黄瓜黑星病菌致病机理的研究Ⅱ细胞壁降解酶及其在致病中的作用

 本文通过活体内外黄瓜黑星病菌(Cladosporium cucumerinum)产生的细胞壁降解酶活性分析,初步明确了Cx-酶(羧甲基纤维素酶)、β-葡萄糖苷酶和PMG(聚甲基半乳糖醛酸酶)、PMTE(果胶甲基反式消除酶)在该菌侵染黄瓜中的作用。瓜条感病的各部位,以病健交界处细胞壁降解酶活性最高;在检测的各类酶中,活性最高的为PMG、PMTE,Cx-酶、β-葡萄糖苷酶和FPA(滤纸酶)活性较低。抗感病黄瓜品种染病后,细胞壁降解酶活性均迅速增强。感病品种染病后,果胶酶(PMG、PMTE)活性远远高于抗病品种,其高峰值是抗病品种的2.72~7.52倍。感病品种接种后纤维素酶(Cx-酶、β-葡萄糖苷酶)活性一直增强;抗病品种接种后β-葡萄糖苷酶随着接种天数的增加酶活性一直增强,Cx-酶在染病后初期活性迅速增强,增至高峰后逐渐降低。     

番茄芝麻斑病原菌产生的细胞壁降解酶种类及其活性变化

番茄芝麻斑点病原菌能够产生一系列细胞壁降解酶,即果胶甲基酯酶(PE)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)、果胶甲基反式消除酶(PMTE)和纤维素酶(Cx)。酶动力学研究表明:产生的各种细胞壁降解酶均有特定的最适反应条件。水解酶类的PG、PMG、Cx最大酶活的pH均为5.0,温度均为50℃;裂解酶类的PGTE和PMTE最大酶活的pH均为9.0,温度均为30℃,与其他病菌产生的细胞壁降解酶的特性基本相同。在活体外,随着培养天数的增加PG、PMG、PGTE、PMGE、Cx的活性都大幅度增加,但所有酶活性都明显低于活体内的酶活性。     

细胞壁降解酶在油茶炭疽病菌致病过程中的作用研究

为明确细胞壁降解酶在油茶炭疽病菌致病过程中的作用,本文研究了活体内外炭疽病菌产生的细胞壁降解酶活性及其对叶片的降解情况。结果表明,活体外以羧甲基纤维素钠(CMCNa)为诱导底物,羧甲基纤维素酶(Cx酶)和漆酶活性最高;以柑橘果胶为诱导底物,果胶酶活性最高;以油茶叶为诱导底物,纤维素酶、果胶酶和漆酶可产生较高活力;并且经5种诱导物诱导的酶液对叶片均有降解作用。发病叶片的各部位,以病健交界处细胞壁降解酶活性最高。接种4d后开始发病,其细胞壁降解酶活性迅速增强;6d后滤纸酶(FPA)、β-葡萄糖苷酶和漆酶活性达最大值,分别为4.53、7.44、1.21U/mg;而Cx酶和果胶酶在第8天时酶活性最高,分别为15.79和25.49U/mg;接种10~16d,酶活性比较稳定。上述结果表明,纤维素酶、果胶酶和漆酶在油茶炭疽病菌致病过程中起重要作用。     

马铃薯早疫病病菌产生细胞壁降解酶的条件研究

为明确马铃薯早疫病病菌产生细胞壁降解酶的条件,采用液体培养基培养病菌。结果表明,病菌在改良的Marcus液体培养基中能产生多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、纤维二糖水解酶(Cx)和β-葡萄糖苷酶(βG)细胞壁降解酶。其中,果胶酶(PG、PMG)的活性较高,纤维素酶(Cx、βG)的活性较低。病菌产生果胶酶的适宜条件为培养液初始p H为4.0,30℃持续振荡培养4 d,纤维素酶初始p H为5.0,25℃持续振荡6 d。     

玉米茎腐病菌产生的细胞壁降解酶种类及其活性分析

 玉米茎腐病菌Pythium aphanidermatum、Fusarium graminearum能够产生一系列细胞壁降解酶,即果胶甲基酯酶(PE)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)、果胶甲基反式消除酶(PMTE)和纤维素酶(Cx)。Fusarium graminearum产生的细胞壁降解酶活性明显高于Pythium aphanidermatum。病菌在活体内和活体外产生的细胞壁降解酶活性明显不同。酶动力学研究表明:Fusarium graminearum产生的各种细胞壁降解酶均有特定的最适反应条件。水解酶类的PG、PMG、Cx最大酶活的pH分别为6.0、5.0、6.0,温度分别为50、40、50℃;裂解酶类的PGTE和PMTE最大酶活的pH均为9.0,温度分别为30、20℃,与其它病菌产生的细胞壁降解酶的特性基本相同。     

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种细胞壁降解酶的比较

对香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的细胞壁降解酶进行比较。通过测定4号生理小种在寄主体内细胞壁降解酶的活性发现,能检测到多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)、果胶甲基反式消除酶(PMTE)和纤维素酶(Cx)的活性。在不同碳源培养条件下,2个生理小种均有以上5种酶的活性,以1%柑桔果胶为碳源时产生的PMG和PG活性明显高于其他几种酶的活性,而以1%CMC为碳源时,所产生的Cx都比其他几种酶的活性高。细胞壁降解酶同工酶电泳后发现,4号生理小种在寄主体内和体外培养时都比1号生理小种多分泌一种PG。2个生理小种在体外培养时分泌的PMG、PGTE和PMTE没有差异。4号生理小种在寄主体内比1号生理小种多分泌一种PMG,却少分泌一种PGTE,2个生理小种在寄主体内的PMTE则没有差异。     

莲子草假隔链格孢SF．193的细胞壁降解酶研究

采用3,5一二硝基水杨酸法分析了莲子草假隔链格孢NimbyaalternantheraeSF一193菌株在活体内外产生的羧甲基纤维素酶（Cx）、口．葡萄糖苷酶、木聚糖酶、聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和多聚半乳糖醛酸酶（PG）的活性。结果表明,SF一193可产生cx、伊葡萄糖苷酶、木聚糖酶和PG,且4种细胞壁降解酶在活体外和活体内的活性显著不同。其发酵滤液中以PG活性最高,其次为木聚糖酶、,β-葡萄糖苷酶和Cx;在空心莲子草叶片内以Cx活性最高,其次为β一葡萄糖苷酶、木聚糖酶和PG。在活体内,4种酶活性随接种天数和温度的变化而不同。Cx和卢．葡萄糖苷酶的活性在接种第3d达到最大,木聚糖酶和PG活性则分别在第2d和第5d达到最大;Cx、卢一葡萄糖苷酶和PG活性在30℃时最高,而木聚糖酶活性在35℃时最高。     

酚类物质和代谢对瓜果腐霉菌产生的细胞壁降解酶活性的影响

 本文明确了间苯三酚、邻苯二酚、香草醛对黄瓜苗期猝倒病菌瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)生长及其细胞壁降解酶体外合成和活性的影响。结果表明:3种酚类物质中香草醛抑制病菌生长比较明显,随着香草醛浓度提高,病菌菌落直径下降。3种酚类物质均能明显抑制病菌4种果胶酶(PG,PMG,PGTE,PMTE)的合成和活性,3种酚类物质抑制作用因果胶酶种类而异。邻苯二酚和香草醛对PG合成抑制比较明显。间苯三酚和邻苯二酚在各浓度下均完全抑制PMG合成。酚含量20ppm以上时,香草醛完全抑制了PGTE和PMTE合成,间苯三酚完全抑制了PMTE合成。香草醛对PG、PMG和Cx活性均有明显抑制作用。随苗龄增加过氧化物酶活性升高,木质化程度加强,寄主抗果胶酶降解能力也相应增加。寄主细胞壁降解中释放的半乳糖醛酸有刺激过氧化物酶活性的作用,这可能属于一种寄主自卫反应。     

枯萎病菌对不同抗性黄瓜品种几憾活性的影响

用枯萎病菌接种不同抗性黄瓜品种,研究不同抗性黄瓜品种的过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和几丁质酶的活性变化。结果表明,接种后抗感品种POD、PPO和几丁质酶活性基本都呈现先升后降再升（再降）的趋势。抗感品种均在接种后12h时出现第1次POD活性峰值,抗病品种中农13号、津优3号分别在接种后60、72h、感病品种在84h出现第2次POD活性峰值;接种后24h时抗感品种均达到第1次PPO活性峰值,抗病品种在48h、感病品种在60h时达到第2次PPO活性峰值;接种后抗病品种在48h时达到第1次几丁质酶活性峰值,72h时达到第2次峰值,而感病品种只在60h时出现1次几丁质酶活性峰值。抗感品种的POD、PPO、几丁质酶活性的2次培值都显著或极显著地高于各自的对照,在接种后的早期阶段,感病品种的POD、几丁质酶活性的第1次峰值都显著或极显著地高于抗病品种,PPO活性的第1次峰值极显著地低于抗病品种。     

枯萎病菌对不同抗性黄瓜品种几种酶活性的影响

用枯萎病菌接种不同抗性黄瓜品种,研究不同抗性黄瓜品种的过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和几丁质酶的活性变化。结果表明,接种后抗感品种POD、PPO和几丁质酶活性基本都呈现先升后降再升（再降）的趋势。抗感品种均在接种后12 h时出现第1次POD活性峰值,抗病品种中农13号、津优3号分别在接种后60、72 h、感病品种在84 h出现第2次POD活性峰值;接种后24 h时抗感品种均达到第1次PPO活性峰值,抗病品种在48 h、感病品种在60 h时达到第2次PPO活性峰值;接种后抗病品种在48 h时达到第1次几丁质酶活性峰值,72 h时达到第2次峰值,而感病品种只在60 h时出现1次几丁质酶活性峰值。抗感品种的POD、PPO、几丁质酶活性的2次峰值都显著或极显著地高于各自的对照,在接种后的早期阶段,感病品种的POD、几丁质酶活性的第1次峰值都显著或极显著地高于抗病品种,PPO活性的第1次峰值极显著地低于抗病品种。     

不同品种香蕉抗枯萎病效果及抗性生理研究

通过盆栽试验研究了向土壤中接种尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(FocTR4)后不同抗枯萎病香蕉品种发病率、根际可培养微生物及防御酶活性的变化。结果表明:试验处理中香蕉枯萎病发病率随着FocTR4接种浓度的增加而上升,但在相同浓度处理下,抗病品种发病率显著低于感病品种;各品种香蕉发病率与根际土壤可培养镰刀菌数量均呈显著正相关关系。抗病品种过氧化物酶(POD)、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性高于感病品种,而与多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性存在一定的相关性。说明香蕉抗病性与香蕉根际土壤微生物群落结构及香蕉本身防御酶活性有关。     

细胞壁降解酶在球刺盘孢侵染过程中的作用

为明确球刺盘孢Colletotrichum coccodes产生的细胞壁降解酶(CWDEs)在其侵染马铃薯过程中的作用, 本文对球刺盘孢离体和活体条件下产生的CWDEs种类及活性进行检测, 并通过RT-qPCR测定了球刺盘孢侵染过程中多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的表达情况。通过定性测定发现, 球刺盘孢能够产生果胶酶、纤维素酶和蛋白酶; 定量测定发现, 球刺盘孢可产生羧甲基纤维素酶(Cx)、β-葡萄糖苷酶(β-Glu)、PG和聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)。在活体条件下, 球刺盘孢可在马铃薯茎秆内产生PG、PMG和多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE), 且酶活分别于接种后48、72 h和144 h达到最大值, 分别为26.50、77.61 U/mL和0.16 U/mg。分别将羧甲基纤维素钠和果胶诱导后的酶液接种至马铃薯茎秆可引起植物组织浸腐, 与球刺盘孢引起的典型症状相似。除此之外, 球刺盘孢的4个PGs基因均在其侵染后24 h和48 h显著共上调表达。综上所述, 该研究结果表明, 果胶酶在球刺盘孢致病过程中发挥重要作用。     

温湿度调控对番茄灰霉病菌产生的细胞壁降解酶的影响

 番茄灰霉病菌在致病过程中能够产生4种细胞壁降解酶,以PMG酶活性最高,其次是β-葡萄糖苷酶和PG酶,Cx最少。灰霉病菌在不同温度下侵染番茄叶片时产生的致病酶活性不同,4种酶在20℃时表现了最高的活性,15℃次之,当温度达到25℃时,各种酶的活性都急剧下降,随着温度的再升高,酶活更低。随着湿度的增高,病菌产生的细胞壁降解酶的活性也增加,当相对湿度达到90%以上时,4种酶的活性也达到最高。温湿度对番茄灰霉病菌产生细胞壁降解酶的影响趋势,与其对发病的影响趋势是一致的。     

β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性与大豆对疫霉根腐病抗性的关系

 为了明确β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶与大豆抗疫霉根腐病的关系,测定了不同抗性大豆品种接种大豆疫霉菌后β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性的变化情况和2种酶对大豆疫霉菌的抑制作用。结果表明,大豆疫霉菌能诱导大豆β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的活性增强,但2种酶在积累速度和幅度上,抗病品种和感病品种有显著的差异。与感病品种"857-1"相比,抗病品种"垦农4号"2种酶活性不仅升高的速度快、幅度大,且高活性维持的时间长。β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶混合液对大豆疫霉菌的菌丝生长、孢子囊形成和孢子萌发的抑制作用明显,其次是β-1,3-葡聚糖酶,而几丁质酶对大豆疫霉菌的抑制作用不明显。表明大豆对大豆疫霉根腐病的抗性与β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的活性呈正相关关系。β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶混合对大豆疫霉菌的抑制具有协同增效作用。     

豇豆与锈菌互作中的多酚氧化酶和过氧化物酶活性及其与抗性的关系

测定了具有不同抗性水平的5个豇豆Vigna sesquipdalis Wight品种在受锈菌Uromyces vignae Barcl侵染前和侵染后的若干阶段中的多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性,并分析其与抗性的关系.结果表明,在接种后24h内,免疫和抗病品种的PPO比活性及其变化率均高于感病品种,且前者PPO比活性变化率高峰出现早,后者出现迟.在接种后,各品种的POD比活性及其变化率均上升,但中抗和感病品种的高峰出现早,免疫和高抗品种出现晚.此外,中抗和感病品种的POD比活性及其变化率在接种12h左右出现高峰后立即下降,而高抗品种的则持续上升至24h左右出现高峰,免疫品种的POD比活性也在24h左右出现高峰,但其POD比活性变化率则持续到48h左右达到高峰,且免疫和抗病品种的峰值明显大于感病品种.     

黑痣病菌毒素对马铃薯幼苗生理生化抗性相关物质的诱导

为了探讨马铃薯抗黑痣病机制,采用毒素接种脱毒组培苗的方法,研究了黑痣病菌毒素对马铃薯不同抗性品种幼苗体内病程相关蛋白、木质素及游离脯氨酸含量的影响及其与抗黑痣病的关系。毒素处理后,感病品种大西洋和抗病品种底西芮幼苗几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性均明显升高,36 h升高幅度均达到最大,感病品种升幅大于抗病品种。底西芮和大西洋木质素及游离脯氨酸含量也大幅增加,但抗病品种的增加幅度大于感病品种。研究表明,黑痣病菌毒素诱导几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性升高以及木质素和游离脯氨酸含量增加是马铃薯幼苗抵抗毒素胁迫的内在机制;木质素、游离脯氨酸含量与品种抗病性呈正相关,而几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性变化则不是引起品种抗性差异的主要原因。     

枯萎病菌对西瓜不同抗感品种丙二醛含量及某些保护酶活性的影响

 本文以西瓜为材料,研究了西瓜苗期感染枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schlecht.)后根部细胞内丙二醛含量、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的动态变化。结果表明,受枯萎病菌侵染的幼苗细胞内MDA含量的增加比率,抗病品种克伦生低于感病品种早花;SOD酶活性的下降比率,抗病品种克伦生低于感病品种早花;CAT酶活性增减的幅度,抗病品种克伦生低于感病品种早花。抗病品种克伦生在染病后的短时间内(48h左右)能使细胞内MDA、SOD酶和CAT酶的代谢基本恢复到正常状态,其自我调节和恢复正常状态的能力显著大于感病品种早花。     

凸脐蠕孢菌玉米、高粱专化型的细胞壁降解酶活性及基因表达分析

为探明玉米专化型和高粱专化型凸脐蠕孢菌的细胞壁降解酶在致病过程中的作用,采用酶活性检测方法测定了2种专化型的细胞壁降解酶活性,并检测了相关基因的表达。结果表明:高粱专化型凸脐蠕孢菌的聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性为115.84 U/mg,略高于玉米专化型;玉米专化型的多聚半乳糖醛酸酶(PG)和纤维素酶(Cx)的活性分别为151.76 U/mg和168.53 U/mg,略高于高粱专化型;且同一种专化型菌株的细胞壁降解酶活性存在差异。2种专化型的细胞壁降解酶基因表达量存在差异,Cx基因在2种专化型互作过程中均随病程的延长而大幅度上调表达;高粱专化型的PG基因随病程的延长大幅度上调表达,而玉米专化型的PG基因随病程的延长上调表达量有所下降;高粱专化型的PMG基因随病程的延长大幅度上调表达,而玉米专化型的PMG基因随病程的延长下调表达。推测产酶能力、基因表达和基因时间表达的差异可能是引起凸脐蠕孢菌专化型致病专化性的诱因之一。     

棉株体内几种生化物质与抗枯萎病之间关系的初步研究

 棉花抗枯萎病品种86-1、陕1155,感病品种岱15、徐州142。在棉幼苗三叶期用采自河南王屯的棉枯萎菌7号小种接种,接种后12小时,各抗病品种的葡萄糖、核糖含量显著增加,而感病品种则相反。接种后抗病品种的苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性峰出现早于感病品种,相对酶活值也高于感病品种。接种后抗病品种蛋白质含量出现先低后高趋势,感病品种则始终保持较高水平。木质素含量的增加与棉花品种抗病性存在正相关性。伴随着PAL活性的增加,木质素含量也迅速增加。结果表明,棉花品种对枯萎病的抗性与PAL活性有密切关系,并通过代谢最终产物之一的木质素的增加得到表达。     

黄瓜腐霉菌苗期猝倒病致病机制研究

 本文明确了Pythium aphanidermatum主要靠生产以PG(多聚半乳糖醛酸酶)为主的一系列细胞壁降解酶的协调作用侵染黄瓜幼苗。植株胚轴细胞壁随苗龄增加,果胶物质增加最明显。病菌可在健胚轴及其细胞壁上培养产生果胶酶,其中细胞壁对PG的诱导作用比胚轴明显。随病菌致病力增强或病菌果胶酶浓度加大,胚轴的浸解和释放还原糖愈加明显。健株外渗物中虽也含有细胞壁降解酶,但比病菌的产生量少,活性低。病菌在寄生体内产生的细胞壁降解酶总酶活性,尤其是PG总酶活性与病菌致病力关系最为密切。这类细胞壁降解酶易受培养基成分和酸度的影响。经染色、显微及超微观察证实了该菌侵入黄瓜苗的机制是以酶解作用为主。