发生在AP2/EREBP功能域;3)‘早红霞’和‘大久保’PpCBF2基因均被低温诱导,品种间表达水平有显著差异。综上,该基因在桃品种间进化较为保守,但少数品种基因功能位点发生了突变;该基因被低温显著诱导,与抗冷性有关。     

桂林市桂花花期与气候因子关系研究

[目的]探索桂林市桂花开花规律,预测桂花开花时间,为桂林市开展桂花观赏旅游活动提供技术支持.[方法]采用普查和定期观测法,记录1999～2011年桂林市桂花的花期,并与桂林市历年的温度、湿度、降水量、雨日、日照时数等气象资料进行比较分析,采用逐步回归法,建立桂花花期预测模型.[结果]桂花花期与部分月份的降水、水气压、日照、雨日、最高温度等相关度较高,其中9月最高温度（x1）对桂林市桂花花期的影响最大,其次是2月中旬雨日（x2）.采用逐步回归方法,得到桂林市桂花花期的预报模型为：y=-166.680＋6.546x1-0.184x2.利用模型对桂花开花日期进行回测,结果表明预测模型的准确率较高,误差在0～3 d.[结论]花前温度是影响桂林市桂花开花的关键因素,花前温度越高,开花越晚;在桂花春梢萌发时期,雨日对桂花花期影响也显著,雨日越多,越有利于春梢生长,桂花开花越早.     

不同桂花品种开花及衰老过程中的花色物质成分分析

[目的]分析不同花色桂花品种开花及衰老过程中的花色物质成分及其含量变化规律,为桂花花色资源开发和利用提供参考依据.[方法]分别选取代表橙色品种群的镉橙丹桂、代表黄白色品种群的厚瓣银桂和代表黄色品种群的柳叶金桂,运用高效液相色谱质谱法检测其开花过程中的花色物质组分及含量,用色差仪测定花色参数L*(颜色亮度)、a*(红/绿程度)、b*(黄/蓝程度)和C*(彩度),用多元线性回归分析法逐步筛选分析花色呈现与特征花色物质含量的关系;分析不同花色桂花品种衰老过程中特征花色物质含量的变化规律.[结果]桂花中含有5种黄酮类物质,可能为金鱼草素苷元、槲皮素苷元、芹菜素苷元、鼠李金苷元和柚皮素苷元,其中槲皮素苷元在镉橙丹桂、厚瓣银桂和柳叶金桂盛花期花瓣中的含量均较高,分别为134.55、89.41和90.39 μg/gFW.对α-胡萝卜素和β-胡萝卜素进行定量分析发现,两种类胡萝卜素仅在镉橙丹桂中含量较高,分别为72.94和99.72 μg/gFW.对花色呈现与花色物质含量关系的分析结果显示,槲皮素苷元决定花色的亮度L*,柚皮素苷元决定黄色程度b*,β-胡萝卜素决定红色程度a*.其中,槲皮素苷元含量在镉橙丹桂、厚瓣银桂和柳叶金桂开花过程中均呈先降低后升高的变化趋势,β-胡萝卜素含量在镉橙丹桂开花过程中呈明显的先升高后降低的变化趋势,柚皮素苷元含量在柳叶金桂开花过程中呈缓慢上升趋势.[结论]槲皮素苷元、柚皮素苷元及β-胡萝卜素为桂花的特征花色物质,其在镉橙丹桂、厚瓣银桂和柳叶金桂开花及衰老过程中的变化规律共同决定了不同花色桂花品种花色明亮度具有随着花朵开放时间推移呈先加深后逐步黯淡的特征,而基本花色不产生明显变化.     

桂花品种群生物学特性调查——以武汉生物工程学院为例

[目的]对武汉生物工程学院桂花品种群生物学特性进行调查。[方法]从叶形指数、花径、叶柄长度、1年生春梢长度及叶绿素含量等生物学特性方面,对武汉生物工程学院的4个桂花品种群进行了详细调查和分类研究。[结果]金桂、银桂、丹桂品种群的生物学特性比较接近,而与四季桂品种群的差异较大。[结论]金桂、银桂、丹桂3者的亲缘关系较近,而与四季桂的亲缘关系较远。     

桂花切花品种筛选

对17 个桂花Osmanthus fragrans 品种的小花花冠径、着花繁密程度、花色、花香程度、花枝形态等特点进行调查研究。选择生长正常的健康植株采样, 其中繁殖器官样本数为10 ,营养器官样本数为20 。根据切花分级标准与桂花的观赏特点初步提出了桂花切花品种筛选的分类标准, 对供试桂花品种进行观赏价值的综合评判。结果表明:厚瓣金桂`Houban Jingui' , 柳叶金桂`Liuye Jingui' , 金桂`Jingui' 等为色、香、形俱佳的一级切花品种, 大花金桂`Dahua Jingui' , 硬叶金桂`Yingye Jingui' , 丹桂`Dangui' 等为二级切花品种, 早金桂`Zao Jingui' , 白碧金桂`Baibi Jingui' , 橙黄金桂`Chenghuang Jingui' 等为三级切花品种,而大叶金桂`Daye Jingui' 与四季桂`Sijigui' 不适宜作为切花品种。表4 参12     

杭州市桂花品种的分类整理

桂花Osmanthus fragrans为杭州市市花,栽培历史悠久。杭州桂花数量之多,栽培面积之大,品种之优,也已在全国闻名。对杭州传统栽培的桂花品种进行了系统的研究,并对四季桂的分类地位问题进行了讨论,在此基础上对杭州的桂花品种进行了分类和整理。杭州市传统栽培的桂花可分成6个种系,常见栽培的主要有宁波木犀Osmanthus cooperi,树Osmanthus heterophyllus和桂花等3大种系,其中树种系有3个品种,桂花种系可分为4个品种群,有59个品种(另有9个品种引入栽培),其中在杭州市各种传统资料中已有记载的桂花品种仅15个,新记录品种38个,新确定(新命名)品种6个。图1参14     

栽培五味子与野生五味子的品质评价

[目的]通过对栽培五味子与野生五味子的部分理化指标进行测定,对两者进行品质综合评价。[方法]采用HPLC法测定木脂素的含量,用费林氏试剂法测定总糖的含量,并用酸碱滴定法测定总酸的含量,以分光光度计法测定色价,并以高锰酸钾氧化法测定鞣质的含量,用紫外-可见光分光光度计法测定主要无机元素P的含量,并用原子吸收分光光度计法测定K、Fe、Zn和Cu的含量。[结果]栽培品种在总酸、总糖以及色价指标上明显高于野生品,而栽培品种和野生品中鞣质的含量没有太大的差异。4个栽培品种中1号质量最好,4号的质量较差。4个栽培品种五味子的五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的含量均明显高于野生品,1号和3号五味子质量较好,而在粗蛋白和粗灰分的含量上,栽培品和野生品没有太大的区别。在栽培品和野生品中检测出7种人体必需氨基酸(色氨酸未检出),在野生品中未检测出半胱氨酸,其中1号样品氨基酸含量较高,而野生品含量最低。栽培品五味子在无机元素(Fe、Zn、Cu、P、K和Mg)的含量指标上均高于野生品。4个栽培品种中,Cu、P和K在1号中的含量最高,Fe和Mg在3号中的含量最高,Zn在4号中的含量最高。[结论]综合各种检测指标表明,栽培品五味子的品质优于野生五味子。     

不同光周期和温度处理下桂花内参基因的筛选

光周期和温度处理能够影响桂花Osmanthus fragrans的基因表达水平和花芽分化过程,通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析基因表达已成为研究这些过程机制的重要手段,而筛选出适合光周期和温度处理的内参基因在研究桂花分子机制中尤为重要。为了得到不同光周期和温度处理下桂花中稳定的内参基因,以桂花品种‘佛顶珠’O.fragrans‘Foding Zhu’当年生枝条的第2或第3对幼叶为材料,以OfACT,OfEF1α,OfIDH,OfRAN1,OfTUB,OfUBC2和Of18S等7个基因作为候选内参基因,利用geNorm,NormFinder和BestKeeper 3个软件对候选内参基因的表达稳定性进行比较分析;以昼夜节律相关基因GIGANTEA（GI）对筛选出的最佳内参基因进行验证。结果表明:在不同处理条件下,桂花叶片中OfRAN1和OfIDH为最佳内参基因,Of18S的稳定性最差（geNorm分析结果显示OfRAN1和OfIDH的稳定值为0.347,而Of18S的稳定值为0.601;NormFinder显示OfRAN1和OfIDH的稳定值为0.135和0.206,而Of18S为0.474;BestKeeper显示OfRAN1的稳定值为0.80,OfIDH为0.133,而Of18S为0.474）;GI基因的相对表达水平分析表明（昼夜节律基因GI的表达模式为在白天累积并在夜间下降）,在7个内参基因及OfRAN1和OfIDH的基因组合中,使用OfRAN1和OfIDH的内参基因组合可获得GI基因更为精确的基因表达结果。综上所述,OfRAN1和OfIDH内参基因组合是桂花在不同光周期和温度处理下最佳内参基因组合。这为桂花分子机制研究奠定基础。     

苏州地区大花萱草新品种的筛选与评价

[目的]对引进的207个大花萱草(Hemerocallis spp.)品种进行筛选与评价,确定适合苏州地区栽培的大花萱草品种。[方法]通过对大花萱草栽培形态特征进行连续观察,将所有引进品种进行逐一筛选;根据测量性状进行分类,对其花色、抗性、植株高度和花期长短等性状进行考评。[结果]筛选出适合苏州地区生长的优良品种16个,其中常绿品种5个(sf-2、sf-3、sf-4、sf-6、p-14)、大花品种6个(n-2、n-3、n-4、n-5、p-24、nz-51)、2次开花品种1个(g-6)、长花期品种1个(j-1)、矮化品种1个(nzy-1)、复瓣品种2个(nzy-2、sf-11)。[结论]筛选出的16个优良大花萱草品种,适合长三角地区大范围推广,为园林设计提供更多的材料。