玫烟色棒束孢研究进展

玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)作为一种较为常见的昆虫病原真菌应用于害虫防治,其生长发育受多种生态因子影响,对寄主昆虫的致病过程复杂,并涉及多种基因及其产物的调控,实践应用防效不稳定,限制了其应用。菌株改良虽可提高毒力并扩大其应用范围,但仍存在很多待解决或未知的问题。为了解目前国内外玫烟色棒束孢的研究现状,就其生物学特性、生长发育及致病影响因子、致病过程及机理、菌株改良及应用等方面进行了综述。     

重要昆虫病原真菌玫烟色棒束孢的研究进展

玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)是一种重要的昆虫病原真菌,在生物防治中起着重要作用。从生物学特性、代谢产物、致病力及其致病机理和遗传变异等方面对国内外有关玫烟色棒束孢的研究进行概述,旨在为玫烟色棒束孢的进一步深入研究及开发应用提供参考。     

玫烟色棒束孢基因组候选效应因子的预测分析

在玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）全基因组10 061个蛋白质序列的基础上,经过SignalP v4.1分析得到1 112个具有信号肽的蛋白序列;以此为基础用TMHMM v2.0分析得到1 030个跨膜数小于2的蛋白序列;1 030个具有信号肽的蛋白经过TargetP v 1.1分析得到1 001个定位为S的蛋白序列;最后经过ProtComp v 9.0分析,得到929个蛋白质定位于细胞质中的分泌蛋白序列。929个蛋白中包含半胱氨酸含量大于等于6的蛋白序列共495个,其中146个蛋白序列的串联重复序列大于或等于9。共137个蛋白在病原物-寄主互作数据库（Pathogen-host interaction database,PHI）中获得注释,其中91个蛋白为候选效应蛋白。挑取小于300个氨基酸的蛋白序列,共筛选到19个候选效应因子。最终从10 061个蛋白序列中筛选得到19个候选致病效应因子。     

玫烟色棒束孢侵染对烟粉虱成虫体内不同酶活的影响

对玫烟色棒束孢侵染烟粉虱成虫后其体内的保护酶(超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT))和解毒酶(谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarE))的活力进行测定。结果表明,玫烟色棒束孢侵染烟粉虱成虫后,烟粉虱成虫体内SOD,POD,CAT,GSTs和CarE活力都受到明显影响;SOD,POD,CAT,GSTs和CarE活力在感病前期均有上升趋势,且高于对照,在接菌48~60 h时酶活力达到最大,然后酶活力开始下降,至84 h时均显著低于对照。可见,玫烟色棒束孢的侵染严重影响了烟粉虱正常的生理活动。     

玫烟色棒束孢对小菜蛾的致病力

在室内条件下,测定了玫烟色棒束孢对小菜蛾的生物活性,结果表明:玫烟色棒束孢对小菜蛾具有较强的致病力,当孢子浓度较高时(>1×107个孢子/mL),小菜蛾第2天便出现死亡高峰,第3天左右试虫基本全部死亡。此外,孢子浓度和温度越高,玫烟色棒束孢的毒力越强,对小菜蛾2龄幼虫的毒力大于3龄幼虫,这说明玫烟色棒束孢具有防治小菜蛾的潜力。     

玫烟色棒束孢急性毒性及致敏实验观察

按照《农药登记毒理学试验方法》（GB15670—1995）对玫烟色棒束孢菌粉进行急性经口、经皮、吸入毒性试验,眼刺激试验和致敏（皮肤变态反应）试验。结果表明,该受试物对雌雄大鼠急性经口LD50〉5000mg·kg-1;急性经皮I,D50（4h）〉2000mg·kg;雌雄大鼠急性经皮I．C50（2h）〉2000mg·m-1;对试验兔眼平均刺激指数为0;试验兔皮肤斑贴部位未出现红斑、水肿,致敏率为0％。因此,玫烟色棒束孢的急性经口毒性为微毒性,急性经皮及急性吸入毒性均属低毒性,对实验兔皮肤及眼无刺激性;致敏实验属I级弱致敏物。     

玫烟色棒束孢IF-1106菌株对烟粉虱的致病力

在室内条件下,测定了玫烟色棒束孢IF-1106菌株对烟粉虱的致病力。结果表明,玫烟色棒束孢孢子悬浮液可侵染烟粉虱的各个虫态,其中,烟粉虱2龄若虫对玫烟色棒束孢最敏感,处理7 d后烟粉虱的累计校正死亡率达83.05%;不同浓度(1.0×107,5.0×106,1.0×106,5.0×105,1.0×105个孢子/mL)的玫烟色棒束孢孢子悬浮液处理烟粉虱2龄若虫后,随着浓度的增加,烟粉虱的死亡率从60.60%增加到83.05%,致死中时LT50值从5.86 d减小到4.47 d;随着处理时间的延长,致死中浓度LC50值减小,第7天的LC50值为2.61×104个孢子/mL。玫烟色棒束孢IF-1106菌株可作为防治烟粉虱的潜力菌株。     

玫烟色棒束孢IfB01菌株原生质体制备与转化条件研究

为了提高虫生真菌玫烟色棒束孢If B01原生质体的产量和转化效率,进而为该菌株的基因工程和细胞工程改良奠定基础,本文研究了不同细胞壁降解酶配比、渗透压稳定剂、酶解温度、时间、p H值和转速等对玫烟色棒束孢If B01原生质体制备以及不同聚乙二醇4000(PEG4000)浓度对原生质体转化的影响。结果显示,培养30 h的菌丝用1%蜗牛酶+2%纤维素酶配比、以0.7 mol/L的Na Cl溶液(p H6.0)为渗透压稳定剂,30℃、100 r/min酶解8 h,获得的原生质体产量最高,达6.72×106个/m L;此原生质体在40%的PEG4000作用下可获得最高的转化效率,达7.05%。研究表明酶液、酶解温度、时间、p H值、渗透压、稳定剂、转速和PEG4000的浓度等因素对原生质体的制备和转化有较大影响。     

环境因子对玫烟色棒束孢IF-1106菌株孢子萌发的影响

为了了解环境因子对玫烟色棒束孢分生孢子萌发的影响,采用凹玻片悬滴等方法研究了温度、湿度、光周期、初始pH值、紫外照射、高温胁迫及吐温-80浓度对玫烟色棒束孢IF-1106菌株孢子萌发的影响。结果表明:玫烟色棒束孢孢子萌发的最适温度为26℃左右,适温为23~32℃,玫烟色棒束孢分生孢子萌发对湿度的要求较高,低于85%分生孢子不萌发。黑暗促进孢子萌发,光照抑制孢子萌发,但光暗交替时,随着光照时间的延长,孢子萌发率升高。孢子萌发最适pH值为5~7,用0.05%~1%的吐温-80配制孢子悬浮液。经过48℃高温和紫外线照射处理后,玫烟色棒束孢孢子的萌发都受到很大程度的抑制。因此玫烟色棒束孢IF-1106菌株分生孢子萌发最适条件为温度26℃,相对湿度95%以上,初始pH值为6,全黑暗培养。     

玫烟色棒束孢的遗传地理差异及对B型烟粉虱的致病性

【目的】研究不同地区玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea的遗传地理差异,探讨其对B型烟粉虱Bemisia tabaci的致病性。【方法】从广东、福建和青海地区土壤分离得到16株玫烟色棒束孢菌株用生物信息学的方法分析供试菌株ITS序列的相似性,并构建系统发育树;采用浸渍法测定供试菌株分生孢子对B型烟粉虱2龄若虫的生物活性。【结果】供试菌株与参考菌株(KX057373.1、KX057375.1)ITS序列的相似性高于97.7%;9株广东菌株与6株福建菌株的ITS序列没有地理差异;青海菌株If TS01与参考菌株KX057375.1的ITS序列几乎相同,且与福建菌株If FJ02、If FJ06及广东菌株If GD17的ITS序列高度相似。16株菌株均以孢子剂量10~7 mL~(-1)处理B型烟粉虱2龄若虫,处理后第10天若虫的病死率为47%~86%;其中,菌株If FJ06、If GD02和If TS01处理后的B型烟粉虱2龄若虫病死率达80%以上。【结论】不同地区的玫烟色棒束孢菌株ITS序列没有明显的地理差异,其对烟粉虱的致病力与ITS序列及地理分布没有关系。研究发现3株对烟粉虱致病力较高的菌株,具有进一步研究价值。     

茶卷叶蛾寄生真菌球孢白僵菌几丁质酶基因的克隆与序列分析

球孢白僵菌是最重要的虫生真菌之一,在农林害虫生防中发挥着重要的作用。本研究从茶卷叶蛾球孢白僵菌JYBb201-11菌株中克隆了几丁质酶Bbchit1基因(GenBank登录号:HQ435871)。根据GenBank上昆虫病原真菌几丁质酶基因序列同源性设计引物,分别进行DNA-PCR和总RNA-RT-PCR反应,对得到的目的片段,回收纯化后通过PMD18-T载体转化到大肠杆菌DH5α中,获得几丁质酶基因序列的重组质粒PMD18-chit,并测序。结果表明,DNA-PCR和总RNA-RT-PCR获得的基因序列完全一样,都是一个完整ORF序列,含1 047bp核酸序列,编码348个氨基酸,信号肽长度为22个氨基酸,成熟蛋白理论分子量约为36.78kD,理论等电点为5.95。该蛋白序列中包含2个保守区域,即底物结合区域(SIGG)和几丁质的活性位点(DGIDIDIE),该蛋白可归为几丁质酶18族V类。氨基酸序列同源性分析表明,球孢白僵菌JYBb201-11菌株几丁质酶与球孢白僵菌Bb0062菌株(AAN41259)和NCIM1216菌株(ACF32998)几丁质酶chit1氨基酸序列同源性都达99.43%;与球孢白僵菌MTCC 2028菌株(ACZ28129)几丁质酶chit1氨基酸序列同源性达98.28%。     

玫烟色棒束孢对烟粉虱致病的时间-剂量-死亡率模型分析

为了寻找烟粉虱生物防治的新途径,用浸叶法测定了生防菌玫烟色棒束孢IF-1106菌株对烟粉虱各虫态的致病力。结果表明,接种该菌株孢子悬浮液后烟粉虱各虫态均可被感染而发病死亡。在供试浓度(1.0×107、5.0×106、1.0×106、5.0×105、1.0×105cfu/m L)处理下,烟粉虱各虫态的累计校正死亡率均随着孢子悬浮液浓度的增加和时间的延长而升高。2龄若虫的累计校正死亡率最高,在浓度为1.0×107cfu/m L的孢子悬浮液处理7 d后达到83.05%。运用时间-剂量-死亡率模型对生物测定数据进行拟合,并估计了该菌株对烟粉虱的致死剂量与致死时间。随着接种天数的增加,烟粉虱各虫态的致死中浓度(LD50)和死亡率为90%所对应的浓度(LD90)降低,生防菌的剂量效应逐渐增强,2龄若虫在接种后7 d的LD50对数剂量估计值为4.37。生防菌的致死时间与剂量呈负相关,在1.0×105~1.0×107cfu/m L内随生防菌浓度的增加2龄若虫的致死中时(LT50)由5.66 d降到4.47 d。玫烟色棒束孢IF-1106菌株对烟粉虱2龄若虫有较高的致病效果,是烟粉虱生物防治的潜力菌株。     

百日草几丁质酶基因片段克隆及其序列分析

[目的]克隆百日草几丁质酶的基因片段,并对其序列进行分析.[方法]以百日草“梦境”系列为材料,提取其叶片总RNA,并根据其他植物几丁质酶基因保守序列设计简并引物,通过RT-PCR克隆百日草几丁质酶基因片段（ZEchi）,并对该基因序列进行分析.[结果]克隆得到的片段长度为227 bp,共编码75个氨基酸残基;核苷酸同源性分析表明,ZEchi与已报道的其他植物几丁质酶基因同源性达70％以上,其中与葡萄的同源性最高,为74％;氨基酸同源性分析表明,该几丁质酶多肽属于18家族几丁质酶,且与已报道的其他植物几丁质酶氨基酸序列具有70％以上的相似性;氨基酸聚类分析表明,该几丁质酶多肽与白车轴草和蒺藜苜蓿的几丁质酶聚类;生物信息学分析表明,由该基因片段编码的多肽为非跨膜蛋白,主要含α螺旋和随机线圈螺旋等二级结构.[结论]该研究为进一步研究几丁质酶基因的功能奠定了基础.     

米曲霉磷酸果糖激酶基因克隆及序列分析

磷酸果糖激酶(PFK)是糖酵解途径的重要调控酶。以酿酒米曲霉CICC2012为材料,克隆获得PFK基因pfkA(GenBank登录号:KC113503.1)。序列分析表明:pfkA序列长度为2 722bp,含有2个内含子,开放阅读框长2 358bp;PFK为785个氨基酸组成的亲水蛋白,分子量86.0kDa,等电点6.38,含有2个PFK家族指纹结构;二级结构包含42.68%的α-螺旋,14.27%的β-折叠和43.06%的无规则卷曲;同源建模三级结构PFK含有N端和C端的2个结构域,底物果糖-6-磷酸结合于N端结构域。采用进化树分析,发现米曲霉PFK与丝状真菌PFK亲缘性较近。     

柑橘类植物GPAT基因片段克隆和SNP分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶基因是与植物抗冷性强弱密切相关的基因。根据已报道的各种植物GPAT基因的氨基酸序列上前后两个保守区设计1对简并引物,采用RT-PCR技术,分别从琯溪蜜柚、马家柚、莽山野橘等8种柑橘类植物中克隆得到315bp的GPAT基因片段。使用DNA Star5.0软件对8个片段序列进行同源性比较,8个片段的核苷酸同源性高达97.8%,与其它植物GPAT基因核苷酸序列的同源性都在72.5%以上;经过氨基酸序列推导,每个GPAT基因片段分别编码105个氨基酸,8个片段的氨基酸同源性为95.2%,与其它植物GPAT基因的氨基酸序列同源性在68.9%以上。试验克隆所得8种柑橘类植物GPAT基因片段序列存在明显的单核苷酸变异,在14个核苷酸位点存在SNPs(single nucleotide polymorphisms),导致6个氨基酸位点发生变异,多态性频率为1SNP/22.5bp,核苷酸变异度为4.45%,氨基酸变异度为5.71%。采用NJ聚类法对克隆片段的核苷酸序列进行了遗传多样性分析。     

三七Y病毒部分ci基因和cp基因的克隆及序列分析

对云南文山地区三七上获得的三七Y病毒(Panax virus Y,PnVY)不同分离物进行了部分ci基因和cp基因的克隆及序列分析,获得的部分ci基因长657 nt,编码219个氨基酸;获得的部分cp基因长834 nt,编码278个氨基酸。所获得的11个PnVY分离物的ci基因之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为80.8%~99.8%和91.3%~100%,与其他PnVY分离物的同源性分别为80.8%~98.8%和92.7%~99.5%。所获得的18个PnVY分离物的cp基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为91.8%~99.9%和93.9%~100%,与其他PnVY分离物的同源性分别为92.0%~100%和95.7%~100%。系统进化树分析表明,基于ci基因可以将PnVY分为2个大组,第Ⅱ组分离物之间的差异相比第Ⅰ组的复杂;基于cp基因可以将PnVY分为3个大组,第Ⅲ组分离物之间差异最大。基于ci基因和cp基因的分析结果均表明,PnVY不同种群间存在较为丰富的遗传多样性,但尚不清楚PnVY的分子变异是否与PnVY引起的多种症状类型有关。     

枯草芽孢杆菌HAS中几丁质酶基因的克隆分析

为揭示枯草芽孢杆菌菌株HAS对甘蔗黑穗病菌抑制作用的机理,选取对多种病原真菌有抑制作用的几丁质酶进行克隆与分析。结果表明:菌株HAS基因组中含有1个ORF全长834bp的几丁质酶编码序列,其具有编码278个氨基酸的几丁质酶蛋白,该序列同GenBank上登录的几丁质酶蛋白(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168)(ref|NP_390566.1)的同源性最高,达98%。推测该几丁质酶在菌株HAS抑制甘蔗黑穗病菌过程中可能起关键作用。     

猪Tetherin基因的克隆及序列分析

为研究猪Tetherin基因的功能,应用RT-PCR手段从感染猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的猪肺脏组织扩增得到猪源Tetherin基因,将其克隆到p MD19-T载体并进行测序,采用分子生物学软件将其编码的蛋白质序列与其他来源的Tetherin蛋白序列进行比对分析,采用真核转染的方法研究其在MARC-145细胞中的定位情况。结果显示,克隆得到的猪源Tetherin基因全长534 bp;猪源Tetherin蛋白与牛、绵羊、猫、人、黑猩猩、猫头鹰、猕猴Tetherin蛋白同源性分别为41.5%、44.1%、42.3%、43.7%、45.4%、35.6%、42.1%;猪源Tetherin蛋白为跨膜蛋白,该蛋白定位在MARC-145细胞的细胞膜中。